Th17 Inflamación Modelo de candidiasis orofaríngea en ratones inmunodeficientes

Summary

Aunque los modelos de infección por Candida están disponibles para estudiar la resistencia inmune del huésped, no existe un modelo para estudiar la inmunopatología mediada por células T en el contexto de la infección por Candida. En este trabajo describimos un método para establecer la inmunopatología Th17 asociada a la infección oral por Candida en ratones inmunodeficientes.

Abstract

La enfermedad de candidiasis orofaríngea (OPC) se debe no solo a la falta de resistencia inmunitaria del huésped, sino también a la ausencia de una regulación adecuada de la inmunopatología inducida por la infección. Aunque las células Th17 están implicadas en la defensa antifúngica, su papel en la inmunopatología no está claro. Este estudio presenta un método para establecer la inmunopatología oral Th17 asociada a la infección oral por cándida en ratones inmunodeficientes. El método se basa en la reconstitución de ratones linfopenicos con células Th17 cultivadas in vitro, seguidas de una infección oral por Candida albicans (C. albicans). Los resultados muestran que las células Th17 sin restricciones provocan inflamación y patología, y se asocian con varias lecturas medibles, como la pérdida de peso, la producción de citocinas proinflamatorias, la histopatología de la lengua y la mortalidad, lo que demuestra que este modelo puede ser valioso en el estudio de la inmunopatología de OPC. La transferencia adoptiva de células reguladoras (T_regs) controla y reduce la respuesta inflamatoria, lo que demuestra que este modelo puede utilizarse para probar nuevas estrategias para contrarrestar la inflamación oral. Este modelo también puede ser aplicable en el estudio de la inmunopatología oral Th17 en general en el contexto de otras enfermedades orales.

Introduction

Las infecciones orales y la inflamación se han relacionado con el cáncer y las enfermedades cardiovasculares, y tienen un impacto dramático en la salud humana en general^2,3. Las infecciones oportunistas y la inflamación causada por C. albicans se asocian a inmunodeficiencias primarias (EIP)^4,5, trastornos inflamatorios como periodontitis ^6,7, síndrome de Sjögren y enfermedad de las glándulas salivales^8,9, así como carcinoma oral de células escamosas ^10-12. C. albicans es un hongo comensal dimórfico que coloniza asintomáticamente la boca del 60% de los humanos sanos, sin embargo, es el patógeno fú....

Protocol

NOTA: Los experimentos con ratones se realizaron de acuerdo con el comité de bienestar de los animales institucional (IACUC) directrices.

1. Reconstitución de la RAG-1 ^{- / -} ratones con células I n Vitro Cultivadas Th17 (Tres días antes de la infección)

1. Para el establecimiento de las células Th17, cultura CD4 + CD25 CD44low CD62Lhigh células T naïve (3 x 104) en placas de 96 pocillos de fondo en U solo, o co-cultivo ellos junto con 3 x 104 células CD4 + CD25 + Foxp3 + Treg en presencia de solubles α-CD3 (1 mg / ml), α-CD28 (2 g / ml) anticuerpos y células presentadoras de antígeno, en condiciones Th17 (polar....

Results

En este modelo, tanto los ratones infectados con Candida y ratones no infectados en RAG-1 ^{- / -} de fondo inmunodeficiente se transfirieron de forma adoptiva con células Th17 3-5 días antes de la infección. Un total de 10-12 ratones fueron utilizados para los experimentos, con 2 ratones en cada Sham infectados grupos y 4-5 en cada uno de los grupos infectados Candida. Naive células se obtuvieron a partir Thy1.1 o CD45.1 congenic ratones, de modo que las células Th17 inyectados fueron rastread.......

Discussion

Este modelo se basa en la inducción de C. Oral infección albicans inflamación dependiente Th17. Debido a la ausencia de T _regs, la inflamación de células Th17 inducida es desenfrenada y conduce a la inmunopatología mal resuelto. In vitro derivan las células CD4 naive polarizados ya que se utilizaron células Th17 para la transferencia adoptiva. 40 - 50% de las células CD4 + cultivadas muestran detectable la expresión de IL-17A alrededor de 3 días (células Th17), y por lo tanto se uti.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CAF-2	Universidad de Pittsburgh (Sarah Gaffen)	-	Cultivo de cándida
en U placas de 96 pocillos	Fisher	055588	Se utiliza para el cultivo
celular a-CD3	eBiosciences	16-0031-85	La polarización de las células a las condiciones Th17
a-CD28	eBiosciences	16-0281-85	Polarización de las células a las condiciones Th17
m-IL-6	Bio Basic	RC232	Polarización de las células a las condiciones Th17
h-TGF-b	R& D	240-B	Polarización de las células a las condiciones Th17
a-IFN-g	eBiosciences	16-7311-85	La polarización de las células a las condiciones Th17
a-IL-4	eBiosciences	16-7041-85	Polarización de las células a las condiciones Th17
α-IL17A ef660	eBiosciences	50-7177-82	Utilizado para el cultivo celular - 1:50
α-TNFa-PE-Cy7	eBiosciences	25-7423-41	Utilizado para el cultivo celular - 1:100
α-RORgt PE	eBiosciences	12-6981-82	Utilizado para cultivo celular - 1:50
YNB sin aminoácidos)/Peptona/Medio de caldo de dextrosa	Bio Básico	S507. TAMAÑO	Mediium para el crecimiento de cándida
Incubadora Shaker	New Brunswick Scientific	Innova 4300	Incubación de crecimiento para cándida
Tubos de 15 ml	Bio Basic	BT888-SY	Se utiliza para el cultivo celular y el crecimiento de cándida
Tubos de 50 ml	Bio Basic	CT 788-YS	Se utiliza para el cultivo celular y el crecimiento de cándida
Centrífuga de mesa	VWR International LLC	82017-654	Para peletización de cándida -900 g
Centrífuga	AllegraBeckman Coulter	392302	Cultivo celular - 480 g
Tubos Eppendorf de 1,5 ml	Basic	BT620-NS	Preparación de la concentración final de cándida
2x paraformaldehído	Electrónica Microscopy Sciences	15710	Fijación de cándida para el recuento
Hemocitómetro	VWR International LLC	15170-172	Recuento
de células PBS - Solución salina tamponada con fosfato	Bio Basic	PD8117	Preparación de tampones
Ketamina/xilacina	Case Western Reserve University - Centro de Recursos para	Animales-Obtenido	del protocolo aprobado por ARC para anestesia
Pomada lubricante oftálmica	Allergan-Ungüento		oftálmico para animales para prevenir la sequedad
Solución salina (0,9% NaCl)	G Biosciences	786-561	Administrado a animales para prevenir la deshidratación
Bola de algodón de 3 mm de diámetro	VWR International LLC	BP7603	Bolas de 3 mm para la infección por cándida
Almohadillas de gel térmico	Case Western Reserve University - Animal Resource	Center-para	mantener la temperatura corporal y una recuperación rápida
Tinción de hematoxilina y eosina	Histoserv - MD-Histología		tisular
10% formalina	Ciencias de la Microscopía Electrónica	JC1111/MC	Histología tisular
70% etanol	VWR International LLC	97064-490 Propósito de	esterilización
PMA - Forbol 12-miristato 13-acetato	Sigma-Aldrich	P1585-1MG	Reestimulación de células
Ionomicina	Life Technologies	124222 1mg	Reestimulación de células Kit de
permeabilización	eBiosciences	E16913-106	Células de fijación para citometría de flujo
Jeringas de tuberculina	BD Biosciences	309659	Ratones inyectable
25 G x 3/8 agujas	BD Biosciences	309626	Ratones inyectable
Rag1 -/- ratones	Jackson laboratories	Nº de inventario: 002216	Ratones receptores
CD45.1 ratones congénitos Jackson		laboratories Nº de inventario:002014	Células Th17 del donante
Ratones CB17-SCID Laboratorios	Jackson	Nº de inventario: 001303	Ratones receptores Ratones
Balb/c	Laboratorios Jackson	Nº de inventario: 000651	Células Th17 donantes