אנו מתארים פרוטוקול לבידוד יעיל של תאי T תושבי עור מביופסיות עור אנושיות. פרוטוקול זה מניב מספר מספיק של לימפוציטים תושבי עור אנושי ברי קיימא לניתוח זרימה ציטומטרית ותרבית ex vivo.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
יש עור אדם תפקיד מחסום חשוב ומכיל תאים חיסוניים שונים שתורמים הומאוסטזיס רקמות והגנה מפני פתוגנים. כפי שהעור הוא יחסית קל לגשת, הוא מספק פלטפורמה אידיאלית ללמוד מנגנוני ויסות היקפיים חיסוניים. תאי תושב חיסון immunosurveillance התנהגות עור הבריא, אלא גם לשחק תפקיד חשוב בהתפתחות של מחלות עור דלקתיות, כגון פסוריאזיס. למרות תובנות מתעוררים, הבנתנו את הביולוגיה שבבסיס מחלות עור שונות דלקתי עדיין מוגבלת. יש צורך באיכות טובה (יחיד) אוכלוסיות תאים שבודדו דגימות עור ביופסיה. עד כה, נהלי בידוד כבר הקשו ברצינות על ידי חוסר קבלת מספר מספיק של תאי קיימא. בידוד לניתוח שלאחר מכן גם הושפעו אובדן סמני שושלת תא חיסון, בשל הלחץ המכאני וכימיות נגרם על ידי נהלי דיסוציאציה הנוכחיים להשיגהשעית תא בודדת. כאן, אנו מתארים שיטה שונה כדי לבודד תאי T משני בריא מעורב עור אנושי פסוריאטית ידי שילוב דיסוציאציה עור מכאני באמצעות Dissociator רקמות אוטומטי וטיפול collagenase. מתודולוגיה זו שומרת ביטוי של סמני שושלת החיסוניים ביותר כגון CD4, CD8, Foxp3 ו CD11c רק בעת הכנה של השעיות תא בודדות. דוגמאות של בידוד תא מוצלח CD4 + T ו פנוטיפי עתידי אנליזה פונקציונלית מוצגות.
מבוא
העור, כממשק העיקרי בין הגוף לסביבה, מספקת את קו ההגנה הראשון נגד פיזי חיצוני, כימיים ועלבונות ביולוגיים כגון פציעה, קרינה אולטרה סגולה ו מיקרואורגניזמים. העור מורכב משני תאים העיקרי, האפידרמיס הדרמיס, ומכיל מגוון של תאי מערכת החיסון כולל תאי לנגרהנס, מקרופאגים, תאים דנדריטים (DCS), וכ -20 מיליארד תאי זיכרון T, כמעט פי שניים בהווה מספר בהיקף הדם כולו 1 , 2. גוף גדל והולך של נתונים תומך ברעיון כי העור יש פונקציות חיסוניות חיוניות, הן במהלך הומאוסטזיס רקמות במצבים פתולוגיים שונים. תאים חיסוניים תושב בעור רגיל נחשבים לנהל immunosurveillance 3 הוכחו לשחק תפקיד בהתפתחות של מחלות דלקתיות כגון פסוריאזיס 4.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: עור ביופסיות מיחידים בריאים התקבלו שאריות עור בטן של אנשים שעברו ניתוחים פלסטיים אלקטיבי לאחר הסכמה מדעת בעל פה או בכתב לשימוש מדעי. שימוש עור אנושי אושרה ובהתאם לתקנות שקבעו הוועדות האתיות הרפואיות למחקר האדם של המרכז הרפואי האוניברסיטאי Radboud, ניימיכן, הולנד אונ' אסן, גרמניה.
1. הכנת תרחיפים תא יחיד מעור אדם (עבודה סטרילית בתוך ארון-Flow אם תרבית תאים לאחר נדרש)
- הכן בינוני תרבית תאים: RPMI 1640 + פניצילין / סטרפטומיצין (ריכוזים הסופי 100 יחידות / מ"ל ו 10....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הפרוטוקול המובא כאן יניב בין 2,200 ± 615 (ממוצע ± SEM, עור של מתנדבים בריאים) עד 178,000 ± 760 (ממוצע ± SEM, עור lesional של חולי פסוריאזיס) לימפוציטים קיימא מעור אדם בעת שימוש ביופסיה של עור יחידה 4 מ"מ.
סוגים שונים של CD45 + תאים אותרו תא בודד השעיות נגזר העור של אנשים בריאים כולל CD4 + T-תאים (~ 45%), CD8 + T תאים (~ 30%), ו CD11c + DCS (~ 5% ), בעוד כמה B תאים .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבודד תאי T תושב העור ביעילות ביופסיות עור האדם. היתרון של פרוטוקול זה הוא הבידוד של מספרים גבוהים יחסית של לימפוציטים קיימא, מבקש להביע סמני משטח רלוונטיים. תת תא מזוהה היו: CD11c + DCS, CD4 + ו- CD8 + T תאים Foxp3 + CD25 + תאים. חשוב לציין, לשעבר vivo התרבות של תאים מבודד עור תושב T הייתה טוב מאוד ריאלית ואפשר אנליזה פונקציונלית שלאחר מכן.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
ביופסיות עור מחולים פסוריאזיס נמסרו באדיבות על ידי ד"ר אנדראס Koerber (המחלקה לדרמטולוגיה באוניברסיטת אסן, גרמניה) לאחר הסכמה מדעת בעל פה או בכתב לשימוש מדעי.
XH נתמכת גם על ידי NSFC 61263039 ו NSFC 11,101,321.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ביופסיה חד פעמית פונץ' | Kai Europe | BP-40F | 4 מ"מ |
| אזמל סטרילי חד פעמי | Dalhausen | 1100000510 | |
| צינור עדין MACS C | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | מכסה כחול, המשמש כצינור הדיסוציאציה. |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | דיסוציאטור רקמות אוטומטי. שימוש ב"spleen_01 התוכנית" לדיסוציאציה של ביופסיית העור. |
| מסננת סלולרית | BD | 352350 | 70 ומיקרו; m ניילון |
| 96 בארות צלחת U תחתונה | גריינר ביו-וואן | 650180 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 22409-015 | |
| נתרן פירובט | טכנולוגיות חיים | 11360-039 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| פניצילין/סטרפטומיצין | טכנולוגיות חיים | 15140-122 | |
| אנושי סרום מאגר (HPS) | מוכן | ||
| קולגנאז I | Sigma-Aldrich | C2674 | סוג 1-A, מתאים לתרבית תאים |
| DNase I | Calbiochem | 260913 | |
| PBS | B Braun | 3623140 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A4503-500G | |
| צבע כדאיות קבוע (FVD) APC-eFluo780 | eBioscience | 65-0865-18 | צביעת תאים מתים לפני קיבוע התאים; לדלל עם PBS ב-1:1,000 |
| תרכיז קיבוע/פרמיביליזציה | eBioscience | 00-5123-43 | |
| קיבוע/פרמיביליזציה מדלל | eBioscience | 00-5223-56 | |
| מאגר פרמיביליזציה (10x) | eBioscience | 00-8333-56 | |
| BV421 עכבר אנטי-אנושי CD45 | BD | 563879 | שיבוטHI30;: מקדם דילול 1:50 |
| FITC עכבר אנטי אנושי CD14 | Dako | T0844 | שיבוט: TUK4; גורם דילול 1:50 |
| PE עכבר אנטי אנושי CD56 | Dako | R7127 | שיבוט: MOC-1; גורם דילול 1:50 |
| עכבר ECD אנטי אנושי CD3 | Beckman - Coulter | A07748 | שיבוט: UCHT1; גורם דילול 1:50 לצביעה על פני השטח; גורם דילול 1:25 לצביעה תוך תאית. |
| PC5.5 עכבר אנטי אנושי CD4 | בקמן - קולטר | B16491 | שיבוט: 13B8.2; גורם דילול 1:200 |
| PeCy7 עכבר אנטי אנושי CD11c | בקמן - קולטר | A80249 | שיבוט: BU15; גורם דילול 1:50 |
| APC עכבר אנטי אנושי CD1c | Miltenyi Biotech | 130-090-903 | שיבוט: AD5-8E7; גורם דילול 1:10 |
| APC-AlexFluo700 עכבר אנטי אנושי CD8 | בקמן - קולטר | A66332 | שיבוט: B9.11; גורם דילול 1:400 |
| APC-AlexFluo750 עכבר אנטי-אנושי CD19 | בקמן - קולטר | A94681 | שיבוט: J3-119; גורם דילול 1:50 |
| PeCy7 עכבר אנטי-אנושי CD25 | eBioscience | AD5-8E7 | שיבוט: BC96; גורם דילול 1:50 |
| CLA עכברוש אנטי אנושי | Miltenyi Biotech | 130-091-635 | שיבוט: HECA-452; גורם דילול 1: |
| eFluo450 חולדה אנטי אנושי Foxp3 | eBIoscience | 48-4776-42 | שיבוט: PCH101; צביעה תוך-תאית; גורם דילול 1:50 |
| AlexFluo488 עכבר אנטי אנושי IL-17A | eBioscience | 53-7179-42 | שיבוט: eBio64DEC17; צביעה תוך-תאית; גורם דילול 1:50 |
| PeCy7 עכבר אנטי-אנושי IFNg | eBioscience | 25-7319-41 | שיבוט: 4S. ב3; מכתים תוך תאיים; גורם דילול 1:400 |
| פלואורוספירות ספירת זרימה | בקמן - קולטר | 7547053 | חרוזי ספירה, לזרימה ציטומטרית |
מקורות
- Clark, R. A., et al. The vast majority of CLA+ T cells are resident in normal skin. J Immunol. 176, 4431-4439 (2006).
- Zaba, L. C., Fuentes-Duculan, J., Steinman, R. M., Krueger, J. G., Lowes, M. A. Normal human dermis contains ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
