ヒトの皮膚生検から皮膚常在T細胞を効率的に分離するためのプロトコルを記述します。このプロトコルは、フローサイトメトリー分析およびex vivo培養に十分な数の生存可能なヒト皮膚常在リンパ球をもたらします。
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この記事について
サマリー
要約
人間の皮膚は重要なバリア機能を有しており、病原体からの組織の恒常性と保護に貢献様々な免疫細胞が含まれています。肌がアクセスすることは比較的容易であるように、それは末梢免疫制御メカニズムを研究するための理想的なプラットフォームを提供します。免疫常駐健康な皮膚行動免疫監視中の細胞だけでなく、乾癬のような炎症性皮膚疾患の発達において重要な役割を果たしています。新興洞察力にもかかわらず、様々な炎症性皮膚疾患の根底にある生物学の我々の理解はまだ限られています。生検皮膚試料から単離された良質な（単一）細胞集団が必要です。これまでに、単離手順は、深刻な生存細胞の十分な数を得ることの欠如によって妨げられてきました。単離およびその後の分析にも得ることが、現在の解離手順によって引き起こされる機械的及び化学的ストレスに起因する免疫細胞系統マーカーの損失の影響を受けています単一細胞懸濁液。ここでは、自動化された組織の解離及びコラゲナーゼ処理を用いた機械的皮膚解離を組み合わせることにより、健康と関係する両方の乾癬のヒト皮膚からT細胞を単離するために修正された方法を記載します。この方法は、単一細胞懸濁液を調製する際に、このようなCD4、CD8、Foxp3をおよびCD11cなど、ほとんどの免疫系統マーカーの発現を保持します。成功したCD4 + T細胞の単離およびその後の表現型および機能的分析の例が示されています。
概要
皮膚は、身体と環境との間の主要なインタフェースとして、外部からの物理的、化学的、およびそのような創傷、紫外線や微生物などの生物学的傷害に対する防御の最初の行を提供します。皮膚は、主に2つのコンパートメント、表皮と真皮を含み、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、樹状細胞（DC）、および約200億メモリーT細胞を含む免疫細胞の様々な含まれ、全体の血液量1、ほぼ2倍の数の本、2。データの成長体は、皮膚が組織の恒常性の間、および様々な病理学的状態の両方で、本質的な免疫学的機能を持っているという概念をサポートしています。正常な皮膚内に存在する免疫細胞を、免疫学的監視3を実施するために考えられ、例えば、乾癬4のような炎症性疾患の発症において役割を果たすことが示されています。乾癬病変皮膚では、CD4 +およびCD8 +の両方のT細胞がOBSた浸潤しましたervedそれはCD4とCD8の比率は、疾患状態5に応じて変化することが示されました。しかし、細胞のこの集団は、既存の技術は、ほんのわずかの細胞の単離を可能にするため、研究するのが困難です。
ヒトの皮膚からのT細胞の単離のために現在広く用いられている技術は、酵素処理と機械的に皮膚解離を兼ね備えています。ヒトの皮膚生検は、広範囲に刻み、トリプシン、コラゲナーゼおよび/ またはEDTA <....
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プロトコル
注：健康な個体からの皮膚生検は、科学的な使用のための口頭または書面によるインフォームドコンセントの後に選択科目整形手術を受けている個体の腹部の皮膚の残りから得ました。人間の皮膚の使用が承認されたラートボウト大学医療センター、ナイメーヘン、オランダ、エッセン、ドイツの大学の人間の研究のための医学倫理委員会によって設定された規則に従ってインチ
ヒト皮膚からの単一細胞懸濁液の調製（フローキャビネット内の作業滅菌後、細胞培養物がある場合は必須）
- 細胞培養培地を準備していない血清を含むRPMI 1640 +ペニシリン/ストレプトマイシン（ml最終濃度100単位/および100μg/ mlの、それぞれ）+ピルビン酸（0.02ミリモル）およびグルタマックス（0.02 mM）を、追加されました。
- 完全培地を準備します。ステップ1.1 + 10％のヒトプール血清（HPS）で調製した培地; 4℃で保存します。私たちの前に20℃±2にメディアを持参る。
- 4ミリメートルラウンド生検パンチ装置を用いて皮膚生検を取得し、最大4時間、または4℃でONで20℃±2でRPMI1640完全培地に保管してください。実験室での到着時にできるだけ早く生検を処理します。
注：皮膚の長期保存は、細胞収量および細胞生存率に影響を与えます。 - ブルーキャップされた解離管にラベルを付け、ラベルされたチューブに5ミリリットルを完全培地を追加します。....
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結果
単4ミリメートルの皮膚生検を使用している場合、ここで提示されたプロトコルは、ヒトの皮膚から（±SEM、乾癬患者の病変皮膚を意味する）760±178,000まで（±SEM、健康なボランティアの皮膚を意味する）615±2200の間に実行可能なリンパ球を得られます。
CD45 +細胞の異なる種類はCD4 + T細胞（〜45％）、CD8 + T細胞（約30％）を含む、健康な個体の皮膚に由来する単一細胞懸濁液中で同定、およびCD11c +樹状細胞（約5％でした）、いくつかのB細胞（CD19 +）のに対し、NK細胞（CD56 + CD3 - ）、または単球/マクロファージ（CD14 +またはCD1c +）は、（ 図1A）が観察されました。方法はまた、ヒト皮膚生検におけるCD4 + CD25 +のFoxp3 +<.......
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ディスカッション
ここでは、効率的にヒトの皮膚生検からの皮膚常在T細胞を単離するためのプロトコルを提示します。このプロトコルの利点は、実行可能なリンパ球の比較的高い数の分離であり、関連する表面マーカーを発現します。同定された細胞のサブセットは以下の通りであった：たCD11c + DCは、CD4 +およびCD8 + T細胞とのFoxp3 + CD25 +細胞。重要なのは、孤立した皮膚常在T細胞のex vivoでの文化は非常によく実現可能だったとその後の機能解析を可能にしました。
ヒトの皮膚は、組織の構造的完全性を維持するために機能する細胞外接着タンパク質の酵素分解と機械的に解離を組み合わせることにより、単一細胞懸濁液中に解離させることができます。表皮と真皮のディスパーゼベース層分離は、これらのそれぞれの皮膚層に細胞浸潤を決定するために広く用いられている方法ですが、私たちは、ディスパーゼ処理がトンを主導していることに気づきましたOA CD25およびCD27の細胞表面発現の主要な.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
乾癬患者からの皮膚生検を親切に科学的な使用のための口頭または書面によるインフォームドコンセントの後に博士アンドレアスKoerber（エッセン、ドイツの大学の皮膚科部門）によって提供されました。
XHはまた、NSFC 61263039とNSFC 11101321でサポートされています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 使い捨て可能なBiopsyの穿孔器 | のKaiのヨーロッパ | BP-40F | 4 mm |
| の使い捨て可能な生殖不能のメス | Dalhausen | 1100000510 | |
| gentleMACS Cの管 | Miltenyiの生物技術 | 130-093-237 | 解離の管として使用される青い帽子。 |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | 自動組織解離器。皮膚生検の解離に「プログラムspleen_01」を使用します。 |
| セルストレーナー | BD | 352350 | 70 & マイクロ;m ナイロン |
| 96 ウェル U 底板 | Greiner Bio-One | 650180 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 22409-015 | |
| ピルビン酸ナトリウム | Life Technologies | 11360-039 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| ペニシリン/ストレプトマイシン | Life Technologies | 15140-122 | |
| 人間プール血清 (HPS) | 自社調製 | ||
| コラゲナーゼ I | Sigma-Aldrich | C2674 | Type 1-A, suitable for cell culture |
| DNase I | Calbiochem I Calbiochem | 260913 | |
| PBS | B Braun | 3623140 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A4503-500G | |
| Fixable Viability Dye (FVD) APC-eFluo780 | eBioscience | 65-0865-18 | 細胞固定前に死細胞を染色し、PBSで1:1,000に希釈 |
| 固定/透過濃縮液 | eBioscience | 00-5123-43 | |
| 固定/透過希釈液 | eBioscience | 00-5223-56 | |
| 透過化バッファー (10x) | eBioscience | 00-8333-56 | |
| BV421 マウス抗ヒトCD45 | BD | 563879 | クローン:HI30;希釈係数 1:50 |
| FITC マウス抗ヒト CD14 | Dako | T0844 | クローン:TUK4; 希釈係数 1:50 |
| PE マウス抗ヒト CD56 | Dako | R7127 | クローン: MOC-1; 希釈係数 1:50 |
| ECD マウス抗ヒト CD3 | Beckman - Coulter | A07748 | クローン: UCHT1; 表面染色の場合は希釈係数 1:50、細胞内染色の場合は希釈係数 1:25. |
| PC5.5 マウス抗ヒト CD4 | Beckman - Coulter | B16491 | クローン: 13B8.2; 希釈係数 1:200 |
| PeCy7 マウス抗ヒト CD11c | Beckman - Coulter | A80249 | クローン: BU15; 希釈係数 1:50 |
| APC マウス抗ヒト CD1c | Miltenyi Biotech | 130-090-903 | クローン: AD5-8E7; 希釈係数 1:10 |
| APC-AlexFluo700 マウス抗ヒト CD8 | Beckman - Coulter | A66332 | クローン:B9.11;希釈係数1:400 |
| APC-AlexFluo750 マウス抗ヒトCD19 | Beckman - Coulter | A94681 | クローン:J3-119;希釈係数1:50 |
| PeCy7マウス抗ヒトCD25 | eBioscience | AD5-8E7 | :BC96;希釈係数1:50 |
| PE ラット 抗ヒト CLA | Miltenyi Biotech | 130-091-635 | クローン: HECA-452; 希釈係数 1: |
| eFluo450 ラット 抗ヒト Foxp3 | eBIoscience | 48-4776-42 | クローン: PCH101; 細胞内染色; 希釈係数 1:50 |
| AlexFluo488 マウス抗ヒト IL-17A | eBioscience | 53-7179-42 | クローン: eBio64DEC17; 細胞内染色; 希釈係数 1:50 |
| PeCy7 マウス抗ヒト IFNg | eBioscience | 25-7319-41 | :4S。B3 です。細胞内染色;希釈係数 1:400 |
| フローカウント フルオロスフィア | Beckman - Coulter | 7547053 | カウントビーズ、フローサイトメトリー用 |
参考文献
- Clark, R. A., et al. The vast majority of CLA+ T cells are resident in normal skin. J Immunol. 176, 4431-4439 (2006).
- Zaba, L. C., Fuentes-Duculan, J., Steinman, R. M., Krueger, J. G., Lowes, M. A. Normal human dermis contains ....
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