Summary
Vi har udviklet en in vitro udfoldet hippocampus som bevarer CA1-CA3 vifte af neuroner. Kombineret med gennemtrængende mikroelektrode array, kan neurale aktivitet overvåges i både langsgående og tværgående retninger. Denne metode giver fordele i forhold til hippocampus skive præparater som spredning i hele hippocampus kan registreres samtidigt.
Abstract
Denne protokol beskriver en fremgangsmåde til fremstilling af en ny in vitro flad hippocampus præparat kombineres med en mikro-bearbejdet matrix til kort neurale aktivitet i hippocampus. Den tværgående hippocampale skive forberedelse er den mest almindelige vævspræparat at studere hippocampus elektrofysiologi. En langsgående hippocampus skive blev også udviklet for at undersøge langsgående forbindelser i hippocampus. De intakte musehippocampus kan også holdes in vitro, fordi dens tykkelse giver tilstrækkelig ilt diffusion. Men disse tre præparater ikke giver direkte adgang til neurale formering, da nogle af vævet enten mangler eller er foldet. Udfoldet intakt hippocampus giver både tværgående og langsgående forbindelser i en flad konfiguration for direkte adgang til vævet til at analysere det fulde omfang af signaludbredelse i hippocampus in vitro. For effektivt at overvåge den neurale aktivitet fra than cellelag, en skræddersyet gennemtrængende mikroelektrode array (PMEA) blev fremstillet og anvendt til den udfoldede hippocampus. Den PMEA med 64 elektroder på 200 um i højden kunne optage neurale aktivitet dybt inde i musen hippocampus. Den unikke kombination af en udfoldet hippocampus forberedelse og PMEA giver en ny in vitro-værktøj til at studere hastighed og retning for spredning af neurale aktivitet i den todimensionale CA1-CA3 regioner i hippocampus med et højt signal-støj-forholdet.
Introduction
Forståelse af neurale ledning eller formering af neurale signaler er afgørende for bestemmelse af mekanismen for neurale kommunikation i både den normale funktion og patologiske tilstande i hjernen 1-3. Hippocampus er en af de mest omfattende undersøgt strukturer i hjernen, da det spiller afgørende rolle i flere hjernefunktioner såsom hukommelse, og rumlig sporing og er involveret i flere patologiske ændringer, der dramatisk indflydelse adfærd og 1,6. Selv hippocampus udviser en kompleks organisation, kan de forskellige elementer i strukturen let identificeres og tilgås i skive forberedelse 4-6. I den tværgående retning af hippocampus, er neurale aktivitet vides at udbrede sig gennem tri-synaptisk pathway som omfatter gyrus dentatus (GD), CA3, CA1 andsubiculum 4,5. Det menes, at synaptisk transmission og axonal ledning spiller en stor rolle for communicatipå i denne tværgående kredsløb 4,6. Men udbredelsen af neural signal foregår i både tværgående og langsgående retning 4,6. Dette indebærer, at hippocampus ikke kan undersøges fuldt ud ved hjælp af slice præparater, der begrænser observation til en bestemt retning af formering 4. Den langsgående skive blev udviklet for at undersøge axonale veje langs den langsgående akse 5. Forskere har observeret adfærd-specifikke gamma og theta svingninger hovedsageligt langs den tværgående og langsgående akser henholdsvis 6. Disse adfærdsmønstre er blevet undersøgt separat, men samtidig adgang til begge retninger er afgørende at forstå disse adfærdsmønstre. Selv med udviklingen af det intakte hippocampus forberedelse, er det vanskeligt at overvåge udbredelsen hele væv på grund af den foldede struktur af hippocampus 4. Den udfoldede hippocampus giver adgang til de pakkede neuroneri form af en flad todimensional cellelag 7,8.
Ved udfoldning af gyrus dentatus (GD) (figur 1), hippocampus vedtager en udfladet form med en rektangulær konfiguration, hvor både tværgående og langsgående forbindelser forbliver intakt med det pyramideformede cellelag anbragt i et todimensionalt ark, der indeholder både CA3 og CA1, efterlader et fladt stykke af neuralt væv, der kan anvendes til at undersøge neural formering (figur 2) 8. Neural aktivitet kan derefter overvåges med individuelle glas pipetter, mikroelektrode-arrays, stimulerende elektroder, samt spænding følsomme farvestoffer (VSD) 3,7,8. Desuden kan genetisk kodet spænding indikator fra transgene mus anvendes til at spore formering mønster 9.
Den flade udformning af den udfoldede hippocampus netværk er velegnet til optisk metode optagelse, men også for en mikroelektrode array. Most af de kommercielt tilgængelige arrays er fremstillet med flade eller lavprofil elektroder og kan optage neurale aktivitet i både vævssnit og dyrkede neuroner 10-12. , Signal-til-støj-forhold (SNR) formindskes imidlertid når signalerne opnås fra en intakt væv siden soma af neuroner er placeret dybere ind i vævet. Mikroelektrode elektrode arrays med høje formatforhold er forpligtet til at forbedre SNR.
Til dette formål har en gennemtrængende mikroelektrode array (PMEA) blevet udviklet i vores laboratorium, og giver mulighed for direkte at sondere i vævet ved at indsætte 64 spikes med en diameter på 20 um og højde på 200 um i udfoldede hippocampus 7,13 . Denne mikroelektrode array er højere SNR forhold til spændingen farvestof billedbehandling og SNR forbliver stabil under et eksperiment 7,13. Kombinationen af den udfoldede hippocampale forberedelsen og PMEA tilvejebringer en ny måde at investereIgate neurale formering i et todimensionalt plan. Eksperimenter med denne teknik har allerede givet betydelige resultater om mekanismerne i neurale signaludbredelse i hippocampus, hvorved neurale aktivitet kan udbrede uafhængigt af synaptiske eller elektriske synapser 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Animal forsøgsprotokoller blev gennemgået og godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg på universitetet. CD1 mus af begge køn i alderen P10 til P20 er anvendt i denne undersøgelse.
1. Løsninger til Kirurgi og Eksperimentel optagelse
- Forbered normal kunstig cerebrospinalvæske (aCSF) buffer indeholdende (mM): NaCl 124, KCI 3,75, KH 2 PO4 1.25, MgSO4 2, NaHCO3 26, glukose 10 og CaCl2 2. Brug denne normal aCSF for væv genopretning efter dissektion, samt vaskeanlæg ved begyndelsen af eksperimentet.
- Forbered saccharose aCSF, der bruges under hippocampus dissektion og indeholder (mM): Saccharose 220, KCI 2,95, NaH 2 PO4 1,3, MgSO4 2, NaHCO3 26, glukose 10 og CaCl2 2. For at inducere epileptiform aktivitet i intakte hippocampus forberedelse væv, tilsættes 4-aminopyridin (4-AP) til normal aCSF påkoncentrationen af 100 uM.
2. Kirurgisk Procedure for intakte Hippocampus Forberedelse
- Drop isofluran (1 ml) ind i kammeret i bunden af en ekssikkator glaskrukke (No.1 i specifikke materialer og udstyr) og bruge en almindelig papirserviet for at dække overfladen af den nederste fase, så dyret ikke komme i kontakt med væsken. Derefter placere CD1 mus i krukken, og luk låget. Hold dyret i den lukkede beholder i ca. 1 min til 2 min. Når vejret frekvens er omkring en per sekund, fjernes musen fra krukken.
- Placer musen på operationen scenen og halshugge med et egnet saks. Umiddelbart efter halshugning placere hovedet i iskold (3-4 ° C), oxygeneret saccharose aCSF i ca. 30 sek.
- Brug fine sakse (No.5 i bestemte materialer og udstyr) til at fjerne huden på toppen af kraniet og til at skære kraniet langs midterlinien af hovedet samt på to ender nær tempoetral lap. Brug pincet (# 6 i bestemte materialer og udstyr) til at skrælle snittet kraniet mod hver side af hovedet, for at udsætte hjernen.
- Indsæt en micro lab spatel (nr 8 i bestemte materialer og udstyr) ind i hullet mellem de parietallappen af hjernen og kraniet til forsigtigt hjernen fra bunden af kraniet og så drop det på en forberedt iskold (3 -4 ° C) kirurgiske fase dækket med vådt filtrerpapir (No.2 i bestemte materialer og udstyr). Fjern cerebellum med et is-kølet bladet og adskille de to halvkugler ved at skære midterlinien af hjernen. Derefter placeres de to adskilte halvkugler i et bægerglas fyldt med iskold saccharose aCSF gennemboblet med 95% O2 / 5% CO2.
- Tag den ene halvdel af halvkugle og sted på iskold filtrerpapir fase. Placer regelmæssige papirhåndklæder eller filterpapir omkring hjernen at suge ekstra løsning. Brug to brand-poleret glaspipette værktøjer (# 10 i materialer ogEquipment) at adskille cortex fra resten af den centrale del af hjernen.
- Efter hippocampus er udsat fra indersiden af cortex og lagt på is-kold fase placere to eller tre dråber af iskold saccharose aCSF på vævet og derefter fjerne ekstra opløsning omkring hippocampus. Skær forbindelser med cortex på to ender af hippocampus. Derefter dissekere hippocampus ud af hjernen med ilden poleret glas værktøjer og fjerne den resterende del af hjernen.
- Adskil hele hippocampus med sin Alveus opad og hippocampus sulcus nedad. Hurtigt drop to eller tre dråber af iskold saccharose aCSF på vævet igen og fjerne de ekstra opløsning omkring vævet med et stykke køkkenrulle. Brug en brand poleret glas værktøj til at dreje hele hippocampus at blotlægge sulcus (figur 1B, C).
- Under en normal optisk mikroskop, indsætte en skræddersyet glas nål (nr 11 i Specific MateriALS og udstyr) i den ene ende af sulcus og skære fiberforbindelser, fra gyrus dentatus (GD) til subiculum eller CA1 felt, langs retningen af sulcus (figur 1C). Påfør en iskold kniv til at trimme den septale og tidsmæssige ender af hippocampus evt. Indsæt en skræddersyet metaltråd løkke (No. 12 i bestemte materialer og udstyr) i snittet sulcus og trække over GD væk fra vævet, mens du holder subiculum / CA1 ende af hippocampus ved en brand poleret glas værktøj (figur 1D) .
- Efter udfoldningsproceduren ovenfor tilføje yderligere to eller tre dråber af iskold saccharose aCSF på vævet og fjerne de ekstra opløsning omkring vævet. Derefter trimme den udfoldede hippocampus med iskold blad ved kanterne (figur 1E) og placere fremstillingen af en spatel i udvinding kammer fyldt med normal aCSF og boblet med 95% O 2/5% CO2 ved stuetemperatur (ca. 25 ° C). Efterladudfoldet hippocampus væv at inddrive omkring 1 hr før placere det i optagelsen kammer.
- Tag den anden hjernehalvdel og bruge det til at gå gennem trin 2,5-2,9. Normalt tager omkring 1 til 2 minutter for at afslutte hele proceduren at udfolde en enkelt hippocampus og slip iskold saccharose aCSF kontinuerligt for at holde vævet iltet og hydreret.
3. Eksperimentel systemopsætning
- Lim en brugerdefineret fabrikeret PMEA på en tap grid array (PGA) pakke og anvende mikro wire bonding at forbinde hver pude fra en enkelt mikroelektrode til puden af en tap på pakken (figur 3B). Indsæt derefter pakken i stikket på en specialfremstillet kredsløb 13.
- Individuelt forbinde hver mikroelektrode til sine filtre med band pass afskæringsfrekvens fra 1 Hz til 4 kHz og forstærkere med gevinst på 100 på specialfremstillede kredsløb 13. Digitalisere analoge udgang fra printkortet ved en A / D converting system og erhverve og gemme data på en computer.
- Lim en skræddersyet plast optagelse kammer omkring array med indløb og udløb slange til løsning flow (figur 4A). Brug mindst to flasker til at holde forskellige løsninger i systemet, og deltag og styre output slangen af flaskerne med en tri-ventil. Forbind udgangen af tri-ventilen til en rørsystem med en IV dråbekammer som lede opløsningen i optagelsen kammeret.
- Mellem tri-ventil og indløbet af optagelsen kammeret, tilsættes et elektrisk varmelegeme til at opvarme opløsningen til en kontrolleret temperatur (35 ° C), før opløsningen ledes til optagelse kammeret. Fastgør udløb optagelsen kammeret til et vakuum til opsamling af opløsningen i et vakuumrør tilsluttet kolbe. Må ikke genbruge en løsning i forsøgene i denne undersøgelse.
4. Placering udfoldet Hippocampus på PMEA at registrere de neurale aktivitet
5. Fjernelse afVæv fra PMEA Efter et eksperiment
- Styr vævsankeret af en mikromanipulator og gradvist løfte væv fra optagelsen kammeret. Luk både indløb og udløb at stoppe strømmen i optagelsen kammer. Optagelsen kammer bør være fuld med opløsning eller tilføje et par dråber løsning til at fylde kammeret, hvis optagelsen kammer ikke er fuld.
- Brug en lille pensel til at løfte hvert hjørne af vævet. Hvis vævet ikke flyder i opløsningen, derefter anvende den vakuumrør tørre kammeret omhyggeligt med vævet stadig sidder på arrayet. Derefter forsigtigt åbne indløbet til gradvist at genopfylde kammeret og lukke indløbet til at stoppe strømmen, når optagelsen kammeret er fyldt. Påfør lille pensel til at løfte hvert hjørne af vævet igen.
- Gentag trin 5.2 indtil vævet er løsrevet fra arrayet og flydende i opløsningen. Hvis vævet flyder i opløsningen, og brug derefter vakuumrør at suge vævet væk. Open than flow i indløbet og åbn vakuum i udløbet. Vask systemet med destilleret vand og tørrer det.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De viste i figurerne her data blev registreret i udfoldet hippocampus forberedelse med 4-AP (100 uM) aCSF tilsat under inkubation af vævet i optagelsen kammer ved stuetemperatur (25 ° C). Normalt aktivitet begynder inden for 5 min, men i nogle hippocampus væv fra de ældre dyr kan det tage længere tid. 4-AP-induceret neuronal fyring observeret med PMEA er den samme som tidligere rapporteret 14,15. Da elektroderne have en højde på 200 um, er elektrode tips placeret lige under cellelag (figur 3C), fordi cellelaget er sædvanligvis 250 til 300 um over Alveus af hippocampus (figur 2), optagelser (57 ud af 64 i prøven eksperiment) fra forskellige kanaler har en overvejende positiv afbøjning. Nogle af disse positive optagelser kan imidlertid vise små negative omlægninger samt (figur 5B) Hvis optagelsen elektrodespidserne er tæt nok på cellelag.Hvis elektrodespidserne ligger lige på niveau med cellelag, vil optagelsen har meget skarp negativ spiking med positivt skift på det eller bare negativ spiking (figur 5C) 16. I data prøve vist her, 5 kanaler ud af 57 optagelser har negativ spiking. Efter at erhverve data fra alle de 64 kanaler, er fremgangsmåden individuelle normalisering (figur 6B), der anvendes til at kortlægge neurale formering på en 2-D plan langs tidsaksen for optagelsen 7. Med en kombination af PMEA og udfoldet hippocampus er neural formering kortlagt og observeres hovedsagelig at indlede den ene side af CA3 og flytte langs i en diagonal bølgefront, krydser hele området af hippocampus (figur 6).
Figur 1. Kirurgisk procedure for en udfoldet hippocampus . (A) En af de to hippocampi dissekeres fra temporallappen af en mus hjerne. (B) septumtykkelse og tidsmæssige afslutninger langs længdeaksen. (C) Hippocampus er vendt med en brand poleret glas pipette at eksponere sulcus. Begge ender af hippocampus er trimmet og et glas nål bruges til at skære forbindelserne mellem GD og CA1 eller subiculum langs længdeaksen. (D) Hippocampus udfoldes af en specialfremstillet metaltråd sløjfe. (E) Udfoldet hippocampus med subiculum og GD trimmet. (F) Den endelige udarbejdelse af en udfoldet hippocampus væv. Denne position viser orienteringen af hippocampus, når det er placeret på række i et eksperiment. For yderligere detaljer om den udfoldede hippocampus anatomi henvises til eksperimentelle metoder i tidligere offentliggjorte manuskripter 7.g1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2. Histologi tværsnit af den udfoldede hippocampus. Crystal-violet plet viser positionen af CA1-CA3 pyramideformede cellelag inden for de udfoldede hippocampus et niveau fra 250 til 300 um over Alveus derved lokalisere mikroelektroderne lige under cellelaget (se figur 3C). For at opnå de sektioner farvet med krystalviolet, vævet blev post-fikseret hippocampus var udfoldet. Udfoldet hippocampus blev anbragt i PFA 4% O / N. Derefter blev vævet overført og opbevares i saccharoseopløsning (30%) i 48 timer, efterfulgt af snap-frysning i en biker indeholdende isopentan (2-methylbutan) at køle ned til -35 ° C i tøris. Frosne sektion blev derefter skåret i en kryostat med20 um tykke sektioner i det tværgående plan (som vist i figur 2) for at afsløre placeringen af pyramideformede cellelag. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3. udfoldet hippocampus på PMEA. (A) fra oven af en ny PMEA med mikroelektroderne placeret i slutningen af hver guld metal spor. Insertet på højre side viser en enkelt mikroelektrode under elektronmikroskopi med en højde på 200 um og en diameter på 20 um 7,13. (B) mikroelektrode array limet på en PGA pakke med en plast optagelse kammer omkring mikroelektroder på et glassubstrat. Indsatsen til højre viser en udfoldet hippocampus placeret på mikroelektroden array i midten. (C) på venstre, Optisk kohærenstomografi (OLT) billeddannelse viser den udfoldede væv placeret på toppen af array i en anden eksperiment. Til højre to langsgående skive billeder opnået fra OLT imaging til venstre viser mikroelektroden tips (hvide prikker pegede med pilene) nå ind i området lige under cellelegemet lag. Klik her for at se en større udgave af dette tal .
Figur 4. Eksperimentel opsætning. (A) En plastik dæksel med skruer er placeret over kredsløbene for at beskytte den mod eventuel vandskade. Optagelsen kammer har både indløbs- og udløbsrør til at varetage løsningen flow. En skræddersyet væv anker limet med en Nylon fiber mesh bruges til at fastgøre Tissue under forsøgene. (B) Billede taget fra bunden af glassubstratet af PMEA viser vævsankeret holder en prøve skive under et eksperiment. De krumme ledninger er nylon fibre fra masken trykke på toppen af vævet. De runde prikker er grundlaget for mikroelektroder. Pile peger på elektroder, der blev beskadiget efter flere forsøg. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 5. Rå registreret af PMEA fra en udfoldet hippocampus. Venstre panel: 4-AP-induceret epileptiform aktivitet optaget fra en enkelt mikroelektrode Højre panel:. Zoomes version af signalet mærket i tidsvinduet til venstre. (A) 10 sek afsnit af et eksempel på den spontane aktivitet ireduceret med 100 uM 4-AP aCSF opnået for en af mikroelektroderne beliggende i basal dendritiske region baseret på polariteten af signalerne med en SNR på 34,9 dB. (B) Rådata fra en anden mikroelektrode placeret tættere på somata med et SNR på 27,2 dB. (C) Eksempel på optagelse opnået fra en elektrode anbragt inde i somatiske lag. I dette eksempel, SNR er 18,53 dB. (D) Optagelse opnået fra en bøjet elektrode stadig ledende, men ikke trænge ind i vævet. Det bøjede elektrode har en væsentlig lavere SNR sammenlignet med de intakte elektroder (1,5 dB i dette eksempel). (E) Baseline støj optaget fra en mikroelektrode. Baseline har normalt en spids til spids værdi 150-200 μV og impedans på en enkelt elektrode er omkring 1 til 2 MQ. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 6. Omdannelse af neurale registrering af data i 2-D formering kort. (A) A 170 ms tidsvindue afkorter et enkelt neural spiking i hver kanal afbildet på fotoet af PMEA. De rå data filtreres af et lavpasfilter på 100 Hz. Signalerne fra de brudte elektroder interpoleres med optagelserne omkring det. I dette eksempel, alle piggene er positive. (B) En enkelt neural spike fra den røde pixel i (A) er normaliseret til farven bar med en brugerdefineret udviklede metode til individuel normalisering (Der henvises til tidligere publikation for flere detaljer om normalisering 7). (C) farvekort skabt af den enkelte normalisering viser at formeringsmateriale bevæger sig hen over hele området af den udfoldede hippocampus på forskellige tidspunkter.www.jove.com/files/ftp_upload/52601/52601fig6large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Udviklingen af den udfoldede hippocampus forberedelse, hvor de langsgående og tværgående akser hippocampus er bevaret i kombination med en gennemtrængende mikroelektrode array, giver et stærkt værktøj til at undersøge anatomi forbindelser eller neurale formering i hippocampus 7. Dette udfolder procedure gælder også for at studere hippocampus i voksne mus. Nylige undersøgelser med dette præparat viste, at 4-AP-induceret epileptiform aktivitet kunne forplanter sig med en diagonal bølgefront over hele området af den udfoldede hippocampus (figur 6) 7,8. Disse undersøgelser viste, at det intakte udfoldede hippocampus giver betydelige fordele i forhold til enten tværgående eller langsgående skiver når neurale formering i en flad hippocampal neuralt netværk kan undersøges (figur 6).
Den gennemtrængende mikroelektrode giver en betydelig fordel i forhold til eksisterende microelectrode arrays (MEA), som består af flere kontakter placeret over en flad overflade 11,12,17. MEA med flad overflade elektroder er vanskelige at anvende med den udfoldede hippocampus siden cellelaget ligger ca. 250 til 300 um væk fra overfladen (figur 2). Den her beskrevne PMEA var designet til at løse dette problem med 64-gennemtrængende elektroder er egnede til at studere den neurale formering med en højde på 200 um til nå dybt inde i vævet 7,13. Desuden PMEA også anvendes i enhver flad forberedelse væv, såsom kortikale skiver, hippocampus tværgående skiver etc.
En anden fordel ved at bruge denne PMEA er den forbedrede SNR. En prototype undersøgelse af dette PMEA viser SNR forholdet neural signal optages af denne PMEA har en gennemsnitlig værdi på 19,4 ± 3 dB, hvilket er væsentligt højere og mere stabil sammenlignet med VSD optagelse da tidligere undersøgelser viste, at toksicitet ogfoto blegning af VSD klart forringet evnen til at optage data 8. Med en forbedret forsøgsprotokol ved hjælp af væv anker i denne undersøgelse, SNR af optagelsen fra PMEA øges til et område fra ca. 20 til 30 dB (figur 5), som har en højere SNR forhold til de flade elektroder arrays med en værdi fra 10 til 15 dB 11,18. Evnen til at udfolde hippocampus er nødvendig for opnå et lag af neuroner (CA1-CA3), der kan forhørt af en flad indspilning array.
Eftersom silicium arrayet er bygget på et transparent substrat, spænding følsomme farvestof imaging teknik kan integreres i PMEA systemet at undersøge udbredelsen af neurale aktivitet i hippocampus 8. Transgene mus med fluorescerende spænding følsomme indikatorer kan også bruges til at undersøge oprindelsen og formering af signalet under fysiologiske betingelser samt ændringer induceret af pharmacological midler eller genetisk modificeret væv fra forskellige dyremodeller 9.
Der er flere kritiske trin for at sikre høj kvalitet optagelse. Første at sikre vævslevedygtighed, skal den kirurgiske procedure udføres så hurtigt som muligt. Normalt tager det omkring 1 til 2 min til at gå igennem alle trin fra 2,1) til 2.10). Praksis af udfoldningsproceduren på nogle eksempler dyr er stærkt foreslået før egentlig eksperimentel kirurgi udføres. For det andet, med strømningshastigheden behov holdes konstant for at undgå ethvert udsving af niveauet af perfusionsfluidet i optagelsen kammeret. Endvidere bør vævet forankres ned for at undgå bevægelse af vævet i forhold til arrayet.
Selvom PMEA beskrevet her kan give nyttige signaler i overvågningen af neurale formering i udfoldet hippocampus, der er nogle ulemper og begrænsninger i denne optagelse metode.
For det førsteKan mikroelektroder brække på grund af den mekaniske kraft på dem (figur 5D, E). Under proceduren væv placering og fjernelse kunne utilsigtet kontakt mellem den lille pensel og array forårsage mikroelektroder til at bøje eller knække. Når vævet anker sænkes ned ved mikromanipulator, kunne den vandrette bevægelse af vævet langs bunden af kammeret skabe en forskydningskraft, der kunne føre til bøjning eller brud af elektroderne. I en fremtid design bør mikroelektroder omformes med en noget tykkere base at gøre dem stærkere. I den nuværende version af denne PMEA, optagelsen elektroder har en smal base, i forhold til dens diameter 13 og derved svække elektroderne (figur 3A).
Renseproceduren også forbedres i tilstrækkelig grad fjerne det resterende væv og fibre, som kan knytte til opstillingen. Efter hvert forsøg, små stykkervæv kan forblive fastgjort til mikroelektroderne og denne resterende væv tilbage på elektroderne skal fjernes. Hvis disse resterende væv ikke fjernes, kan impedansen af elektroderne og SNR af optagelserne blive påvirket. Flushing af systemet med destilleret vand foreslås som angivet i del 5 i protokol afsnittet. Brugere er også rådes til at skylle systemet med nogle svage sur opløsning, der kan opløse vævet uden at beskadige systemet
En anden ulempe ved denne protokol er, at under udfoldelsen procedure, er det perforante vej i denne udfoldet hippocampus skæres, forhindrer undersøgelse af de mulige neurale signaler udbreder fra GD til de andre lag i hippocampus.
Sammenfattende har vi beskrevet her en ny metode til at undersøge udbredelsen af neural aktivitet i hippocampus ved at kombinere en høj formatforhold mikroelektrode array med udfoldet hippocampal tissue. Metoden førte til en bedre forståelse af, hvordan neuronal aktivitet kan udbrede sig i både langsgående og tværgående retninger. Denne teknik kan også anvendes til cortexvæv anbragt på en lignende måde på toppen af array'et. Desuden kombinerer optisk optagelse teknik med dette præparat er muligt, fordi array er gennemsigtig og kan også føre til nogle vigtige resultater om signaludbredelse i nervevæv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| desiccator jar | LABRECYCLERS Inc. | 5410 | Place regular paper towels at the bottome of the jar for animal anesthesia use. |
| A blade and Custome made surgical stage for unfolding hippocampus | N/A | N/A | A petri dish is place upside down (in the center) in the ice with a wet filter paper place on top of it. |
| Custom made tissue recovery chamber | N/A | N/A | Plastic tubes were glued with plastic mesh at the bottom and bubbled with 95% O2/ 5% CO2 in the aCSF. |
| Straight Operating Scissors | Fisher Scientific | S17336B Medco Instruments No.:81995 | This scissors is used to decapitate the mice. |
| Integra Miltex Goldman-Fox Scissors | Fisher Scientific | 12-460-517 MILTEX INC No.:5-SC-320 | This scissors is used to cut the skull of the mice. |
| Miltex Hysterectomy Forceps |
Claflin Medical equipment | CESS-722033-00001 | This Forceps is used to peel the cut skull to expose the brain |
| Micro Spatula | Cardinal Health | This micro spatula is used to tranfer the whole brain of a semisphere into the recorering chamber. | |
| Frey Scientific Stainless Steel Semi-Micro Spatula | Cardinal Health | this semi micro spatula is used to tranfer the unfolded hippocampus into the glucose aCSF in the recovering chamber. | |
| small paint brush | Lowe's | tem #: 105657 Model #: 90219 | The one with the smallest size in a normal paint brush package |
| Fire polished glass help tool | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes. |
| Custom made glass needle | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes. |
| Custom made glass tool with a metal wire loop | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes with a reshaped metal wire loop. |
| Custom made glass solution dropper | N/A | N/A | This tool was made from the regular Pasteur glass pipettes with its tips cut and a rubber head attached with the cut end. |
| Custom made tissue anchor | N/A | N/A | Nylon fiber mesh was glued on a insulated copper wire ring. The tissue anchor was hold by an micromanipulator. |
| Custom fabricated microelectrode array | N/A | N/A | More detail about the array please refer to Kibler, et al, 2011. |
| Custom made filter and amplifiers circuits for the array | N/A | N/A | More detail about the array please refer to Kibler, et al, 2011. |
| Data acquisition processor 3400a | Microstar Laboratories | N/A | This is a complete data acquisition system with A/D converter. |
References
- Richardson, K. A., Schiff, S. J., Gluckman, B. J. Control of traveling waves in the Mammalian cortex. Phys Rev Lett. 94 (2), 028103-028112 (2005).
- Luhmann, H. J., Dzhala, V. I., Ben-Ari, Y. Generation and propagation of 4-AP-induced epileptiform activity in neonatal intact limbic structures in vitro. Eur J Neurosci. 12 (8), 2757-2768 (2000).
- Grinvald, A., Manker, A., Segal, M. Visualization of the spread of electrical activity in rat hippocampal slices by voltage-sensitive optical probes. J Physiol. 333, 269-291 (1982).
- Gloveli, T., et al. Orthogonal arrangement of rhythm-generating microcircuits in the hippocampus. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (37), 13295-13300 (2005).
- Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neuroscience. 31 (3), 571-591 (1989).
- Albani, S. H., McHail, D. G., Dumas, T. C. Developmental studies of the hippocampus and hippocampal-dependent behaviors: insights from interdisciplinary studies and tips for new investigators. Neurosci Biobehav Rev. 43, 183-190 (2014).
- Zhang, M., et al. Propagation of Epileptiform Activity Can Be Independent of Synaptic Transmission, Gap Junctions, or Diffusion and Is Consistent with Electrical Field Transmission. J Neurosci. 34 (4), 1409-1419 (2014).
- Kibler, A. B., Durand, D. M. Orthogonal wave propagation of epileptiform activity in the planar mouse hippocampus in vitro. Epilepsia. 52 (9), 1590-1600 (2011).
- Wang, D., McMahon, S., Zhang, Z., Jackson, M. B. Hybrid voltage sensor imaging of electrical activity from neurons in hippocampal slices from transgenic mice. J Neurophysiol. 108 (11), 3147-3160 (2012).
- Wingenfeld, K., Wolf, O. T. Stress , memory, the hippocampus. Front Neurol Neurosci. 34, 109-121 (2014).
- Liu, J. S., et al. Spatiotemporal dynamics of high-K+-induced epileptiform discharges in hippocampal slice and the effects of valproate. Neurosci Bull. 29 (1), 28-36 (2013).
- Oka, H., Shimono, K., Ogawa, R., Sugihara, H., Taketani, M. A new planar multielectrode array for extracellular recording: application to hippocampal acute slice. J Neurosci Methods. 93, 61-68 (1999).
- Kibler, A. B., Jamieson, B. G., Durand, D. M. A high aspect ratio microelectrode array for mapping neural activity in vitro. J Neurosci Methods. 204 (2), 296-305 (2012).
- Schechter, L. E. The potassium channel blockers 4-aminopyridine and tetraethylammonium increase the spontaneous basal release of [3H]5-hydroxytryptamine in rat hippocampal slices. J Pharmacol Exp Ther. 282 (1), 262-270 (1997).
- Perreault, P., Avoli, M. 4-aminopyridine-induced epileptiform activity and a GABA-mediated long-lasting depolarization in the rat hippocampus. J Neurosci. 12 (1), 104-115 (1992).
- Chesnut, T. J., Swann, J. W. Epileptiform activity induced by 4-aminopyridine in immature hippocampus. Epilepsy Res. 2 (3), 187-195 (1988).
- Nam, Y., Wheeler, B. C. In Vitro Microelectrode Array Technology and Neural Recordings. Crit Rev Biomed Eng. 39 (1), 45-62 (2011).
- Gonzalez-Sulser, A., et al. Hippocampal neuron firing and local field potentials in the in vitro 4-aminopyridine epilepsy model. J Neurophysiol. 108 (9), 2568-2580 (2012).
