Abstract
Tip 2 diyabet 2013 yılında 382 milyon kişiyi etkileyen kronik bir hastalıktır, ve, son 2 yıl boyunca. 2035 1 ile 592.000.000 açıkça 2 kurulmuştur tip 2 diyabette beta hücre disfonksiyonu rolünü artması bekleniyor. Araştırma ilerleme pankreas adacık izolasyonu için yöntemler gerektirmiştir. Adacık izolasyon protokolü yabani tip ve diyabetik Lepr db (db / db) fareler, hem izole adacıklar verim ve kalitesini artırmak için bazı değişikliklerle, hisseleri burada diğer gruplardan protokolleri ile birçok ortak adımlar sundu. Bir canlı hücre 2-foton görüntüleme yöntemi, daha sonra adacıklara olan insülin salgılanmasının kontrol araştırmak için kullanılabileceğini sunulmuştur.
Introduction
hastalıkta p-hücresi işlev bozukluğu rolü yaygın 3,4 kabul edilmiştir. Böyle MIN6 ve INS-1 gibi hücre hatları beta hücre davranış biyolojisinin anlaşılmasında yararlı araçlardır. Bununla birlikte, insülin salgılanmasının fizyolojik kontrol Langerhans adacıklarında içinde yer alır. Bu adacıklar sıkıca paketlenmiş beta hücreleri binlerce yanı sıra kan damarları ve diğer endokrin hücre tiplerini içerir. Adacık içinde bu ortam insülin salgılanmasını etkiler ve diyabette önemli olması muhtemeldir. Bu nedenle, insülin sekresyonunun fizyolojik kontrol ve hastalığın patofizyolojisi anlamak için, sağlam adacıklar çalışma gereklidir.
Adacık izolasyonu
Tip 2 diyabetli hastaların özellikle insan adacıklarında Canlı insan adacık ve elde etmek güçtür. Buna ek olarak, insan adacıklar deneysel moleküler manipülasyon için kısıtlı imkanları vardır. Araştırmacılar bu nedenle kullanılan adresHayvanlar ve tip 2 diyabet hayvan modellerinden sağlar. Böyle bir hastalık modeli, db / db faredir. Bu modeller yakından insan hastalığı 5,6 paralellikler bir fenotip ilerlemesi ile tip 2 diyabete kendiliğinden mutasyon olduğunu. diyabetik db / db farelerde adacık izolasyonu için burada sunulan protokol daha iyi verim, saflaştırma ve gelişmiş adacık hayatta kalmak için bazı iyileştirmeler ile diğer gruplarla ortak birçok adım vardır.
2 foton görüntüleme
Burada anlatılan canlı hücre 2-foton tahlil sayısını ölçmek ve 7 ve yabani tip diyabetik 8,9 adacıklar birçok hücrelerinden insülin tek içeren granüllerin özelliklerini değerlendirmek için araştırmacılar sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Tüm mevcut deneyler (Queensland Üniversitesi, Anatomik Biosciences Etik Kurul tarafından onaylanan) University of Queensland yerel hayvan etiği prosedürlere göre yapılmıştır.
1. Adacık İzolasyonu
- Reaktif hazırlama
- Enzim karışımı
- Pankreas sindirimi için Liberase® ve kollajenaz tip IV'ün bir karışımının kullanılması. (Termolisin düşük) Liberase® TL DMEM, 26 ml (Dulbecco Modified Eagle Medium) ile 5 mg 1 vial seyreltilir.
- , 5 mM HEPES ile takviye edilmiş 0.5 mg / ml'lik bir konsantrasyonda, Hank tamponu içinde kolajenaz tip IV Hazırlama 0.5mM CaCl2, 0.1 mg / ml DNase ve 1 mg / ml sığır serumu albümini.
- Örneğin, (hacim olarak) 1 Tl 1 mi kolajenaz Liberase® 4 ml: 4 bir oranda Liberase® TL ve kolajenaz çözüm karıştırın. -20 ° C de, her ve mağaza 2.5mL enzimlerin karışımı kısım.
NOT: Doku inkübasyon süreleri venzim partiler arasında biraz (30 sn 1 dk farkı) lanarak. Bu nedenle, bir parti deneyi gerekebilir.
- RPMI İzolasyon Medya
- Oda sıcaklığında 1 L su RPMI 1640 tozu bir şişe eritilir ve 2 g NaHCOs 3, 4.02 g HEPES tamamlar.
- Manyetik bir karıştırıcı ile karıştırın, büyük bir konik bir şişe içinde, RPMI yalıtım ortamı birleştirin NaOH ile pH 7.4'e ayarlayın, filtre ile sterilize edildi ve 4 ° C 'de muhafaza edin.
- RPMI Kültür Medya
- % 10 fetal sığır serumu ve 1% antibiyotikler (örneğin, penisilin, 100 U / ml, 100 ug streptomisin / ml) ile, RPMI kültür ortamı kullanın.
- Enzim karışımı
- Adacık İzolasyonu ve Kültürleme
- Hayvan Kurban
- Yerel kurumun etik prosedürlerine göre servikal dislokasyon veya CO 2 boğulma tarafından fareler Kurban. % 70 etanol ile iyice fare vücut püskürtün.
- Pankreas Perfüzyon
- Uyanal karın cilt ve periton yoluyla se 2 uzun kesimler V şeklinde kanadı yapmak. Tüm karın boşluğu ortaya çıkarmak için cildi yukarı kapağı çekin, bağırsak kenara koymak ve koledok ortaya çıkarmak için katlanmış bir kağıt mendil ile yerinde karaciğer tutmak (Şekil 1 ve 2). Hayvan koyun cerrah ve uzak cerrah gelen kuyruk doğru kafa böylece.
- Duodenum (Şekil 1) girmesini enjekte enzimleri engellemek için duodenum duvarında ampulla bir damar kelepçe uygulayın.
NOT: enjekte enzimler pankreatik kanal içine gidin ve (kelepçe) üzerinden enjeksiyon yerinde pankreas veya reflü serpmek ya da (kelepçenin altında) duodenuma gidecek olup olmadığını o belirler gibi bu önemli bir adımdır. - Ortak hepatik kanal ve sistik kanal (Şekil 1) kavşağı yakınında 31 G iğne ile koledok cannulate ve ikinci enjeksiyon için odayı terk inci eğere pankreas ilk kez serpmek için başarısız olur. Yavaş yavaş (over ~ 10 sn) fare koledok içine yaklaşık 2 ml soğuk enzim karışımı enjekte edilir.
NOT: kelepçe doğru pozisyonda ise pankreas hızla perfüze edilecektir. - İğne koledok içinde olduğunu, ancak pankreas serpmek edemez (yani. Sabitlenmiş üzerinde ise karaciğer biraz uzak kelepçe yukarı taşımak ya da kenetlenmiş altında ise karaciğere biraz aşağı hareket ettirin) kelepçe konumunu ayarlayın.
NOT: İğne bazen çevredeki kapsül yerine kanalın lümenine gider. Yararlı bir işareti koledok enjekte kanalının genişlemesi olduğu içinde iğne olup olmadığını kontrol edin. Pankreas serpmek için başarısız olursa, alternatif enzim karışımı beklenen düşük verim ile pankreasın birden fazla enjekte edilebilir olduğunu. Pankreasın (splenik lob) sol sitenin perfüzyon adacık verimi maksimizasyonu açısından önemlidir. - Pankreas p sonraerfused, hızlı bir şekilde, pankreas kaldırmak bir viyal (~ 20 mi, cam) içine koymak ve bir 37 ° C su banyosu içinde yaklaşık 19 dakika inkübe edilir.
NOT: İnkübasyon süresi fare zorlanma ve yaşa bağlı olarak biraz değişebilir. - İnkübasyon süresinden sonra, ~ soğuk yalıtım ortam 20 ml ekleyerek sindirim işlemi durdurun. Pankreas bozabilir ve steril bir 50 ml tüp içine normal bir kurutma eleği (1 mm gözenek çapı) üzerinden dökün iyice çalkalayınız. Fren kapalı olan 4 ° C'de 1 dakika boyunca 400 xg'de izolasyon medya ve santrifüj tüpü kontör.
- Yine izolasyon ortamı pelet çözülür ve daha sonra fren kapalı olarak 4 ° C 'de 1 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj, iki adet 15 ml'lik tüplere aktarın. Aspirasyon süpernatant sonra, vorteks veya yukarı ve aşağı pipetleme tüp başına yoğunluk gradyan hücre ayırma ortamı 6 ml (Histopaque 1077 çözelti) ile iyice iki pelet karıştırın. Daha sonra hafifçe üstüne tüpün yanına yalıtım ortam ~ 6 ml ilaveFren kapalı olarak 4 ° C 'de 15 dakika boyunca 100 x g'de yoğunluk gradyanlı ayrıştırma ortamı ve santrifüjlenir.
- Üst (izolasyon ortamı) içinde süpernatant 3 ayrı yemekler, orta ve alt (yoğunluk gradyan hücre ayırma ortamı) katmanı toplayın. Bir mikroskop altında bir pipet kullanarak, bu 3 yemekler adacıklar seçmenize.
NOT: orta tabaka adacıklarının çoğunu içerir. Adacıklar boyutu ~ 50 mikron 500 kompakt yapıları (Şekil 3) olarak kabul edilmektedir. Biz WT farelerinde ~ 200 adacıklar ve db / db farelerinde 300- <100 adacıklar elde.
- Adacık Kültürleme
- Adacıklar, 37 ° C'de,% 5 ile enzim sindiriminden 6ml RPMI kültür ortamı (10 mM glukoz) ile 25 cm'lik bir petri tabağına 40 adacıklar kültürü grupları kurtarmak için /% 95 canlı önce 2 gün CO2 / O 2 cell 2-foton görüntüleme. Günlük kültür ortamı değiştirin.
- Hayvan Kurban
2. Canlı Hücre 2-Foton Görüntüleme
- Reaktif Hazırlama
- Ekstraselüler Tampon
- 140 mM NaCI, 5 mM KCI, 2.5 mM CaCI2, 1 mM MgCI2, 5 mM NaHCO 3 ve 10 mM HEPES ile 2-foton deneyi için, sodyum açısından zengin hücre-dışı tamponu hazırlayın.
- Ekstraselüler Boya
- 2-foton deneyi için -20 ° C'de hücre dışı tamponu, kısım küçük tüplere ve deposunda hazır SRB 8 mM hazırlar. 0.8 mM bir çalışma konsantrasyonunu elde etmek için taze dışı tamponu stok SRB 01:10 sulandırınız.
- Ekstraselüler Tampon
- foton Görüntüleme
- İlk olarak, 30 dakika boyunca 3 mM glikoz hücre dışı tamponu içinde 2 günlük bir kültür adacıklar önceden inkübe edin.
NOT: Biz kültüründe 2 ile 5 gün arasında adacıklar kullanın. - Sonra, mikroskop sahnede monte termo-kontrol odasının üzerine cam slayt yerleştirin. Çözümün sızmasını önlemek için gres kullanın.
- Extracell 500 ul odasına KapakFarklı glukoz konsantrasyonları (3 mM, 6 mM, 15 mM ve 20 mM glukoz) ile 0.8 mM SRB ihtiva nitlerin tamponu.
- Sonra, odanın ortasına ön İnkübe adacık yerleştirmek ve kemirgen adacıklar halinde, insülin immün çoğu hücreleri beta hücreleri olduğunu göstermektedir nerede, adacık haline 3-4 hücre katmanları odaklanın.
NOT: SRB hızla adacık tüm hücre zarı açıklayacağım ve adacık görüntüye hazırdır. - (Örn., Scanimage 11). Bir 60X immersiyon yağı hedefi (NA 1.42) ve görüntüleme yazılımı ile 2-foton mikroskop kullanın 4 tipik bir mikroskopi düzenlemesini göstermektedir Şekil. Floresan ile bir zar 880 nm'de femtosaniye lazer darbeleri ile heyecanlı geçirgenliği olmayan floresan dışı işaretleyici olarak SRB kullanarak görüntü ekzositik olaylar, 550-650 nm'de. Stimülasyon adacık yanıtları kaydedin.
- Küçük bir floresan nokta aniden görünüşü tek ekzositik olayları tespit (çözünürlük 10 piksel /1 m) ve ilgi bir bölge (~ 0.78 mikron 2) üzerinde floresan sinyal hızlı yükselen faz onaylayın.
- İlk olarak, 30 dakika boyunca 3 mM glikoz hücre dışı tamponu içinde 2 günlük bir kültür adacıklar önceden inkübe edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Adacık verimi ve arıtma
Normal bir vahşi tip fare, yaklaşık 200 adacık beklenmektedir. Sağlıklı adacıklar yuvarlak, parlak bir görünüm ve pürüzsüz bir sınır var. Bir altında sindirilmiş toplu az adacıklar ve asiner hücre ekli adacıklar (Şekil 3) sahipken aşırı sindirilmiş izolasyon toplu genellikle küçük ve bulanık adacıklar vardır. Daha iyi glisemik fareler 100'ün altında (saydam bir görünüme sahip daha küçük adacıklar var kötü glisemik farelere kıyasla (300 adacık kadar) daha büyük, daha parlak ve daha adacıklar var diyabetik db / db farelerde için, adacık verim ve görünüm hastalığın ilerlemesi bağlıdır Adacıklar)
2-foton deneyi
2-foton görüntüleme tek insülin granül füzyon düzeyinde insülin salgısını ölçmek için dolaylı bir testtir. Glikoz veya yüksek potasyum gibi uyarıcıya tepki olarak insülin granüller plazma membranı ile füzyon ve hücre dışı boya SRB th girerçapında ani flüoresan yer ~ 400 nm görünümünü sonuçlanan e granüller (Şekil 5). Çeşitli deneyler insülin salgılanmasının beklenen miktarda, 2 yanıt hücrelerinin, tutarlı boyutta granül füzyon olayların sayısını arttırma bağımlı glikoz doz insülin benzeri ihtiva eden granüllerin füzyonu, bir ölçüm olarak, bu tahlil doğrulamak için gerçekleştirilmiştir bir beta hücresinin bununla foton, 2 foton ve elektron mikroskobu ile ölçülen benzer granül çapı, boya alımı ve insülin ko 8 boyama.
Kayıt süre içinde tespit edilir uyaran ve öpücük-ve-run veya tam füzyon gibi füzyon olayları olayların konumu, görünüm zaman, süresi ve türü cevaben tüm ekzositik olaylar karakterizedir ( Şekil 5, 6). Füzyon işlemi bu özellikleri değerlendirmek için değerlidir Tip 2 diyabet modellerinde granül füzyon herhangi bir kusur. Bu yöntemi kullanarak Bizim önceki rapor diyabetik db / db adacıklar kusur tam granül füzyon kaybı ve bireysel granül füzyon 7 kinetik özellikleri bir değişiklik olduğunu göstermektedir. Ayrıca, hastalık insülin salgılanması azalmıştır büyük faktöre cevap veren hücrelerin 7 sayısında bir azalma olduğunu göstermektedir.
Şekil 1:. Sıkma ve enjeksiyon sitelerin bir diyagram ortak hepatik kanal ve sistik kanalın kavşak yakınında koledoğa enzimleri enjekte edilir. Pankreatik kanal enjekte enzim kolaylaştırmak için bir damar kelepçe ile Valter ve ampulla sıkıştırın.
2632fig2.jpg "/>
Şekil 2: Farelerde enjeksiyon işlemi. Üst rakam Valter ampullası uygulanan bir damar kelepçe ile koledok içine iğne göstermektedir. Alt rakam enjeksiyonundan sonra Liberase® perfüze pankreas gösterir.
Şekil 3: Vahşi tip ve db / db izole adacıklar tipik görüntüleri (a) doğal tip izole adacıklar.. (B) db / db izole adacıklar. Ekli asiner hücreler (oklar) ile adacıklar sindirilmiş Under-(C). (D), küçük ve bulanık adacıklar (oklar) ile Over-sindirilmiş adacıklar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4:. Ismarlama 2 foton mikroskop ana bileşenleri bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5: 2 foton mikroskopi ile kaydedilmiş gibi tek bir insülin granül füzyon etkinliği Örnek sol şekil (a) önce ve (B) 15 mM yanıt olarak bir ekzositik olay (ok) görünümü glukoz stimülasyonu sonrası hücreyi temsil eder.. Plazma zarı ile sigortalar zaman (C) granül haline dışı boya SRB girilmesi ile SRB etiketleme göstermektedir. (D), bir ekzositik olayın ilgi konusu bir bölge üzerinde floresan yoğunluğu olarak sequentia gösterirBu ekzositik olay (ölçek çubuğu 1 um) l görüntüler. Do ve ark 2014 7 modifiye Görüntü. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 6:., Hücre dışı boya olarak SRB ile 2-foton mikroskop altında yabani tip ve diyabetik db / db adacıklar Yanıtlar bu deneyler insülin granül füzyon olaylar 15 mM glukoz stimülasyonuna yanıt olarak kaydedilir. Sarı çevreler kayıt 20 dakika boyunca ekzositik olayların sitelerdir. Do ve ark 2014 7 modifiye Görüntü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
adacık izolasyonu en kritik faktör pankreasın ilk perfüzyon ise; Bir altında oldukça düşük adacık verim pankreas sonuçları perfüze. Diğer faktörler de bu sindirim zaman ve kısmen perfüzyon seviyesinin telafi olabilir çalkalama düzeyi gibi izolasyon kalitesini etkiler. Örneğin, tam olarak perfüze pankreas hafifçe çalkalama sırasında bir küçük pankreas daha çalkalanarak ~ 20 dakika sindirim gerektirebilir sindirilmiş aksine, 18 dakika, 30 saniye ~ 37 ° C'de inkübe edilmesi gerekecektir. Bizim ellerde iki sindirim enzimlerinin karışımı tek başına bir daha iyi adacık izolasyonu sağlar. Kollajenaz tek yöntem için, sindirim süresi eleştirel adacık verim ve sadece 30 saniyelik zaman farkı dramatik kalitesini etkileyebilir etkiler. Yalnızca Liberase® için, verim kabul edilebilir ama altında sindirim bazen kollajenaz eklenmesi daha iyi bağ dokusu sindirmek için yardımcı inanıyorum, olur.
Adacıklar izole edildikten sonra gerçekleştirilebilir mümkün olan deneyler vardır. İzole adacık hemen izolasyondan sonra paraformaldehid veya metanol içinde sabitlendi ve ilgi 10 proteinlerinin konumunu belirlemek için immünofloresan boyama kullanılabilir. İzole adacıklar, tek hücreler içinde disperse edilebilir. Bu adacık izolasyonu aynı gün veya adacık kültürünün birkaç gün sonra yapılabilir. Tek hücreler daha sonra dışarı kaplanır ve böyle yama kelepçe ve toplam iç yansıma mikroskopi gibi teknikler için dayanak olmuştur, bu hazırlıktır. Ölçen deneylerdeinsülin salgılanması, yanı sıra canlı hücre 2 foton görüntüleme sağlamak için, adacıklar tekrarlanabilir veri sağlamak için kültür içinde 2 gün ihtiyaç olduğunu bulduk. Ne kültüründe oluyor iyi anlaşılamamıştır ama izolasyon ve sindirim sürecinden toparlanma dönemi olduğu düşünülmektedir.
Burada sunulan 2-foton tekniği sağlam adacıklar içinde birçok hücrelerden bireysel granül füzyon düzeyinde görüntüye insülin salgılama süreci araştırmacılar sağlar. Bu granül füzyon etkinlikleri ve zamanlama sayısı miktarları ve insülin salgılanmasının 8 zamansal profili ile tutarlı olduğu bulunmuştur. Bu yöntem, insülin granül füzyon olayları çoğunluğu algıladığını göstermektedir. Eritme granüller boya girişi 7,8 çalışılmaktadır beta hücrelerinde insülin granül füzyon göstermek için kontrol deneyleri yürütmek için biz büyük çaba gitti insülin granül füzyon olayları tespit etmek için özel bir yöntem olmadığını göz önüne alındığında
Tüm görüntüleme yaklaşımlarına genel olarak 2-foton mikroskop ile teknik bir takım sorunlar vardır. Örneğin, dikkatle biz dedektörleri kazancını azaltmak, böylece adacıklar için yeterli ışık almaya çalışırken karşıt faktörler dengelemek ve bu nedenle biz hücre hasarına neden adacıklar için çok fazla ışık koyarak, gürültüyü azaltmak. Sistemimizde, bir Pockel hücresi darbeli lazer (Şekil 3) azaltmak için kullanılır; Tüm ticari sistemler numuneye düşen ışığın yoğunluğunu değiştirmek için mekanizmaları vardır.
Özetle, db dikkatli izolasyon kombinasyonu / d'b adacıklar ve tam adacık 2 foton mikroskopi mevcut yeni fırsatlar insülin salınımı süreçlerini incelemek ve tip 2 diyabette önemli kusurlu unsurları belirlemek için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liberase TL 5 mg | Roche | -5401020001 | |
| Collagenase type IV-1g | Gibco-Life Technologies | 17104-019 | |
| Histopaque 1077 500 ml | Sigma Aldrich | 10771 | |
| RPMI 1640 Medium (10x) 1L | Sigma Aldrich | R1383 | to prepare isolation media |
| RPMI 1640 (1x) 500 ml | Gibco-Life Technologies | 21870-076 | to prepare cultured media |
| Penicillin-Streptomycin 100 ml | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | to prepare cultured media |
| Fetal bovine serum 500 ml | Gibco-Life Technologies | 10099-141 | to prepare cultured media |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco-Life Technologies | 11966-025 | to dilute the liberase |
| Metamorph program | Molecular Devices, USA | to analyze the 2-photon images |
References
- Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes Research and Clinical Practice. 103, 137-149 (2014).
- Ashcroft, F. M., Rorsman, P. Diabetes mellitus and the beta cell: The last ten years. Cell. 148, 1160-1171 (2012).
- Weir, G. C., Bonner-Weir, S. Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes. Diabetes. 53, S16-S21 (2004).
- Kjorholt, C., Akerfeldt, M. C., Biden, T. J., Laybutt, D. R. Chronic hyperglycemia, independent of plasma lipid levels, is sufficient for the loss of beta-cell differentiation and secretory function in the db/db mouse model of diabetes. Diabetes. 54, 2755-2763 (2005).
- Wang, Y. W., et al. Spontaneous type 2 diabetic rodent models. Journal of Diabetes Research. , (2013).
- Hummel, K. P., Dickie, M. M., Coleman, D. L. Diabetes a new mutation in mouse. Science. 153, 1127-1128 (1966).
- Do, O. H., Low, J. T., Gaisano, H. Y., Thorn, P. The secretory deficit in islets from db/db mice is mainly due to a loss of responding beta cells. Diabetologia. 57, 1400-1409 (2014).
- Low, J. T., et al. Glucose principally regulates insulin secretion in mouse islets by controlling the numbers of granule fusion events per cell. Diabetologia. 56, 2629-2637 (2013).
- Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet. Science. 297, 1349-1352 (2002).
- Low, J. T., et al. Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature. Diabetologia. 57, 1655-1663 (2014).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomedical Engineering Online. 2, 13 (2003).
