Abstract
当与特定的配体刺激的判断嗅感觉神经元的生理反应（OSN）关键是理解嗅觉驱动行为和其调制的基础。这些编码特性在很大程度上依赖于臭味分子和嗅觉受体（OR）之间的初始相互作用表达在嗅觉神经元。的表达，或者关键的身份，特异性和配体谱。找到或配体的可能性表示在内的上皮随机选择一个OSN很低。为了应对这一挑战，这个协议使用基因表达定义的OR的启动子控制下的荧光蛋白标记的小鼠。嗅觉神经元位于在紧张的和有组织的上皮衬里鼻腔，与邻近细胞影响他们的成熟和功能。这里，我们描述的方法来分离完整嗅上皮，并通过膜片钳记录记录嗅觉神经元e的特性xpressing定义的气味受体。该协议允许一个同时保持相邻组织的影响表征OSN膜特性。膜片钳的结果分析产生的配体/或相互作用，转导途径和药理学，嗅觉神经元“编码性质和它们在膜级调制的精确定量。
Introduction
嗅觉感觉神经元（OSN）代表嗅觉感知的第一步骤。位于嗅觉上皮衬里啮齿动物的鼻腔，他们变换气味物质的化学信息转换成通过他们的轴突传送到大脑的动作电位。为了更好地理解嗅觉编码机制，有必要表征嗅觉神经元的转导和膜特性。直到最近，大多数用于表征哺乳动物的嗅觉神经元的性能的技术进行了分离上1-4嗅觉神经元。解离过程中使用的各种机械和化学（ 即酶）进程从环境释放的嗅觉神经元。这些过程可引起细胞的记录数量较少。这种低数量可以甚至在GFP标记的细胞的情况下更加重要。离解也除去嗅觉神经元和嗅觉上皮的可以提高surviv其它细胞之间的局部细胞 - 细胞相互作用人与嗅觉神经元“性质的调制。为了绕过分离程序，一个完好的制剂被开发5。
每个OSN表达一种嗅觉受体（OR）从一个大的多基因家族6中选择。有〜表示在小鼠的主要嗅觉上皮1000 OR值。由于在野生型动物的大量或，机会来记录嗅觉神经元表达相同或非常低。为了克服这些限制，基因靶向的小鼠可在其中表达所识别或标记有荧光蛋白7-9所有嗅觉神经元。这些标记的嗅觉神经元被用来做功能分析分离的筹备与7,10,11前面提到的缺点。因此，一个完整的上皮细胞的准备从5标记基因小鼠规避这些问题。它允许嗅觉神经元表达精确定义的OR 值的环境中尽可能接近在vi的活动的监控沃越好。此外，嗅觉神经元的膜片钳记录也允许膜性能，转导途径药理学，配体/或相互作用的精确分析。所有这些话题几乎不能使用外记录进行分析。我们使用这种技术来监控嗅觉神经元表达气味受体SR1和MOR23 12,13的响应。该技术的可行性，通过MOR23其他群体表达嗅觉神经元14以及上表达神经元15,16等手术室证实。限定嗅觉神经元的人口的监视可以导致它们的性质在许多不同的情况下，例如显影14的分析，老化17，臭气物质诱发塑性18，和变化中的气味受体的序列中的气味编码15的作用。这个协议从而提供了一个有力的工具在膜级监测定义嗅觉神经元的功能特性。
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Protocol
该协议遵循UNIVERSITE勃艮第的动物护理准则和批准了UNIVERSITE勃艮第伦理委员会。
1.动物
- 使用可在杰克逊实验室基因工程OR-IRES-tauGFP小鼠。这些小鼠以分析轴突靶向嗅觉系统19的和发展开发彼得Mombaerts博士的实验室。例如，MOR23-IRES-tauGFP行，股票号码006643，耐官方应变名B6; 129P2- Olfr16 tm2Mom / MomJ;同样，SR1-IRES-tauGFP行，股票编号6717负有正式名称B6; 129P2- Olfr124 tm1Mom / MomJ。
- 关于动物的年龄：用于协议的一个更好的结果，使用2和4周龄之间的动物。在这个年龄组中，清扫容易（较软的骨头，更坚定的嗅上皮）和树突状旋钮都是双向gger比较年长的动物。
2.制备电极和解决方案
- 对于刺激移液器：购买prepulled刺激移液器。否则，手动准备他们。
- 使用火焰，弯曲61毫米玻璃吸管从尖端约1厘米。插入这六个移液器加直7 日在1.5厘米热缩管通过小孔加强。
- 热缩管，以维护连接在一起的桶。附加一个额外的热缩管到的桶的另一端。用多管拉出器拉出此刺激吸管。
- 添加一些白色液体胶水周围的小孔，以加强弯曲的提示。让干燥O / N。
- 制备1或2升的正常林格氏胞外溶液（以mM计：氯化钠124，氯化钾3，用MgSO 4 1.3， 氯化钙 2， 碳酸氢钠 26，将NaH 2 PO 4 1.25，葡萄糖15; pH值7.6和305毫渗透摩尔浓度）。保持在4℃直至使用。
- 制备细胞内储备溶液（以mM计）：氯化钾70，KOH 53，甲磺酸30，EGTA 5，HEPES 10，蔗糖70; pH为7.2（KOH）和310毫渗透摩尔浓度。保持在4℃直至使用。好几个星期。
- 准备用制霉菌素实验前细胞内的录音解决方案即兴（在最后一分钟）。
- 称取3毫克制霉菌素，加入50微升的DMSO;涡旋20秒然后超声处理2-3分钟，直到完全稀释。
- 加入20微升的DMSO-制霉菌素溶液在5毫升细胞内贮备液。涡旋20秒，然后超声处理3分钟。保持此解决方案，在4°C和光线直射保护，制霉菌素是光敏感。此溶液可用于几个小时。更换每一天。
- 一旦嗅觉上皮的准备是在显微镜下，需要一定的该溶液以1毫升注射器用火焰细长黄色尖端以填充电极;从光线直射保护。一旦在室温，制霉菌素液是不是稳定的;更换溶液在1ml注射器每小时或保持在冰上。
- 拉记录电极与一个车夫来获得长长的脖子和小头（〜2微米）以15-20MΩ与内部制霉菌素液阻力。
- 制备在0.5M的在DMSO下通风柜加臭剂溶液;等分和保持在-20℃直到使用。稀臭气物质在林格氏溶液中，直至所希望的浓度。填写刺激吸管。
3.准备嗅觉上皮
注意：或-IRES-tauGFP小鼠表达的tauGFP的或启动子的控制之下。在这些小鼠中，表达感兴趣的或所有神经元都GFP标记的。该协议适用于表示在所有区域手术室。然而，解剖和录音是更容易表达在背区手术室。
- 通过注射氯胺酮和赛拉嗪（150毫克/公斤和10毫克/公斤生化需氧量的混合物麻醉动物Ÿ重，分别）。断头可以用锋利的剪刀对年轻小鼠或用适当的维护啮齿动物为铡老年小鼠进行。
- 采用环形解剖剪刀作一纵切口内侧通过背部皮肤。拉它拆开去除皮肤。使用剪刀，剪断下颚处下颚关节。由平行于牙齿冠状切口取出上前牙。
- 使后面的眼睛头部的冠状切，并保持头部的仅前部。浸在了管制范围内的解剖冰冷的林格氏液。
- 范围下剖析：在腹侧，使沿上颚/牙齿的纵向切割。切背侧骨头纵向，鼻腔的dorso-侧面以下。除去大部分骨骼和味觉;在RT传送它相连的隔膜和上皮中含氧林格。
- 对于最终的解剖：在开始录制前右会议上，剥离上皮从底层隔钳。分离钳和具有两个4-5毫米剪刀切口（使用microvannas剪刀）在隔膜，其中粘合力更强的前部的上皮。
- 小心地切割出来沿其背部连接到隔上皮去除犁鼻器。转移上皮至记录室朝上粘液层;保持平与竖琴室。
- 一个堂堂正正的显微镜配备荧光光学系统和感光摄像头安装在室内。可视化通过40X水浸物镜（数值孔径0.8）和一个额外的2X或4X放大率由放大透镜取得的制备在计算机屏幕上以高倍率。用含氧林格在室温（1-2毫升/分钟）连续灌注。
4.记录会话
- 搜索荧光细胞：激发准备在480纳米EGFP的，发射的光在530-550纳米范围内;针对一个树突状旋钮，这是在荧光下亮场可靠可见。
- 填写与制霉菌素液内电极;轻轻拍打在电极去除气泡。
- 在插入电极支架电极，适用于移液器正压;电阻应为15〜20兆欧。
- 把电极接近细胞;一旦电阻达到〜40MΩ，释放正压和应用轻微负压达到千兆欧密封。
- 一旦密封达到，设置膜电位约为-75毫伏;
- 一旦进入细胞被打开，继续刺激方案，药物治疗。为了测量响应单一的加臭剂的刺激，记录200-500毫秒自发性活动，刺激为500毫秒，并测量细胞的长达10秒13的响应。对于药物治疗，灌注药物制剂在所需的浓度20。
5.数据分析
- 在50％的最大幅值，上升时间（必要的时间，以达到90％的最大振幅的，在毫秒），总电流（在PAS的曲线下面积），时间：作为接着分析电流通过加臭剂刺激引起（发作和响应在最大振幅的50％的偏移量，在毫秒之间的时间）。
- 使用峰值传导电流（最大振幅达到）在不同浓度，绘制并使用希尔方程拟合剂量响应曲线为：I = I最大/（1+（K 1/2 / C）n），其中I表示峰值电流，IMAX在饱和浓度的最大响应，K 1/2的浓度在该半最大反应的达到，C加臭剂的浓度和n希尔系数。
- 在电流钳的最大去极化分析膜电位的录音中，托塔升势引起（在mVsec曲线下面积）;记录自发扣球活动在30秒到1分钟的录音;通过尖峰通过注入电流（5-10 PA）的记录引起兴奋。
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Representative Results
本协议的结果取决于解剖的质量。此清扫步骤必须短（少于10至15分钟）和精确的（ 即，避免了上皮的损害）。 图1说明了一个理想的准备看起来像在不同的放大级别。在明亮的下一个领域低倍率不同的细胞类型（如嗅觉神经元的旋钮，支持细胞）是有区别的（ 图1A）。在最高放大级别，通常为80X 160X，在明亮的领域，嗅觉神经元的树突状旋钮应该是从支持细胞（ 图1B）清晰可辨。在荧光灯下，只有树突旋钮和GFP标记的细胞的纤毛是可见的（ 图1C）。通过比较的2个图像，标记的细胞可以接近与记录吸管（ 图1D）。
解剖的温度，lution和夹层的时机是至关重要的。解剖的第一部分，隔膜（第3.1.1到3.2）的编制应该发生在5至10分钟，在冰冷的解决方案。最后解剖（3.3）应该持续不到5分钟，在室温下进行。如果解剖持续时间过长，或在夹层的解决方案过于热情进行，编制总是看起来很快损坏：树突状旋钮浮动的上皮细胞的表面上，并像死细胞。
一旦密封达到和下制霉菌素的效应的细胞中打开，典型的电压门控电流可以观察到（ 图2A）。的形状和这些电流的特性可用于监测细胞的健康：在将死的细胞或如果密封的质量减少，这些电流'振幅将减小。下的电流钳构造，动作电位可以被记录或自发（ 图2B）或通过注射去极化电流（ 图2C）的。诱导电流注入的焙烧性能表征记录神经元的兴奋性。不同的嗅觉神经元“人口的兴奋性可以比（用经典的频率和ISI计算）。
装载有不同增味剂和/或不同浓度的添味剂的多管吸移管可以由压力喷出来刺激细胞。这允许测量的加臭剂诱导的反应。的有气味的物质和浓度必须根据选择的或表达在感兴趣的细胞，例如新铃兰醛是该配体为MOR23，苯乙酮为M71，丁香酚对mOREG。在示出在图3的实验中，所记录的MOR23-IRES-tauEGFP神经元响应于不同浓度的新铃兰醛，配体为MOR23的，根据电流钳模式（ 图3A）或电压钳模式下（ 图茜3B）。在电压钳模式中录音，不同的特征可被监控以量化的响应（最大幅值，上升时间，总电流引出， 等等 。），为电生理学进行经典。使用的加臭剂诱导的反应的最大振幅，剂量反应可以绘制和拟合使用希尔方程。这些结果提供了有关每个OSN的编码属性信息：检测阈值，时间动态，动态范围和饱和度。的剂量-反应曲线的实例示图3C上。所有这些细节可以单独嗅觉神经元之间进行比较，以衡量在一个人群中的潜在的异质性;它们也可以被嗅觉神经元有或没有施加治疗，以测量潜在的调制和可塑性之间进行比较。
图1：一个健康的制备的代表性的图像（A）完整嗅觉上皮从鼻一个SR1-IRES-tauGFP转基因小鼠在40X放大率亮场条件下观察的空腔萃取。 OSN树突旋钮（黑色箭头头部）封闭在支持细胞（SC）和鲍曼腺体（BG）的网格。 SR1（二）树突状旋钮表达亮场条件（白色和红色箭头头）下观察嗅觉神经元。 （ 三）同一领域中（B）在荧光灯下显示SR1表达嗅觉神经元树突状旋钮。 （ 四）记录电极接近在明亮的领域SR1表达OSN。红色箭头表示相同SR1 OSN中的（B - D）。比例尺：5微米。
图2：与该协议得到代表膜性能的结果：通过增加去极化步骤从膜电位-67 mV到40引起的膜片钳记录上的SR1-IRES-tauGFP OSN的树突旋钮（A）电压门控电流毫伏。 （ 二）记录在电流钳配置自发活动;动作电位可以在15秒内记录历元期间被观察到。由+7 pA的兴奋电流引起的（C）动作电位;这个协议提供了有关细胞的兴奋性信息。
图3：在一个MOR23-IRES-tauEGFP神经元的加臭剂诱导的反应的代表性例子增加新铃兰醛，所述MOR23受体的配体，浓度诱导既在电流钳（A）和在电压钳（B）中增加的响应。所述膜电位钳制在-67毫伏。 （C）获得的三个M71神经元响应于增加苯乙酮的浓度并装有Hill方程个人剂量-响应曲线的例子。
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Discussion
这个协议的正确监测健康嗅觉神经元的性质的能力在很大程度上依赖于制剂的质量。因此，清扫步骤是关键的。首先关键是要注重质量（pH值，渗透压摩尔浓度），氧和温度（冰冷的，但不冻结）夹层介质。第二，与解剖工具上皮的操作必须尽可能限制，以避免损坏。最后，这是至关重要的，以获得以访问最大OSN人口尽可能制剂尽可能平坦。
解剖质量是根本，获得一个健康的制剂。然而，不同的方法可以用于夹层：这里，我们提出一个腹侧向背侧夹层但有些用户可以倾向于以启动解剖背侧迅速打开鼻腔及具有快速访问的嗅觉上皮的隔凹槽。每个用户都可以适应，因此公关otocol为最有效的策略，以达到所感兴趣的区域的一个健康的制剂。
一旦制备是在显微镜下，需要制备的健康的长期监测。事实上，不健康的制剂导致低概率达到千兆欧密封。在获得gigaseals低效率可以通过改变，以便找到健康嗅觉神经元对制备感兴趣的区域得到改善。有一种更直接的解决方案是通过一个新的完全替代的制备方法。一旦密封件达到，低概率到达“开”的状态可以发生。这可能是由于该内部溶液的质量。内部溶液必须不久实验前制备。使用涡旋和超声处理的是关键的，因为制霉菌素的溶解度是相当低的。为了提高开口的概率，内部溶液应该再次涡旋10秒，然后超声处理30到60秒。这乌苏同盟提高细胞开口的效率。
为了刺激记录OSN与增味剂，提出了协议使用7桶刺激吸管。这种类型的吸移管意味着在添味剂和/或加味剂测试的每个记录单元七个浓度的数量的限制。这个限制是相对在剂量响应曲线的情况下，不显著，因为它可以覆盖到浓度的7个对数单位。然而，在筛选实验的情况下，在其中不同的添味剂进行试验，一个七桶吸管可能显示的局限性。在筛选实验中，目标是找到一个配体表达一种孤儿或标记的嗅觉神经元。使用此协议将需要使用气味混合物。引发一个响应每个混合物将被再分成个别气味物质。这样做是为了筛选胺气味物质上TAAR表达嗅觉神经元16。在这些实验中，荧光神经元表达TAARs和配体是UNKnown。使用协议，作者可以筛选几十胺气味物质的混合物。引发一个反应混合物然后分解到单一气味物质，以便找到最有效的配位体。
记录站点和刺激移液器之间的距离应以最小化单元20的机械刺激明智选择。如果压力太高（高于30 psi的在我们的记录条件下）和/或所述距离太小（低于20微米），在一些嗅觉神经元的机械响应甚至可以掩盖气味剂的反应。压力和膨化吸管和记录点之间的距离也很关键控制刺激时的解决方案交流。浓度到达神经元先前评价为尽可能靠近本中的吸移管浓度通过一系列的测试13。这些试验中使用的溶液着色蓝色染料来测量发病和叔偏移他的刺激。用20 psi的压力和30微米的距离，则刺激的最大强度在300毫秒为止。该刺激的偏移也被仔细评估：由于前期准备工作的灌注液连续流动，刺激被洗出内0.8至0.9秒13。
气味编码嗅觉神经元的性能进行了测定历史上无论是通过细胞外记录在体内或通过分离细胞实验。在哺乳动物中，细胞外记录均在第一大鼠21进行体内 。在细胞外记录中，或表示在所记录的细胞是未知的，从而限制了成功率，以找到一个细胞响应测试的加臭剂。该协议允许在记录和定义受体的表征在上皮的细胞环境中的神经元。这些受体的性质可以因此在不同级别进行分析：在特异性配体在转导途径的第一步/或相互作用;因此，激动剂/测试多种配体的拮抗剂的相互作用;的混合物积分定义的ORs及转导通路嗅觉神经元“特异性的角色的属性;上的内上皮细胞 - 细胞相互作用（如间隙连接）嗅觉编码的影响;最后是传导通路的调制使用药理学试剂。
在解离的细胞记录，如前面提到的，离解过程中除去了黏液和细胞至细胞内的嗅觉上皮的相互作用。这可能会引起变化嗅觉神经元的编码性能。经常报道的被分离细胞钙成像实验。例如，M71表达嗅觉神经元响应于苯乙酮剂量-反应曲线的报道7。这些剂量 - 反应曲线是比使用协议中得到的剂量 - 响应曲线更陡这里介绍4。这些差异可能是由于细胞 - 细胞在完整制剂的相互作用，也以在分离的细胞中除去粘液。黏液已知含有许多蛋白质和参与perireceptor事件基本为嗅觉转导22,23的酶。在协议这里报告，嗅觉上皮的结构的保存和粘液的推定存在有助于保持在嗅觉神经元臭气物质编码的天然特性。在协议中使用的浓度示于摩尔/升，通常是在10 -7 -10 -3范围。这些浓度比在空气中相化的录音（无论是在局部场电位或外记录）中使用的浓度较高。这些差异可能是由于i）该记录（因此和刺激）的液体相，和ii）所述粘液的慢洗脱通过在录制的灌注。的睦的事实上，冲洗我们和嗅觉神经元“轴突解剖过程中的部分可以支持提出的制剂中可能有资格作为”假 - 完整“，而不是一个”完全完整“的准备。该制剂表示，但是，由于接近体内尽可能和尚未引发记录条件的膜片钳记录。任何在体外准备从哺乳动物有机体的生存仍然有时间限制。此限制可能是由于粘液的洗出，的嗅觉神经元“轴突的部分以及没有血液循环的制剂中。
这里介绍的协议允许一记录嗅感觉神经元的膜特性。这种技术可以有多个应用程序，如嗅觉神经元的膜性能，嗅觉神经元的药理研究，嗅觉神经元的气味编码性能的调制和手术室的deorphanization分析。在钙成像记录的事件SLOW和持久。膜片钳记录在本协议导致约在膜水平嗅觉传导通路的快速事件的数据。
这里介绍的录音在膜片钳配置执行。在这种结构中，所记录的细胞的膜性能可被分析，无论是嗅觉传导途径的机械或所涉及的电压门控电流。使用此协议实验可以提供有关数据的气味编码嗅觉神经元特性的调制。药剂可用于研究在不同条件下的嗅觉转导：例如，MDL12330A，腺苷酸环化酶III（ACIII）24,25的阻断剂可以在灌注溶液被应用到调查ACIII的在加臭剂的反应中的作用。此外，该协议可以用于调查如何嗅觉编码属性被调制在不同的条件，例如嗅觉环境<SUP> 18或参与摄食行为26激素的影响下。最后，该协议也可导致大约OR /配体相互作用和解密的激动剂/拮抗剂活性上定义的ORs甚至在随机选择的受体27的数据。
最后，由于在7机筒刺激吸管的限制，该协议也可以被用于deorphanizing OR值。如前面，在这种情况下所提到的，几个加臭剂的混合物可以进行测试。混合物引发一个反应应该再分为其它细胞测试的个体增味剂。
通过针对嗅觉神经元表达定义手术室，该协议提供了有关手术室，配体/手术室的相互作用，转导通路性能强大的数据并比较在不同条件下的嗅觉神经元特定人群的特性。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| vibration table with Faraday cage | TMC | 63-500 SERIES | required : isolates the recording system from vibrations induced by the environment (movements of experimenter, vibrations of equipment such as fans for cooling computers, etc); can also be purchased with a Faraday cage, or equipped by a custom made Faraday cage; this cage is recommended to avoid electric noise from the environment |
| optics | |||
| microscope | Olympus | BX51WI | upright microcope equipped with epifluorescence; fixed or moving stage depending on the user's preference |
| objectives | Olympus | LUMPLFL40XW | at least 2 objectives required: a 4X or 10X for coarse approach to the cell; and a 40X immersion long distance example Olympus LUMPLFL40XW / IR /0,8 / WD:3.3 MM |
| magnifier | Olympus | U-TVCAC | ABSOLUTELY REQUIRED: placed in the light path between the objective and the camera; allows to magnify the image on the screen in order to reach precisely the knob with the recording electrode |
| camera | Olympus | DP72 | a good camera is required to see the neurons in fluorescence as well as in bright field; the controlling software is simple and allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell. An ultrasensitive camera is not necessary |
| filters | Olympus/Chroma | depending on the fluorescent protein used in the mice; example for GFP: excitation : BP460-490: emission: HQ530/50m | |
| amplifier | HEKA | EPC10 USB | monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the puffing by sending a TTL signal to the spritzer; the EPC10 setup is controled by computer |
| software | HEKA | Patchmaster | controls the amplifier during the experiment |
| micromanipulator | Sutter | MP225 | precision micromanipulator, allows precise movements down to 1/10th of a micrometer; this model is very stable; avoid hydraulic manipulators that may drift |
| electrode puller | Sutter | P97 | with a FT345-B wide trough filament; to prepare recording pipets of about 2µm diameter with a long tip to reach the cells; the resistance should be 15 to 20Mohm with perforated patch clamp solution |
| glass | Sutter | BF120-69-10 | in our recording conditions, this glass is ideal for recording pipets |
| recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | a chamber is needed to set the preparation under the microscope. To maintain the preparation in the center of the chamber, a net/anchor should be used. |
| stimulation | |||
| glass | WPI | TW100F-4 | attached in groups of 7, these pipettes are used to prepare prepulled stimulating pipettes |
| multibarrel puller | MDI | PMP-107-Z | by association of pull and twist, this puller allows us to prepare puffing electrodes with 7 barrels |
| precision pressure injector | Toohey Company | P/N T25-1-900 Single Channel | this precision pressure injector controls the pressure ejected in the multibarrel puller; it is controlled manually or by the amplifier by a 5V TTLs |
| micromanipulator | Narishige | YOU-1 | a coarse manipulator is enough to bring the puffing electrode close to the recording site |
| tubings | N/A | tygon tubing to bring the pressure from the puffer to the puffing pipette | |
| solutions/perfusion/chemicals | |||
| vacuum pump | gardner denver | 300 series | a vibrating membrane pump is more quiet and efficient than other types of pumps |
| perfusion system | N/A | N/A | gravity perfusion system with polyethlylen tubing to bring in and out the external solution from the recording chamber |
| nystatin | Sigma-Aldrich | N3503 | mandatory to perpare internal solution for perforated patch clamp |
| DIMETHYL SULFOXIDE | Sigma-Aldrich | D5879 | used to disolve nystatin for internal solution for perforated patch |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | extracellular solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | intracellular/extracellular solution |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | extracellular solution |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S9638 | extracellular solution |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4 7H2O) | Sigma-Aldrich | 63140 | extracellular solution |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | extracellular solution |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | extracellular solution |
| EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) | Sigma-Aldrich | E3889 | internal solution |
| Potassium hydroxyde | Sigma-Aldrich | P1767 | internal solution |
| Methyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | W387509 | intracellular solution |
| Hepes-Na | Sigma-Aldrich | H7006 | intracellular solution |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | intracellular solution |
References
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