Abstract
Analysere de fysiologiske responser av olfactory sensoriske nevroner (OSN) når stimulert med spesifikke ligander er avgjørende for å forstå grunnlaget for duftdrevet atferd og deres modulering. Disse kode egenskaper avhenge sterkt på det første samspillet mellom luktmolekyler og lukte reseptor (OR) uttrykt i OSNs. Identiteten, spesifisitet og ligand spekteret av uttrykte eller er kritisk. Sannsynligheten for å finne den ligand med eller uttrykt i et OSN velges vilkårlig i epitelet er meget lav. For å løse denne utfordringen, bruker denne protokoll genetisk kodede mus som uttrykker den fluorescerende protein GFP under kontroll av promotoren av definerte ORs. OSNs ligger i en tett og organisert epitel fôr nesehulen, med nabocellene påvirke deres modning og funksjon. Her beskriver vi en metode for å isolere et intakt lukteepitelet og spille gjennom patch-clamp opptak egenskapene OSNs expressing definerte odorantreseptorer. Protokollen gjør det mulig å karakterisere egenskapene OSN membran samtidig påvirkning av de nærliggende vev. Analyse av patch-clamp resultatene gir en nøyaktig kvantifisering av ligand / eller interaksjoner, overføringsveier og farmakologi, OSNs 'koding egenskaper og deres modulasjon på membranen nivå.
Introduction
Olfactory sensoriske nevroner (OSN) representerer første trinn i olfactory oppfatning. Ligger i lukteepitelet fôr nesehulen hos gnagere, de transformere den kjemiske informasjonen odoranter til aksjonspotensialer sendt gjennom sitt axon til hjernen. For bedre å forstå olfactory koding mekanismer, er det nødvendig å karakterisere transduksjon og membran egenskapene OSNs. Inntil nylig, ble de fleste av teknikkene som brukes for å karakterisere egenskapene til pattedyr OSNs utført på dissosiert OSNs 1-4. Dissosiasjon prosessen bruker ulike mekaniske og kjemiske (dvs. enzymer) prosesser for å frigjøre OSNs fra deres miljø. Disse prosessene indusere et lavt antall ledige celler for opptak. Det lave antallet kan være enda mer kritisk når det gjelder GFP merkede celler. Dissosiasjon fjerner også den lokale celle-til-celle-interaksjoner mellom OSNs og andre celler i det olfaktoriske epitel som kan forsterke survival og modulering av OSNs 'egenskaper. For å omgå dissosiasjonen fremgangsmåte ble en intakt forberedelse utviklet 5.
Hver OSN uttrykker en olfaktorisk reseptor (OR) valgt fra et stort multigen familie 6. Det er ~ 1000 ORs uttrykt i hoved olfaktoriske epitel hos mus. På grunn av det store antallet av eller i villtype dyr, er sjansene for å registrere OSNs som uttrykker det samme eller er meget lav. For å overvinne disse begrensningene, Gene målrettet mus finnes der alle OSNs uttrykker en identifisert eller er merket med et fluorescent protein 7-9. Disse merkede OSNs ble brukt for å gjøre funksjonsanalyse i dissosierte preparater 7,10,11 med de ulemper som er nevnt tidligere. En intakt epitel forberedelse 5 fra genetisk merkede mus omgår derfor disse problemene. Den tillater overvåking av aktiviteten av OSNs uttrykker nøyaktig definerte ORs i et miljø som i nærheten av i VIvo som mulig. Dessuten patch-clamp opptak av OSNs også tillate presis analyse av membranegenskaper, transduksjon pathway farmakologi, ligand / eller interaksjoner. Alle disse temaene kan neppe bli analysert ved hjelp av ekstracellulære opptak. Vi brukte denne teknikken til å overvåke svarene til OSNs uttrykker odorantreseptorer SR1 og MOR23 12,13. Gjennomførbarheten av teknikken ble bekreftet av andre grupper på MOR23 uttrykker OSNs 14 samt på andre ORs uttrykker nevroner 15,16. Overvåkingen av en definert populasjon av OSNs kan føre til analyse av deres egenskaper i mange ulike sammenhenger som for eksempel utvikling 14, aldring 17, odorant indusert plastisitet 18, og rollen til variasjoner i odoranten reseptoren sekvens i lukt kodende 15. Denne protokollen gir således et kraftig verktøy for å overvåke de funksjonelle egenskaper som er definert OSNs på membrannivå.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen følger retningslinjene fra Université de Bourgogne dyr pleie og ble godkjent av Université de Bourgogne etikkomité.
1. Dyr
- Bruk genmanipulerte OR-IRES-tauGFP mus tilgjengelige på Jackson Laboratory. Disse musene ble utviklet i Dr. Peter Mombaerts 'laboratorium for å analysere axon målretting og utvikling av luktesystemet 19. For eksempel MOR23-IRES-tauGFP linje, lager nummer 006643, bærer det offisielle belastningen navn B6; 129P2- Olfr16 tm2Mom / MomJ; Tilsvarende SR1-IRES-tauGFP linje, lager nummer 6717 bærer det offisielle navnet B6; 129P2- Olfr124 tm1Mom / MomJ.
- Når det gjelder alder av dyrene: for et bedre resultat av protokollen, bruke dyr mellom 2 og 4 ukers alder. I denne aldersgruppen er disseksjon enklere (mykere bein, fastere olfactory epitel) og dendrittiske knotter er bigger sammenligne med eldre dyr.
2. Utarbeidelse av elektroder og løsninger
- For de stimulerende pipetter: kjøp prepulled stimulerende pipetter. Ellers manuelt forberede dem.
- Ved hjelp av en flamme, bøy seks 1 mm glass pipetter på ca 1 cm fra spissen. Sett disse seks pipetter pluss en straight 7 th i 1,5 cm varmekrymperør styrke ved et øye.
- Varme krympe røret for å opprettholde fat festet sammen. Fest en ekstra varmekrympeslange til den andre enden av tønnene. Trekk av denne stimulerende pipette med en multi-fat avtrekker.
- Legg litt hvit væske lim rundt bøylen for å styrke den bøyde tips. La tørke O / N.
- Tilbered en eller to liter normal Ringers ekstracellulær løsning (i mM: NaCl 124, KCl 3, MgSO4 1,3, CaCl2 2, NaHCO3 26, NaH 2PO 4 1,25, glukose 15, pH 7,6 og 305 mOsm). Hold ved 4 ° Cinntil bruk.
- Forbered intracellulær stamløsning (i mM): KCl 70, 53 KOH, metansulfonsyre 30, EGTA 5, HEPES 10, 70 sukrose; pH 7,2 (KOH) og 310 mOsm. Hold ved 4 ° C inntil bruk. God i flere uker.
- Forbered intracellulær opptaksløsning med nystatin extemporaneously (i siste minutt) før eksperimentet.
- Vei 3 mg nystatin, tilsett 50 mL av DMSO; vortex 20 sek da sonicate 2-3 min før helt utvannet.
- Tilsett 20 ul DMSO-nystatin-oppløsning i 5 ml stamløsning intracellulær. Vortex 20 sek, deretter sonicate 3 min. Hold denne løsningen ved 4 ° C og beskyttes mot direkte lys, er nystatin lysømfintlig. Denne løsningen kan brukes i noen timer. Bytt ut hver dag.
- Når det olfaktoriske epitel preparatet er under mikroskopet, kan noe av denne oppløsning i en 1 ml sprøyte med en langstrakt flamme-gul spissen for å fylle elektrodene; beskyttes mot direkte lys. Når på RT, den nystatin løsninger ikke stabil; erstatte oppløsningen i 1 ml sprøyte hver time eller holde den i is.
- Trekk opptak elektroder med en avtrekker for å få lang hals og lite tips (~ 2 mikrometer) med en motstand på 15-20 Megohm med den interne nystatin løsning.
- Forbered odoranten løsning på 0,5 M i DMSO henhold avtrekkshette; alikvot og holde ved -20 ° C inntil bruk. Fortynn odorant i Ringer-oppløsning inntil den ønskede konsentrasjon. Fyll stimulerende pipette.
3. Utarbeidelse av lukteepitelet
Merk: OR-IRES-tauGFP mus uttrykker tauGFP under kontroll av OR-promoteren. I disse musene, er alle neuroner som uttrykker eller interesse merket med GFP. Denne protokollen er tilpasset for ORs uttrykt i alle soner. Men disseksjoner og innspillinger er lettere for ORs uttrykt i ryggsonen.
- Bedøve dyret ved å injisere en blanding av ketamin og xylazin (150 mg / kg og 10 mg / kg BODy vekt, henholdsvis). Halshogging kan utføres med skarp saks for små mus eller med en skikkelig vedlikeholdt gnager giljotin for eldre mus.
- Ved hjelp av ring disseksjonssaksen lage en langsgående midtre snitt gjennom rygghuden. Fjern skinnet ved å trekke den fra hverandre. Ved hjelp av saks, klippe underkjeven på kjeven felles. Fjern de øvre fortennene av en coronal kutt parallelt med tennene.
- Lag en coronal kutt av hodet bak øynene og holde bare fremre del av hodet. Dyppe den i iskaldt Ringer løsning for disseksjon under virkeområdet.
- Dissekere under omfang i ventral side, gjør et langsgående snitt langs overkjeven / tennene. Kutt de dorsale ben i lengderetningen, som følge av dorso-lateral side av nesehulen. Fjern de fleste bein og gane; overføre septum og epitelet er festet til den i oksygenert Ringer ved RT.
- For den endelige disseksjon: Rett før du starter innspillingensesjon, skrelle bort epitel fra den underliggende septum med pinsett. Ta av epitel med pinsett og med to 4-5 mm sakse kutt (bruk microvannas saks) på fremre del av skilleveggen hvor adhesjonen er sterkere.
- Fjerne VNO nøye ved å kutte det ut langs rygg tilkobling til septal epitel. Overfør epitel til en innspilling kammer med slimlaget vendt opp; holde den flat i kammeret med en harpe.
- Installer kammer under en oppreist mikroskop utstyrt med fluorescens optikk og et følsomt kamera. Visual forberedelse på dataskjermen ved høy forstørrelse gjennom en 40X vann-nedsenking objektiv (numerisk apertur 0,8) og en ekstra 2X eller 4X forstørrelse oppnås ved et forstørrelsesglass. Perfuse kontinuerlig oksygenert med Ringer ved romtemperatur (1-2 ml / min).
4. Opptak Session
- Søk etter fluorescerende cell: opphisse forberedelse på 480nm for EGFP, som avgir lys i 530-550 nm range; målrette en dendrittiske knotten som er pålitelig synlig i fluorescens og under lyse felt.
- Fyll elektrode med intracellulære løsning med nystatin; fjerne bobler ved å banke på elektroden.
- Sett elektrode på elektrodeholderen, anvende positivt trykk i pipetten; Motstand bør være 15-20 Megohm.
- Bringe elektroden i nærheten av cellen; gang motstand når ~ 40 Megohm, slipper positivt trykk og påfør litt negativt press for å nå et gigaseal.
- Når forseglingen er nådd, setter membranpotensiale på ca -75 mV;
- Når cellen er åpnet, fortsetter med stimuleringsregimer, farmakologiske behandlinger. For å måle responsen til en enkel odorant stimulering, registrering 200-500 ms av spontan aktivitet, stimulere til 500 msek og måle responsen av cellen opp til 10 sek 13. For farmakologisk behandling, perfuse de farmakologiske midler påden ønskede konsentrasjon 20.
5. Data Analysis
- Analyser strømmer fremkalt av odorant stimulering som følger: den maksimale amplitude, stige-tid (tiden som er nødvendig for å nå 90% av den maksimale amplitude, i millisekunder), idet den totale strøm (arealet under kurven i Pas), tidspunktet på 50% (tid mellom begynnelsen og forskyvningen av responsen til 50% av den maksimale amplitude, i millisekunder).
- Ved hjelp av topp transduksjon strømmene (maksimal amplitude oppnådd) ved forskjellige konsentrasjoner, tegne og passe til en doseresponskurve ved hjelp av Hill-ligningen: I = Imax / (1 + (K 1/2 / C) n), der I representerer den toppstrøm , Imax den maksimale respons ved mettende konsentrasjoner 1 r / 2 den konsentrasjon ved hvilken halvparten av maksimal respons ble oppnådd, C er konsentrasjonen av odorant og n Hill koeffisient.
- Analysere opptak av membranpotensialet i strømtang for maksimal depolarization, den total potensielt fremkalte (arealet under kurven i mVsec); posten spontan spiking aktivitet over 30 sek til 1 min innspillinger; posten eksitabilitet gjennom toppene oppstår ved injeksjon av strømmer (5-10 PA).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utfallet av denne protokollen er avhengig av kvaliteten på disseksjon. Dette disseksjon trinn må være korte (mindre enn 10 til 15 minutter) og presis (dvs. for å unngå skader av epitelet). Den Figur 1 viser hvordan en ideell forberedelse ser ut på forskjellige forstørrelsesnivåer. Til en lav forstørrelse i sterkt felt de ulike celletyper (for eksempel knotter av OSNs, støtte celler) er gjenkjennelig (figur 1A). På det høyeste forstørrelsesnivå, typisk 80X til 160X, i lyse feltet, dendrittiske knotter av OSNs bør være klart kan skilles fra støtte celler (Figur 1b). Under fluorescerende lys, bare de dendrittiske knotter og flimmerhårene av GFP merkede cellene er synlig (figur 1C). Ved å sammenligne de to bildene, kan de merkede cellene bli kontaktet med innspillingen pipette (figur 1D).
Temperaturen av disseksjon såning og timing av disseksjon er kritiske. Den første delen av disseksjon, bør fremstillingen av skilleveggen (avsnitt 3.1.1 til 3.2) finner sted i løpet av 5 til 10 minutter i is-kald løsning. Den endelige disseksjon (3,3) skal vare i mindre enn 5 min ved romtemperatur. I tilfelle disseksjon varte lenge, eller ble utført i disseksjon løsning for varm, fremstillingen alltid ser hurtig ødelagt: dendrittiske knotter flyter over overflaten av epitelet, og ligner døde celler.
Når en tetning er oppnådd, og cellen åpnes under virkningene av nystatin, kan typiske spennings gated strømmene bli observert (figur 2A). Formen og egenskapene til disse strømmene kan brukes til å overvåke tilstanden av cellen: i en celle dør eller hvis forseglingen kvalitet avtar, vil disse strømmene 'amplitude reduseres. Under dagens klemme konfigurasjon, kan aksjonspotensialer registreres enten spontant (figur 2B) eller ved injeksjon av et depolariserende strøm (figur 2C). Skytingen egenskaper indusert av dagens injeksjon karakteriserer oppstemthet av den innspilte nervecellen. Excitability av ulike OSNs 'befolkning kan sammenliknes (med klassisk frekvens og ISI beregninger).
En multibarrel pipette lastet med forskjellige luktstoffer og / eller forskjellige konsentrasjoner av luktstoffer kan brukes til å stimulere cellene av trykk utstøting. Dette gjør det mulig å måle odoranten induserte responser. De luktstoffer og konsentrasjonene må velges avhengig av eller uttrykt i cellen av interesse, for eksempel Lyral er liganden for MOR23, acetofenon for M71, eugenol for mOREG. I forsøket som er vist på figur 3, de registrerte MOR23-IRES-tauEGFP nevroner svarte til forskjellige konsentrasjoner av Lyral, en ligand for MOR23, i henhold til gjeldende klemme modus (figur 3A), eller i henhold til spenningsklemmen modus (Figure 3B). I spennings klemme modus opptak, kan ulike egenskaper overvåkes for å kvantifisere respons (maks amplitude, stige-tid, total nåværende fremkalte, osv.) Som utførte klassisk i elektrofysiologi. Ved hjelp av den maksimale amplitude av odoranten-indusert respons, kan dose-respons blir plottet og monteres ved hjelp av Hill-ligningen. Disse resultatene gir informasjon om koding egenskapene til hver OSN: deteksjonsgrensen, time dynamiske, dynamisk område og metning nivå. Eksempler på doseresponskurver er vist på figur 3C. Alle disse detaljene kan sammenlignes mellom enkelt OSNs å måle potensialet heterogenitet innen en befolkning; De kan også sammenlignes mellom OSNs med eller uten anvendelse av en behandling for å måle potensialet modulasjon og plastisitet.
Figur 1: Representative bilder av en sunn preparat (A) Intakt olfaktoriske epitel ekstrahert fra det nasale hulrom til et SR1-IRES-tauGFP transgen mus observert i sterkt felt stand ved 40X forstørrelse.. OSN dendrittiske knotter (svart pil hoder) er omsluttet av en maske av støtte celler (SC) og Bowman kjertler (BG). (B) Dendritic knotter av SR1 uttrykke OSNs observert under lyse felt tilstand (hvit og rød pil hoder). (C) Det samme felt som i (B) under fluorescerende lys som viser dendrittiske knotter av SR1 uttrykker OSNs. (D) Opptak pipette nærmer seg en SR1-uttrykke OSN i sterkt felt. Den røde pilspiss representerer den samme SR1 OSN i (B - D). Skala: 5 mikrometer.
Figur 2: Representative membranens egenskaper resultatene oppnådd med protokoll:. Patch-clamp opptak på dendrittiske knute av et SR1-IRES-tauGFP OSN (A) Spenning gated strømmer fremkalt ved å øke depolariserende trinn fra membranpotensial -67 mV til +40 mV. (B) Spontan aktivitet registrert i strømtang konfigurasjon; aksjonspotensialer kan observeres i løpet av 15 sek opptak epoke. (C) aksjonspotensialer fremkalt av en 7 pA eksitatorisk strøm; denne protokollen gir informasjon om oppstemthet av cellen.
Figur 3:. Representative eksempler på odorant-induserte responser i en MOR23-IRES-tauEGFP neuron økende konsentrasjoner av Lyral, en ligand med MOR23 reseptoren, indusere økt responser både i strømtangen (A) og i spenningsklemme (B). Den membranpotensialet ble festet ved -67 mV. (C) Eksempler på enkeltdoseresponskurver overtatt tre M71 neuroner som respons på økende konsentrasjoner av acetofenon og utstyrt med Hill-ligningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Muligheten av denne protokollen til riktig overvåke egenskapene til sunne OSNs er svært avhengig av kvaliteten på forberedelse. Derfor er de trinnene disseksjon er kritiske. Først er det viktig å ta hensyn til kvaliteten (pH, osmolaritet) oksygenering og temperatur (is-kald, men ikke frosset) av disseksjon medium. For det andre må manipulering av epitel med dissekere verktøy være så begrenset som mulig for å unngå skader. Endelig, er det avgjørende å oppnå et preparat så flat som mulig for å få tilgang til den største OSN populasjonen som mulig.
Disseksjon Kvaliteten er avgjørende for å oppnå en sunn preparat. Imidlertid kan forskjellige metoder anvendes for disseksjon: her presenterer vi en ventral til dorsal disseksjon men noen brukere kan foretrekke å starte disseksjon dorsalt til å åpne nesehulen hurtig og ha en rask tilgang til septal utsparing det olfaktoriske epitel. Hver bruker kan dermed tilpasse protocol for den mest effektive strategi for å oppnå en sunn fremstilling av det interessante området.
Når preparatet er under mikroskopet, er permanent overvåking av preparatet helse nødvendig. Faktisk fører en usunn forberedelse til en lav sannsynlighet for å nå et gigaseal. En lav effektivitet i å skaffe gigaseals kan forbedres ved å endre området av interesse om utarbeidelse for å finne sunnere OSNs. En mer drastisk løsning er å erstatte preparatet i sin helhet av en ny. Når tetningen er nådd, til en lav sannsynlighet kommer til "åpne" tilstand kan finne sted. Dette kan være på grunn av den interne løsningens kvalitet. Den interne oppløsningen må fremstilles like før forsøket. Bruken av virvelen og sonikering er kritisk, siden oppløseligheten av Nystatin er heller lav. For å forbedre sannsynligheten for åpningen, bør den indre oppløsningen igjen vortex-blandet i 10 sekunder og deretter ultralydbehandlet i 30 til 60 sek. Dette usually forbedrer effektiviteten av cellen åpningen.
For å stimulere den innspilte OSN med odoranter, protokollen present bruker en 7 fat stimulerende pipette. Denne type pipette innebærer en begrensning i antall odoranter og / eller konsentrasjon av odoranter testet på hver registrert celler til syv. Denne begrensningen er relativt ikke signifikant i tilfelle av en doseresponskurve siden det kan dekke opp til 7 log enheter av konsentrasjon. Imidlertid, i tilfelle av screeningeksperimenter, hvor ulike odoranter er testet, kan en syv fat pipette viser begrensninger. I screening eksperimenter, er målet å finne en ligand for merket OSNs uttrykker en foreldreløs ELLER. Ved hjelp av denne protokollen vil kreve bruk av odorant blandinger. Hver blanding fremskaffe en respons blir deretter oppdelt i enkelt odoranter. Dette ble gjort for å skjerme amin odoranter på Taar uttrykke OSNs 16. I disse eksperimentene, de fluorescerende neurons uttrykt TAAR og liganden var unknown. Ved anvendelse av protokollen, kan forfatterne screene flere titalls amin odoranter i blandinger. Blandingene med å utløse en respons ble deretter brutt ned til enkelt odoranter for å finne den mest effektive ligand.
Avstanden mellom opptaksstedet og stimulerende pipette bør velges med omhu for å minimalisere den mekaniske stimuleringen av cellen 20. Hvis trykket er for høyt (over 30 psi i våre opptaksforhold) og / eller avstanden for liten (under 20 pm), kan den mekaniske responsen i noen OSNs selv maskere odoranten respons. Trykk og avstanden mellom puffing pipette og opptaks nettstedet er også avgjørende for å kontrollere løsning utveksling i stimulering. Konsentrasjonen nå neuron ble evaluert til å være så nær som mulig til konsentrasjonen som er tilstede i pipette gjennom en serie av tester 13. Disse testene anvendes en løsning farget med blått fargestoff til å måle utbruddet og forskyvning av than stimulering. Ved hjelp av 20 psi trykk og 30 um avstand, ble den maksimale intensitet av stimulus nås i løpet av 300 msek. Forskyvningen av stimulus ble også nøye evaluert: ettersom preparatet er under kontinuerlig strøm av perfusert løsning ble stimulus vasket ut innenfor 0,8 til 0,9 sek 13.
Lukt koding egenskapene OSNs ble historisk målt enten gjennom ekstracellulære opptak i vivo eller gjennom eksperimenter på isolerte celler. I pattedyr, ble ekstracellulære registreringer utført ved først in vivo i rotter 21. I ekstracellulære opptak, OR uttrykt i den innspilte celle er ukjent og dermed begrense funnrate for å finne en celle reagerer på odoranten testet. Protokollen muliggjør opptak og karakterisering av definerte reseptorer i nerveceller i den cellulære miljø av epitel. Reseptorene 'egenskaper kan derfor analyseres på ulike nivåer: den spesifikke ligand/ eller interaksjoner i løpet av det første trinnet i reaksjonsveien transduksjon; Følgelig agonist / antagonist-interaksjoner av forskjellige ligander testet; egenskapene til blandingene integrering av definerte ORs og rollen til transduksjon veien for OSNs 'spesifisitet; innflytelse på olfactory koding av celle-til-celle interaksjoner (for eksempel gap junction) i epitelet; og til slutt modulering av transduksjon veien ved hjelp av farmakologiske midler.
I de dissosierte celleopptak, som nevnt tidligere, fjerner dissosiasjon prosessen mucus og celle-til-celle-interaksjoner i det olfaktoriske epitel. Dette kan forårsake forandringer i de kodende egenskapene til OSNs. Ble hyppigst rapporterte kalsium bildebehandling eksperimenter på isolerte celler. For eksempel, ble dose-respons kurver av M71 uttrykke OSNs i respons til acetofenon rapportert 7. Disse doseresponskurver er brattere enn dose-respons-kurver ble oppnådd ved anvendelse av protokollenpresenteres her fire. Disse avvik kan skyldes at celle-til-celle-interaksjoner i den intakte preparatet og også for fjerning av slim i isolerte celler. Slim er kjent for å inneholde mange proteiner og enzymer involvert i perireceptor hendelser grunnleggende for lukte transduksjon 22,23. I protokollen angitt her, bevaring av strukturen av det olfaktoriske epitel og den antatte tilstedeværelse av slim bidrar til å bevare de opprinnelige trekk ved odorant koding i OSNs. Konsentrasjonene anvendt i protokollen, er angitt i mol / l, og vanligvis er i 10 -7 -10 -3 rekkevidde. Disse konsentrasjonene er høyere enn konsentrasjoner brukes i luft faset opptak (enten i lokale feltet potensial eller ekstracellulære opptak). Disse avvik kan skyldes i) den flytende fasen av opptakene (og derfor av stimuleringen) og ii) den langsomme utvasking av slim ved perfusjon under opptak. Faktisk, utvasking av mucoss og den delen av de OSNs 'axoner under disseksjon kan støtte at preparatet present være potensielt kvalifisert som en "pseudo-intakt" heller enn en "fullt intakt" forberedelse. Dette preparatet representerer imidlertid opptaksforhold så nær in vivo som mulig og likevel med å utløse patch-clamp opptak. Som ethvert in vitro preparat fra en pattedyrorganisme, forblir overlevelsestidsbegrenset. Denne grensen kan være på grunn av utvasking av slim, den delen av OSNs 'axoner, så vel som fravær av blodsirkulasjonen i preparatet.
Protokollen presenteres her gjør det mulig å ta opp membranegenskaper av olfactory sensoriske nerveceller. Denne teknikken kan ha flere programmer, for eksempel analyse av membran egenskapene OSNs, farmakologiske undersøkelser av OSNs, modulering av odorant koding egenskapene OSNs og deorphanization av ORS. Hendelsene er tatt under kalsium bildebehandling er Slow og langvarig. Patch-clamp opptak i protokoll fører til data om raske hendelser i lukte transduksjon pathway på membranen nivå.
Opptakene presentert her er utført i patch-clamp-konfigurasjon. I denne konfigurasjonen, kan membranens egenskaper av den registrerte celle bli analysert, enten det er det olfaktoriske transduksjon pathway maskineri eller spennings gated strømmene som er involvert. Eksperimenter ved bruk av denne protokollen kan gi informasjon om modulasjonen av odoranten koding egenskaper av OSNs. Farmakologiske midler kan anvendes for å undersøke olfactory transduksjon i forskjellige forhold, for eksempel kan MDL12330A, en blokkering av adenylatsyklase III (ACIII) 24,25 skal anvendes ved perfusjon løsningen for å undersøke rollen til ACIII i en odorant respons. I tillegg kan denne protokollen brukes til å undersøke hvordan lukte koding egenskaper er modulert på forskjellige forhold som lukte miljø <sup> 18 eller under påvirkning av hormoner som er involvert i fôring atferd 26. Endelig kan denne protokollen også føre til data om OR / ligand samhandling og tyde agonist / antagonist aktiviteter på definerte ORs eller i tilfeldig valgte reseptorer 27.
Til slutt, med de begrensninger som følge av sylinderen 7 stimulerende pipette, denne protokollen kan også brukes til deorphanizing ORs. Som nevnt tidligere, i dette tilfellet, kan flere odorant blandinger skal testes. Blandinger med å utløse en reaksjon bør da være oppdelt i enkelt odoranter testet på andre celler.
Ved å målrette OSNs uttrykke definerte ORs, gir denne protokollen kraftige data om ORS, ligander / ORS interaksjoner, transduksjon pathway egenskaper og sammenligne egenskapene til definerte populasjoner av OSNs i ulike forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| vibration table with Faraday cage | TMC | 63-500 SERIES | required : isolates the recording system from vibrations induced by the environment (movements of experimenter, vibrations of equipment such as fans for cooling computers, etc); can also be purchased with a Faraday cage, or equipped by a custom made Faraday cage; this cage is recommended to avoid electric noise from the environment |
| optics | |||
| microscope | Olympus | BX51WI | upright microcope equipped with epifluorescence; fixed or moving stage depending on the user's preference |
| objectives | Olympus | LUMPLFL40XW | at least 2 objectives required: a 4X or 10X for coarse approach to the cell; and a 40X immersion long distance example Olympus LUMPLFL40XW / IR /0,8 / WD:3.3 MM |
| magnifier | Olympus | U-TVCAC | ABSOLUTELY REQUIRED: placed in the light path between the objective and the camera; allows to magnify the image on the screen in order to reach precisely the knob with the recording electrode |
| camera | Olympus | DP72 | a good camera is required to see the neurons in fluorescence as well as in bright field; the controlling software is simple and allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell. An ultrasensitive camera is not necessary |
| filters | Olympus/Chroma | depending on the fluorescent protein used in the mice; example for GFP: excitation : BP460-490: emission: HQ530/50m | |
| amplifier | HEKA | EPC10 USB | monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the puffing by sending a TTL signal to the spritzer; the EPC10 setup is controled by computer |
| software | HEKA | Patchmaster | controls the amplifier during the experiment |
| micromanipulator | Sutter | MP225 | precision micromanipulator, allows precise movements down to 1/10th of a micrometer; this model is very stable; avoid hydraulic manipulators that may drift |
| electrode puller | Sutter | P97 | with a FT345-B wide trough filament; to prepare recording pipets of about 2µm diameter with a long tip to reach the cells; the resistance should be 15 to 20Mohm with perforated patch clamp solution |
| glass | Sutter | BF120-69-10 | in our recording conditions, this glass is ideal for recording pipets |
| recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | a chamber is needed to set the preparation under the microscope. To maintain the preparation in the center of the chamber, a net/anchor should be used. |
| stimulation | |||
| glass | WPI | TW100F-4 | attached in groups of 7, these pipettes are used to prepare prepulled stimulating pipettes |
| multibarrel puller | MDI | PMP-107-Z | by association of pull and twist, this puller allows us to prepare puffing electrodes with 7 barrels |
| precision pressure injector | Toohey Company | P/N T25-1-900 Single Channel | this precision pressure injector controls the pressure ejected in the multibarrel puller; it is controlled manually or by the amplifier by a 5V TTLs |
| micromanipulator | Narishige | YOU-1 | a coarse manipulator is enough to bring the puffing electrode close to the recording site |
| tubings | N/A | tygon tubing to bring the pressure from the puffer to the puffing pipette | |
| solutions/perfusion/chemicals | |||
| vacuum pump | gardner denver | 300 series | a vibrating membrane pump is more quiet and efficient than other types of pumps |
| perfusion system | N/A | N/A | gravity perfusion system with polyethlylen tubing to bring in and out the external solution from the recording chamber |
| nystatin | Sigma-Aldrich | N3503 | mandatory to perpare internal solution for perforated patch clamp |
| DIMETHYL SULFOXIDE | Sigma-Aldrich | D5879 | used to disolve nystatin for internal solution for perforated patch |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | extracellular solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | intracellular/extracellular solution |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | extracellular solution |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S9638 | extracellular solution |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4 7H2O) | Sigma-Aldrich | 63140 | extracellular solution |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | extracellular solution |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | extracellular solution |
| EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) | Sigma-Aldrich | E3889 | internal solution |
| Potassium hydroxyde | Sigma-Aldrich | P1767 | internal solution |
| Methyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | W387509 | intracellular solution |
| Hepes-Na | Sigma-Aldrich | H7006 | intracellular solution |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | intracellular solution |
References
- Lowe, G., Gold, G. H. Nonlinear amplification by calcium-dependent chloride channels in olfactory receptor cells. Nature. 366 (6452), 283-286 (1993).
- Ponissery Saidu, S., Dibattista, M., Matthews, H. R. Odorant-induced responses recorded from olfactory receptor neurons using the suction pipette technique. J Vis Exp. (62), e3862 (2012).
- Moss, R. L., et al. Electrophysiological and biochemical responses of mouse vomeronasal receptor cells to urine-derived compounds: possible mechanism of action. Chem Senses. 23 (4), 483-489 (1998).
- Kaur, A., Dey, S. Live cell calcium imaging of dissociated vomeronasal neurons. Methods Mol Biol. 1068, 189-200 (2013).
- Ma, M., Chen, W. R. Electrophysiological characterization of rat and mouse olfactory receptor neurons from an intact epithelial preparation. J Neurosci Methods. 92 (1-2), 31-40 (1999).
- Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C. Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system. J Neurosci. 22 (8), 3033-3043 (2002).
- Bozza, T., et al. Mapping of class I and class II odorant receptors to glomerular domains by two distinct types of olfactory sensory neurons in the mouse. Neuron. 61 (2), 220-233 (2009).
- Vassalli, A., Rothman, A., Feinstein, P., Zapotocky, M. Minigenes impart odorant receptor-specific axon guidance in the olfactory bulb. Neuron. 35 (4), 681-696 (2002).
- Feinstein, P., Bozza, T., Rodriguez, I., Vassalli, A. Axon guidance of mouse olfactory sensory neurons by odorant receptors and the beta2 adrenergic receptor. Cell. 117 (6), 833-846 (2004).
- Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat Rev Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).
- Grosmaitre, X., et al. SR1, a mouse odorant receptor with an unusually broad response profile. J Neurosci. 29 (46), 14545-14552 (2009).
- Grosmaitre, X., Vassalli, A., Mombaerts, P., Shepherd, G. M. Odorant responses of olfactory sensory neurons expressing the odorant receptor MOR23: a patch clamp analysis in gene-targeted mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (6), 1970-1975 (2006).
- Lam, R. S. Odorant responsiveness of embryonic mouse olfactory sensory neurons expressing the odorant receptors S1 or MOR23. Eur J Neurosci. 38 (2), 2210-2217 (2013).
- Zhang, J., Huang, G., Dewan, A., Feinstein, P. Uncoupling stimulus specificity and glomerular position in the mouse olfactory system. Mol Cell Neurosci. 51 (3-4), 79-88 (2012).
- Zhang, J., Pacifico, R., Cawley, D., Feinstein, P. Ultrasensitive detection of amines by a trace amine-associated receptor. J Neurosci. 33 (7), 3228-3239 (2013).
- Lee, A. C., Tian, H., Grosmaitre, X. Expression patterns of odorant receptors and response properties of olfactory sensory neurons in aged mice. Chem Senses. 34 (8), 695-703 (2009).
- Cadiou, H., et al. Postnatal odorant exposure induces peripheral olfactory plasticity at the cellular level. J Neurosci. 34 (14), 4857-4870 (2014).
- Mombaerts, P. Axonal wiring in the mouse olfactory system. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 713-737 (2006).
- Grosmaitre, X., Santarelli, L. C., Tan, J., Luo, M. Dual functions of mammalian olfactory sensory neurons as odor detectors and mechanical sensors. Nat Neurosci. 10 (3), 348-354 (2007).
- Duchamp-Viret, P., Chaput, M. A. Odor response properties of rat olfactory receptor neurons. Science. 284 (5423), 2171-2174 (1999).
- Heydel, J. M., et al. Odorant-binding proteins and xenobiotic metabolizing enzymes: implications in olfactory perireceptor events. Anat Rec (Hoboken). 296 (9), 1333-1345 (2013).
- Pelosi, P. Perireceptor events in olfaction). J Neurobiol. 30 (1), 3-19 (1996).
- Spehr, M., Wetzel, C. H., Hatt, H. 3-phosphoinositides modulate cyclic nucleotide signaling in olfactory receptor neurons. Neuron. 33, 731-739 (2002).
- Chen, S., Lane, A. P., Bock, R., Leinders-Zufall, T. Blocking adenylyl cyclase inhibits olfactory generator currents induced by 'IP(3)-odors. J Neurophysiol. 84 (1), 575-580 (2000).
- Savigner, A., et al. Modulation of spontaneous and odorant-evoked activity of rat olfactory sensory neurons by two anorectic peptides, insulin and leptin. J Neurophysiol. 101 (6), 2898-2906 (2009).
- Ukhanov, K., Brunert, D., Corey, E. A. Phosphoinositide 3-kinase-dependent antagonism in mammalian olfactory receptor neurons. J Neurosci. 31 (1), 273-280 (2011).
