Abstract
Analysera fysiologiska reaktioner av luktsinnet sensoriska neuroner (OSN) när de stimuleras med specifika ligander är viktigt att förstå grunden för lukt drivna beteenden och deras modulering. Dessa kodnings egenskaper är starkt beroende av den initiala interaktionen mellan luktmolekylerna och luktreceptor (OR) uttryckt i OSN. Identiteten, specificitet och ligand spektrum av uttryckta eller är kritiska. Sannolikheten att hitta liganden i eller uttryckas i en OSN väljs slumpmässigt inom epitelet är mycket låg. För att möta denna utmaning, använder detta protokoll genetiskt märkta möss som uttrycker det fluorescerande proteinet GFP under kontroll av promotorn definierade yttersta randområdena. OSN ligger i en tät och organiserad epitel foder näshålan, med angränsande celler påverkar deras mognad och funktion. Här beskriver vi en metod för att isolera en intakt luktepitel och registrera genom patch-clamp inspelningar egenskaperna hos OSN expressing definierade luktreceptorer. Protokollet gör att man kan karakterisera OSN membranegenskaper samtidigt som påverkan av den angränsande vävnaden. Analys av patch-clamp resultat ger en exakt kvantifiering av ligand / eller interaktioner, överföringsvägar och farmakologi, OSN "kodnings egenskaper och deras modulering på membrannivå.
Introduction
Olfactory sensoriska neuroner (OSN) utgör det första steget av luktintrycket. Beläget i luktepitel foder näshålan hos gnagare, de omvandla kemisk information om doftämnen i aktionspotentialer skickas via deras axon till hjärnan. För att bättre förstå de olfaktoriska kodningsmekanismer, är det nödvändigt att karakterisera de transduktion och membranegenskaperna hos OSN. Tills nyligen har de flesta av de tekniker som används för att karakterisera egenskaperna hos däggdjurs OSN utfördes på dissocierad OSN 1-4. Den dissociation processen använder olika mekaniska och kemiska (dvs enzymer) processer för att befria OSN från sin omgivning. Dessa processer inducerar ett lågt antal tillgängliga celler för inspelningar. Detta låga antal kan vara ännu mer kritiskt i fallet med GFP-märkta celler. Dissociation tar också bort den lokala cell-till-cell-interaktioner mellan OSN och andra celler av det olfaktoriska epitelet som kan förstärka survival och modulering av OSN "egenskaper. För att kringgå dissociation förfarandet, var en intakt preparat utvecklat 5.
Varje OSN uttrycker en luktreceptor (OR) väljs från en stor multigenfamilj 6. Det finns ~ 1000 yttersta randområdena som uttrycks i huvud olfaktoriska epitelet i mus. På grund av det stora antalet OR i vild typ djur, att chanserna spela OSN uttrycka samma eller mycket låg. För att övervinna dessa begränsningar, gener riktade möss finns där alla OSN uttrycker en identifierad eller är märkta med ett fluorescerande protein 7-9. Dessa märkta OSN användes för att göra funktionsanalys i dissocierade preparat 7,10,11 med nackdelarna som nämnts tidigare. En intakt epitel preparat 5 från genetiskt märkta möss kringgår därför dessa frågor. Det gör det möjligt att övervaka aktiviteten hos OSN uttrycker exakt definierade yttersta randområdena i en miljö så nära i VIvo som möjligt. Dessutom patch-clamp inspelningar av OSN tillåter också noggrann analys av membranegenskaper, transduktionsväg farmakologi, ligand / eller interaktioner. Alla dessa frågor kan knappast analyseras med hjälp av extracellulära inspelningar. Vi använde denna teknik för att övervaka svaren från OSN uttrycker luktreceptorer SR1 och MOR23 12,13. Möjligheten att tekniken bekräftades av andra grupper på MOR23 uttrycker OSN 14 liksom på andra yttersta randområdena uttrycker nervceller 15,16. Övervakningen av en definierad population av OSN kan leda till en analys av deras egenskaper i många olika sammanhang, såsom utveckling 14, åldrande 17, lukt inducerad plasticitet 18, och den roll som variationer i luktreceptor sekvens i lukt kodning 15. Detta protokoll ger därmed ett kraftfullt verktyg för att övervaka de funktionella egenskaperna hos definierade OSN på membrannivå.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll följer riktlinjerna för djurskötsel av Université de Bourgogne och godkändes av Université de Bourgogne etisk kommitté den.
1. Djur
- Använd genetiskt manipulerade ELLER-IRES-tauGFP möss finns på Jackson Laboratory. Dessa möss har utvecklats i Dr Peter Mombaerts laboratorium för att analysera Axon inriktning och utveckling av luktsystemet 19. Till exempel MOR23-IRES-tauGFP linje, stock nummer 006.643, bär det officiella stammen namnet B6, 129P2- Olfr16 tm2Mom / MomJ; Likaså SR1-IRES-tauGFP linje, stock nummer 6717 bär det officiella namnet B6, 129P2- Olfr124 tm1Mom / MomJ.
- När det gäller djurens ålder: för ett bättre utfall av protokollet, använder djur mellan 2 och 4 veckors ålder. I denna åldersgrupp är dissektion lättare (mjukare ben, fastare luktepitel) och de dendritiska rattar är bigger jämför med äldre djur.
2. Framställning av elektroder och lösningar
- För stimulerande pipetter: köp prepulled stimulerande pipetter. Annars manuellt förbereda dem.
- Med hjälp av en flamma, böj sex 1 mm glaspipetter på ca 1 cm från spetsen. Sätt dessa sex pipetter plus en rak 7: e i 1,5 cm krympslang förstärkas med en ögla.
- Värm krympa röret för att bibehålla de fat bifogade tillsammans. Bifoga en extra värmekrympslang till den andra änden av fat. Dra detta stimulerande pipett med en multi-fat avdragare.
- Lägg till lite vit flytande lim runt öglan att stärka böjda tips. Låt torka O / N.
- Bered 1 eller 2 liter normal Ringers extracellulärt lösning (i mM: NaCl 124, KCl 3, MgSO 4 1,3, CaCl2 2, NaHCO 3 26, NaH 2 PO 4 1,25, glukos 15, pH 7,6 och 305 mOsm). Förvara vid 4 ° Cfram till användning.
- Bered intracellulär stamlösning (i mM): KCl 70, KOH 53, metansulfonsyra 30, EGTA 5, HEPES 10, sackaros 70; pH 7,2 (KOH) och 310 mOsm. Förvara vid 4 ° C fram till användning. Bra för flera veckor.
- Bered intracellulära inspelning lösning med nystatin improviserat (i sista minuten) innan experimentet.
- Väg 3 mg nystatin, tillsätt 50 pl DMSO; virvel 20 sek Sonikera sedan 2-3 min tills helt utspädd.
- Lägg 20 ^ il DMSO-nystatin lösning i 5 ml av intracellulär förrådslösning. Vortex 20 sek, sedan sonikera 3 min. Förvara denna lösning vid 4 ° C och skyddas mot direkt ljus, är nystatin ljuskänslig. Denna lösning kan användas under några timmar. Byt varje dag.
- När luktepitel preparatet är under mikroskop, ta del av denna lösning i en 1 ml spruta med en flamma-avlång gul spets för att fylla elektroderna; skydda från direkt ljus. Väl framme vid RT, den nystatin lösningär inte stabil; ersätta lösningen i 1 ml engångsspruta varje timme eller behålla den i is.
- Dra inspelning elektroder med en avdragare för att få lång hals och litet tips (~ 2 pm) med ett motstånd på 15-20 MQ med den inre nystatin lösningen.
- Bered luktämnen lösning på 0,5 M i DMSO under dragskåp; portion och hålla vid -20 ° C fram till användning. Späd luktämne i Ringers lösning tills den önskade koncentrationen. Fyll stimulerande pipetten.
3. Framställning av luktepitel
Obs: ELLER-IRES-tauGFP möss uttrycker den tauGFP under styrning från ELLER-promotorn. I dessa möss är alla neuroner som uttrycker eller är av intresse märkt med GFP. Detta protokoll är anpassat för yttersta randområdena som uttrycks i alla zoner. Men dissektioner och inspelningar är lättare för de yttersta randområdena som uttrycks i ryggområdet.
- Söva djuret genom att injicera en blandning av ketamin och xylazin (150 mg / kg och 10 mg / kg BODy vikt, respektive). Halshuggning kan utföras med vass sax för unga möss eller med en väl underhållna gnagare giljotin för äldre möss.
- Använda ring dissekera sax gör en längsgående medial snitt genom rygghuden. Ta bort skinnet genom att dra isär den. Med hjälp av en sax, skär underkäken på käkled. Ta bort de övre framtänderna med en coronal snitt parallellt med tänderna.
- Gör en koronalt skära av huvudet bakom ögonen och hålla endast den främre delen av huvudet. Doppa den i iskall Ringers lösning för dissektionen omfattas.
- Dissekera omfattas: i den ventrala sidan, gör en längsgående snitt längs den övre käken / tänderna. Skär de dorsala ben längdled, efter det dorso-laterala sidan av näshålan. Ta bort de flesta ben och gom; överföra septum och epitelet är fäst vid den i oxygenerad Ringers vid RT.
- För slut dissektion: Precis innan du startar inspelningensession, skala bort epitelet från den underliggande septum med pincett. Lossa epitel med pincett och med två 4-5 mm sax skär (använd microvannas sax) vid den främre delen av skiljeväggen där vidhäftningen är starkare.
- Ta försiktigt bort Vomeronasalorganet genom att skära ut längs dess rygg anslutning till septal epitel. Överför epitel till en inspelning kammare med slemlager uppåt; hålla den platt i kammaren med en harpa.
- Installera kammaren under en upprätt mikroskop utrustat med fluorescens optik och en känslig kamera. Visualisera preparatet på datorskärmen med hög förstoring genom en 40X vattenimmersionsobjektiv (numerisk apertur 0,8) och en extra 2X eller 4X förstoring uppnås genom en förstoringslins. Perfundera kontinuerligt med syrsatt Ringers vid RT (1-2 ml / min).
4. Inspelningen
- Sök efter fluorescerande cell: uppväcka preparatet i 480nm för EGFP, som avger ljus i 530-550 nm; rikta en dendritiska ratten som är tillförlitligt synlig i fluorescens och under ljusa fält.
- Fyll elektroden med intracellulära lösning med nystatin; avlägsna bubblor genom att knacka försiktigt på elektroden.
- Sätt elektrod på elektrodhållare, applicera positivt tryck i pipetten; Motstånd bör vara 15-20 Mohm.
- Bring elektrod nära cellen; när motståndet når ~ 40 MQ, släpp positivt tryck och anbringa ett lätt undertryck för att nå en gigatätning.
- När tätning uppnås, ställer membranpotentialen vid ca -75 mV;
- När cellen öppnas, fortsätt med stimuleringsprotokoll, farmakologiska behandlingar. För att mäta svar på en enda luktämnen stimulering, rekord 200-500 ms av spontan aktivitet, stimulera för 500 ms och mäta responsen av cellen under upp till 10 sek 13. För farmakologisk behandling, BEGJUTA de farmakologiska medel påden önskade koncentrationen 20.
5. Dataanalys
- Analysera strömmar framkallade av luktämnen stimulans som följer: den maximala amplituden, den stigtid (tid som behövs för att nå 90% av den maximala amplituden i ms), den totala strömmen (area under kurvan i Pas), tiden vid 50% (tid mellan starten och förskjutningen av svaret på 50% av den maximala amplituden i msek).
- Använda toppöverföringsströmmar (maximal amplitud nås) vid olika koncentrationer, rita och montera en dos-responskurva med Hill ekvation: I = Imax / (1 + (K 1/2 / C) n), där jag representerar toppströmmen , IMAX det maximala svaret vid mättande koncentrationer, K1 / 2 den koncentration vid vilken hälften av det maximala svaret nåddes, C koncentrationen av luktämnet och n Hill koefficient.
- Analysera inspelningar av membranpotential i strömtång för maximal depolarisation, den total potential framkallade (area under kurvan i mVsec); rekord spontan spiking aktivitet över 30 sekunder till 1 minut inspelningar; rekord retbarhet genom spikar framkallade genom injektion av strömmar (5-10 år).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultatet av detta protokoll beror på kvaliteten på dissekering. Denna dissektion steg måste vara kort (mindre än 10 till 15 minuter) och exakt (det vill säga, för att undvika skador på epitel). Figuren 1 visar hur en idealisk förberedelse ser ut på olika förstoringsnivåerna. Vid låg förstoring under ljust fält de olika celltyper (såsom knoppar av OSN, stödjande celler) kan särskiljas (figur 1 A). Vid den högsta förstoringsgrad, typiskt 80X till 160X, i ljusa fält, de dendritiska rattar för OSN ska vara tydligt urskiljbar från de stödjande celler (Figur 1B). Under lysrörsbelysning, bara de dendritiska rattar och cilier av GFP märkta celler är synliga (Figur 1C). Genom att jämföra de två bilderna, kan de märkta cellerna ske med inspelnings pipett (Figur 1D).
Temperaturen på dissektion sålution och tidpunkten för dissektion är kritiska. Den första delen av dissektionen, bör beredningen av septumet (avsnitt 3.1.1 till 3,2) äger rum inom 5 till 10 minuter i iskall lösning. Den slutliga dissektion (3,3) bör pågå mindre än 5 minuter vid rumstemperatur. I fall dissektion varade för länge, eller utfördes i dissektion lösning för varmt, förberedelse alltid ser snabbt skadad: dendritiska rattar svävar ovanför ytan av epitel, och liknar döda celler.
När väl en tätning är uppnådd och cellen öppnas under påverkan av nystatin, kan observeras typiska spänningsstyrda strömmar (Figur 2A). Formen och egenskaper hos dessa strömmar kan användas för att övervaka hälsan hos cellen: i en döende cell eller om förseglingen kvalitet minskar, kommer dessa strömmar "amplitud minskar. Enligt den nuvarande klämkonfigurationen, kan spelas in aktionspotentialer antingen spontant (figur 2B) eller genom injektion av en depolariserande ström (Figur 2C). Bränn egenskaper som induceras av ströminjektion karakterisera retbarhet av den inspelade neuron. Retbarhet olika OSN "befolkning kan jämföras (med klassisk frekvens och ISI beräkningar).
En multibarrel pipett laddas med olika doftämnen och / eller olika koncentrationer av luktämnen kan användas för att stimulera cellerna genom tryckutstötning. Detta gör det möjligt att mäta doft inducerade svar. De luktämnen och koncentrationer måste väljas beroende på de yttersta randområdena uttrycks i cellen av intresse, till exempel Lyral är liganden för MOR23, acetofenon för M71, eugenol för mOREG. I experimentet illustreras på figur 3, de inspelade MOR23-IRES-tauEGFP nervceller svarat på olika koncentrationer av Lyral, en ligand för MOR23 under strömtång läge (Figur 3A) eller under spänningsklämläget (Figure 3B). I spänningsklämlägesinspelningar, kan olika egenskaper övervakas för att kvantifiera svaret (maximal amplitud, stiga-tid, total ström framkallade, osv.) Som utförs klassiskt i elektrofysiologi. Använda den maximala amplituden för den luktämne-inducerade svar kan dosrespons plottas och monteras med hjälp av Hill-ekvationen. Dessa resultat ger information om kodnings egenskaperna för varje OSN: tröskeldetektering, tidsmässigt dynamiska, dynamiskt omfång och mättnadsnivå. Exempel på dos-responskurvor visas i figur 3C. Alla dessa uppgifter kan jämföras mellan enskilda OSN att mäta potentiella heterogenitet inom en population; de kan också jämföras mellan OSN med eller utan tillämpning av en behandling för att mäta potentiella modulering och plasticitet.
Figur 1: Bilderna av en hälsosam preparatet (A) Intakt luktepitel utvinns ur näshålan av en SR1-IRES-tauGFP transgen mus observerades under ljusa fält skick vid 40X förstoring.. OSN dendritiska rattar (svart pil huvuden) är inneslutna i ett nät av stödjande celler (SC) och Bowman körtlar (BG). (B) Dendritic knoppar av SR1 uttrycka OSN observerats under starkt fält skick (vit och röd pilhuvuden). (C) Samma fält som i (B) i lysrörsbelysning visar dendritiska rattar av SR1 uttrycker OSN. (D) Inspelnings pipett närmar sig en SR1-uttryck OSN under starkt fält. Den röda pilen representerar samma SR1 OSN i (B - D). Skala bar: 5 pm.
Figur 2: Representant membranegenskaper resultat som erhållits med de protokoll:. Patch-clamp inspelningar på den dendritiska ratten i en SR1-IRES-tauGFP OSN (A) spänningsstyrda strömmar framkallade genom att öka depolariserande steg från membranpotentialen -67 mV till +40 mV. (B) Spontan aktivitet registreras i strömtång konfiguration; aktionspotentialer kan observeras under 15 sek inspelnings epok. (C) Action potentialer framkallade av en +7 pA excitatoriska ström; detta protokoll ger information om retbarhet av cellen.
Figur 3:. Representativa exempel på lukt inducerade svar i en MOR23-IRES-tauEGFP neuron Ökande koncentrationer av Lyral, en ligand av MOR23 receptom inducerar ökande svar både i strömklämman (A) och i spänningsklämman (B). Membranpotentialen klämdes vid -67 mV. (C) Exempel på individuella dos-responskurvor som förvärvats på tre M71 nervceller som svar på ökande koncentrationer av acetofenon och utrustade med Hill ekvationen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Förmågan hos detta protokoll för att korrekt övervaka egenskaperna hos friska OSN beror mycket på kvaliteten av preparatet. Därför dissektion steg är kritisk. Först är det viktigt att uppmärksamma kvaliteten (pH, osmolaritet), syresättning och temperatur (iskall men inte fryst) av dissektion medium. För det andra måste manipulation av epitel med dissekera verktyg vara så begränsad som möjligt för att undvika skador. Slutligen är det viktigt att få ett preparat så platt som möjligt för att få tillgång till den största OSN befolkningen som möjligt.
Dissektion kvalitet är grundläggande för erhållande av en frisk beredning. Emellertid kan olika metoder användas för dissektion: här presenterar vi en ventral att dorsala dissektion men vissa användare kan föredra att starta dissekering dorsalt för att öppna näshålan snabbt och har en snabb tillgång till septal urtagning av det olfaktoriska epitelet. Varje användare kan därmed anpassa protocol för den mest effektiva strategin för att uppnå en hälsosam beredning av området av intresse.
När preparatet under mikroskop, krävs ständig övervakning av preparatet hälsa. I själva verket leder en ohälsosam beredningen till en låg sannolikhet för att nå en gigatätning. En låg effektivitet erhålla gigatätningar kan förbättras genom att ändra intresseområde om förberedelserna för att hitta hälsosam OSN. En mer drastisk lösning är att byta ut beredningen helt av en ny. När förseglingen har uppnåtts, till en låg sannolikhet når den "öppnade" tillstånd kan äga rum. Detta kan bero på att den inre lösningen kvalitet. Den interna lösningen måste beredas strax före försöket. Användningen av virveln och sonikering är kritiska eftersom lösligheten för nystatin är ganska låg. För att öka sannolikheten för att öppna, bör den interna lösningen igen virvlas under 10 sekunder och sedan sonikerades under 30 till 60 sek. Denna usually förbättrar effektiviteten i cellöppningen.
För att stimulera den inspelade OSN med luktämnen, protokollet presenterades använder en 7 fat stimulerande pipett. Denna typ av pipett innebär en begränsning av antalet doftämnen och / eller koncentration av doftämnen som testats på varje inspelade celler till sju. Denna begränsning är relativt ej signifikant i fallet med en dosresponskurva eftersom det kan omfatta upp till 7 log enheter av koncentration. Emellertid, i fallet med screening experiment där olika odörer testas, kan en sju fat pipett visar begränsningar. Vid screening experiment, är målet att hitta en ligand för märkta OSN uttrycker en föräldralös ELLER. Med hjälp av detta protokoll kommer att kräva användning av lukt blandningar. Varje blandning framkalla ett svar kommer sedan att delas upp i enskilda doftämnen. Detta gjordes för att screena aminluktämnen på TAAR uttrycker OSN 16. I dessa experiment, de fluorescerande neuron uttryckte Taars och liganden var unkNown. Med hjälp av protokollet, kunde författarna screena flera tiotals amin odörer i blandningar. Blandningarna framkallar ett svar sedan bryts ner till enskilda doftämnen för att hitta den mest effektiva liganden.
Avståndet mellan inspelningsplatsen och den stimulerande pipetten bör väljas klokt för att minimera mekanisk stimulering av cellen 20. Om trycket är för högt (över 30 psi i våra inspelningsförhållanden) och / eller avståndet för litet (under 20 um), kan det mekaniska svaret i vissa OSN även maskera luktämnen svar. Tryck och avståndet mellan blåsa pipett och inspelningsplatsen är också viktigt att kontrollera lösning utbyte under stimulering. Koncentrationen når neuron har tidigare utvärderats för att vara så nära som möjligt till den koncentration som föreligger i pipetten genom en serie av tester 13. Dessa tester använde en lösning färgat med blått färgämne för att mäta tillslag och hävning av than stimulering. Använda 20 psi och 30 nm avstånd, var den högsta nivån av stimulans nås inom 300 ms. Förskjutningen av den stimulans var också noga utvärderas: eftersom preparatet är under kontinuerligt flöde av perfunderad lösning, var den stimulans urtvättat inom 0,8-0,9 sek 13.
Lukten kodnings egenskaper OSN var historiskt mäts antingen genom extracellulära inspelningar in vivo eller genom experiment på isolerade celler. Hos däggdjur har extracellulära inspelningar utfördes först in vivo i råttor 21. I extracellulära inspelningar, OR uttryckt i den inspelade cellen är okänt vilket begränsar framgång förhållandet att hitta en cell svarar på den testade luktämnen. Protokollet tillåter inspelning och karakterisering av definierade receptorer i neuroner i den cellulära miljön av epitelet. Receptorerna "egenskaper kan därför analyseras på olika nivåer: den specifika liganden/ eller interaktion under det första steget av transduktionsväg; följaktligen agonisten / antagonist interaktioner av olika ligander testade; egenskaperna hos blandningar integrering av definierade yttersta randområdena och den roll som transduktionsväg för OSN 'specificitet; påverkan på lukt kodning av cell-till-cell-interaktioner (såsom GAP korsning) inom epitelet; och slutligen moduleringen av transduktionsväg användning farmakologiska medel.
I de dissocierade cell inspelningar, som nämnts tidigare, avlägsnar dissociationen processen slemmet och de cell-till-cell-interaktioner inom det olfaktoriska epitelet. Detta kan medföra förändringar i kodnings egenskaperna hos OSN. Kalcium Imaging experiment på isolerade celler frekvent rapporterade. Till exempel var dos-responskurvor för M71 uttrycker OSN som svar på acetofenon rapporterade 7. Dessa dos-responskurvor är brantare än den dos-svar kurvor erhållna med användning av protokolletpresenteras här fyra. Dessa skillnader kan bero på cell-till-cell interaktioner i den intakta förberedelser och även avlägsnande av slem i isolerade celler. Slem är känt för att innehålla många protein och enzymer som är involverade i perireceptor händelser grundläggande för lukt transduktion 22,23. I protokollet redovisas här, bevarandet av strukturen i luktepitel och den förmodade förekomsten av slem bidrar till att bevara de inhemska funktionerna i luktämnen kodning i OSN. De koncentrationer som används i protokollet anges i mol / l och är vanligtvis i 10 -7 -10 -3 sortiment. Dessa koncentrationer är högre än koncentrationer som användes i luft fasas inspelningar (antingen i lokal fältpotential eller extracellulära inspelningar). Dessa skillnader kan bero på att i) vätskefasen av inspelningarna (och därmed stimulering) och ii) den långsamma washout av slem genom perfusion under inspelningarna. Faktum är att uttvättning av de mucoss och den del av de OSN "axoner under dissektion kan stödja att beredningen presenteras potentiellt betecknas som en" pseudo-intakt "snarare än en" fullt intakt "preparat. Detta preparat utgör dock inspelningsförhållandena så nära in vivo som möjligt och ändå framkallar patch-clamp inspelningar. Som någon beredning från en däggdjursorganism in vitro förblir tidsbegränsade överlevnad. Denna gräns kan bero på wash-out av slem, den del av OSN "axoner samt frånvaron av blodcirkulationen i beredningen.
Protokollet presenteras här gör att man kan spela in membran egenskaper hos luktsinnet sensoriska neuroner. Denna teknik kan ha flera tillämpningar såsom analys av membranegenskaper OSN, farmakologiska undersökningar av OSN, modulering av luktkodnings egenskaper OSN och deorphanization av yttersta randområdena. De händelser som registrerats under kalcium avbildning är slow och långvarig. Patch-clamp inspelningar i det nuvarande protokollet leder till data om snabba händelser i lukt transduktionsväg på membrannivå.
Inspelningarna presenteras här genomförs i patch-clamp konfiguration. I denna konfiguration kan membranegenskaperna hos den inspelade cellen analyseras, om det är det olfaktoriska transduktionsväg maskinen eller spänningsstyrda strömmar inblandade. Experiment som använder detta protokoll kan ge uppgifter om moduleringen av luktkodnings egenskaper OSN. Farmakologiska medel kan användas för att undersöka det olfaktoriska transduktion i olika förhållanden: till exempel kan MDL12330A, en blockerare av adenylatcyklas III (ACIII) 24,25 appliceras i perfusionslösningen för att undersöka rollen av ACIII i ett luktämne respons. Dessutom kan detta protokoll användas för att undersöka hur luktkodnings egenskaper moduleras i olika förhållanden såsom lukt miljön <sup> 18 eller under påverkan av hormoner som deltar i utfodring beteenden 26. Slutligen kan detta protokoll också leda till data om OR / ligandinteraktion och dechiffrera agonist / antagonist aktiviteter på definierade yttersta randområdena eller ens i slumpmässigt utvalda receptorer 27.
Slutligen, med de begränsningar på grund av 7 fat stimulerande pipett detta protokoll kan också användas för deorphanizing yttersta randområdena. Såsom nämnts tidigare, i detta fall kan flera doftblandningar provas. Blandningar framkallar ett svar ska sedan delas upp i enskilda doftämnen som testats på andra celler.
Genom att rikta OSN uttrycka definierade yttersta randområdena, ger detta protokoll kraftfulla uppgifter om de yttersta randområdena, ligander / yttersta randområdena interaktioner, transduktionsväg egenskaper och att jämföra egenskaperna hos definierade populationer av OSN i olika förhållanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| vibration table with Faraday cage | TMC | 63-500 SERIES | required : isolates the recording system from vibrations induced by the environment (movements of experimenter, vibrations of equipment such as fans for cooling computers, etc); can also be purchased with a Faraday cage, or equipped by a custom made Faraday cage; this cage is recommended to avoid electric noise from the environment |
| optics | |||
| microscope | Olympus | BX51WI | upright microcope equipped with epifluorescence; fixed or moving stage depending on the user's preference |
| objectives | Olympus | LUMPLFL40XW | at least 2 objectives required: a 4X or 10X for coarse approach to the cell; and a 40X immersion long distance example Olympus LUMPLFL40XW / IR /0,8 / WD:3.3 MM |
| magnifier | Olympus | U-TVCAC | ABSOLUTELY REQUIRED: placed in the light path between the objective and the camera; allows to magnify the image on the screen in order to reach precisely the knob with the recording electrode |
| camera | Olympus | DP72 | a good camera is required to see the neurons in fluorescence as well as in bright field; the controlling software is simple and allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell. An ultrasensitive camera is not necessary |
| filters | Olympus/Chroma | depending on the fluorescent protein used in the mice; example for GFP: excitation : BP460-490: emission: HQ530/50m | |
| amplifier | HEKA | EPC10 USB | monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the puffing by sending a TTL signal to the spritzer; the EPC10 setup is controled by computer |
| software | HEKA | Patchmaster | controls the amplifier during the experiment |
| micromanipulator | Sutter | MP225 | precision micromanipulator, allows precise movements down to 1/10th of a micrometer; this model is very stable; avoid hydraulic manipulators that may drift |
| electrode puller | Sutter | P97 | with a FT345-B wide trough filament; to prepare recording pipets of about 2µm diameter with a long tip to reach the cells; the resistance should be 15 to 20Mohm with perforated patch clamp solution |
| glass | Sutter | BF120-69-10 | in our recording conditions, this glass is ideal for recording pipets |
| recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | a chamber is needed to set the preparation under the microscope. To maintain the preparation in the center of the chamber, a net/anchor should be used. |
| stimulation | |||
| glass | WPI | TW100F-4 | attached in groups of 7, these pipettes are used to prepare prepulled stimulating pipettes |
| multibarrel puller | MDI | PMP-107-Z | by association of pull and twist, this puller allows us to prepare puffing electrodes with 7 barrels |
| precision pressure injector | Toohey Company | P/N T25-1-900 Single Channel | this precision pressure injector controls the pressure ejected in the multibarrel puller; it is controlled manually or by the amplifier by a 5V TTLs |
| micromanipulator | Narishige | YOU-1 | a coarse manipulator is enough to bring the puffing electrode close to the recording site |
| tubings | N/A | tygon tubing to bring the pressure from the puffer to the puffing pipette | |
| solutions/perfusion/chemicals | |||
| vacuum pump | gardner denver | 300 series | a vibrating membrane pump is more quiet and efficient than other types of pumps |
| perfusion system | N/A | N/A | gravity perfusion system with polyethlylen tubing to bring in and out the external solution from the recording chamber |
| nystatin | Sigma-Aldrich | N3503 | mandatory to perpare internal solution for perforated patch clamp |
| DIMETHYL SULFOXIDE | Sigma-Aldrich | D5879 | used to disolve nystatin for internal solution for perforated patch |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | extracellular solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | intracellular/extracellular solution |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | extracellular solution |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S9638 | extracellular solution |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4 7H2O) | Sigma-Aldrich | 63140 | extracellular solution |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | extracellular solution |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | extracellular solution |
| EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) | Sigma-Aldrich | E3889 | internal solution |
| Potassium hydroxyde | Sigma-Aldrich | P1767 | internal solution |
| Methyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | W387509 | intracellular solution |
| Hepes-Na | Sigma-Aldrich | H7006 | intracellular solution |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | intracellular solution |
References
- Lowe, G., Gold, G. H. Nonlinear amplification by calcium-dependent chloride channels in olfactory receptor cells. Nature. 366 (6452), 283-286 (1993).
- Ponissery Saidu, S., Dibattista, M., Matthews, H. R. Odorant-induced responses recorded from olfactory receptor neurons using the suction pipette technique. J Vis Exp. (62), e3862 (2012).
- Moss, R. L., et al. Electrophysiological and biochemical responses of mouse vomeronasal receptor cells to urine-derived compounds: possible mechanism of action. Chem Senses. 23 (4), 483-489 (1998).
- Kaur, A., Dey, S. Live cell calcium imaging of dissociated vomeronasal neurons. Methods Mol Biol. 1068, 189-200 (2013).
- Ma, M., Chen, W. R. Electrophysiological characterization of rat and mouse olfactory receptor neurons from an intact epithelial preparation. J Neurosci Methods. 92 (1-2), 31-40 (1999).
- Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C. Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system. J Neurosci. 22 (8), 3033-3043 (2002).
- Bozza, T., et al. Mapping of class I and class II odorant receptors to glomerular domains by two distinct types of olfactory sensory neurons in the mouse. Neuron. 61 (2), 220-233 (2009).
- Vassalli, A., Rothman, A., Feinstein, P., Zapotocky, M. Minigenes impart odorant receptor-specific axon guidance in the olfactory bulb. Neuron. 35 (4), 681-696 (2002).
- Feinstein, P., Bozza, T., Rodriguez, I., Vassalli, A. Axon guidance of mouse olfactory sensory neurons by odorant receptors and the beta2 adrenergic receptor. Cell. 117 (6), 833-846 (2004).
- Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat Rev Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).
- Grosmaitre, X., et al. SR1, a mouse odorant receptor with an unusually broad response profile. J Neurosci. 29 (46), 14545-14552 (2009).
- Grosmaitre, X., Vassalli, A., Mombaerts, P., Shepherd, G. M. Odorant responses of olfactory sensory neurons expressing the odorant receptor MOR23: a patch clamp analysis in gene-targeted mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (6), 1970-1975 (2006).
- Lam, R. S. Odorant responsiveness of embryonic mouse olfactory sensory neurons expressing the odorant receptors S1 or MOR23. Eur J Neurosci. 38 (2), 2210-2217 (2013).
- Zhang, J., Huang, G., Dewan, A., Feinstein, P. Uncoupling stimulus specificity and glomerular position in the mouse olfactory system. Mol Cell Neurosci. 51 (3-4), 79-88 (2012).
- Zhang, J., Pacifico, R., Cawley, D., Feinstein, P. Ultrasensitive detection of amines by a trace amine-associated receptor. J Neurosci. 33 (7), 3228-3239 (2013).
- Lee, A. C., Tian, H., Grosmaitre, X. Expression patterns of odorant receptors and response properties of olfactory sensory neurons in aged mice. Chem Senses. 34 (8), 695-703 (2009).
- Cadiou, H., et al. Postnatal odorant exposure induces peripheral olfactory plasticity at the cellular level. J Neurosci. 34 (14), 4857-4870 (2014).
- Mombaerts, P. Axonal wiring in the mouse olfactory system. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 713-737 (2006).
- Grosmaitre, X., Santarelli, L. C., Tan, J., Luo, M. Dual functions of mammalian olfactory sensory neurons as odor detectors and mechanical sensors. Nat Neurosci. 10 (3), 348-354 (2007).
- Duchamp-Viret, P., Chaput, M. A. Odor response properties of rat olfactory receptor neurons. Science. 284 (5423), 2171-2174 (1999).
- Heydel, J. M., et al. Odorant-binding proteins and xenobiotic metabolizing enzymes: implications in olfactory perireceptor events. Anat Rec (Hoboken). 296 (9), 1333-1345 (2013).
- Pelosi, P. Perireceptor events in olfaction). J Neurobiol. 30 (1), 3-19 (1996).
- Spehr, M., Wetzel, C. H., Hatt, H. 3-phosphoinositides modulate cyclic nucleotide signaling in olfactory receptor neurons. Neuron. 33, 731-739 (2002).
- Chen, S., Lane, A. P., Bock, R., Leinders-Zufall, T. Blocking adenylyl cyclase inhibits olfactory generator currents induced by 'IP(3)-odors. J Neurophysiol. 84 (1), 575-580 (2000).
- Savigner, A., et al. Modulation of spontaneous and odorant-evoked activity of rat olfactory sensory neurons by two anorectic peptides, insulin and leptin. J Neurophysiol. 101 (6), 2898-2906 (2009).
- Ukhanov, K., Brunert, D., Corey, E. A. Phosphoinositide 3-kinase-dependent antagonism in mammalian olfactory receptor neurons. J Neurosci. 31 (1), 273-280 (2011).
