Abstract
טרשת נפוצה היא מחלה דלקתית demyelinating של מערכת העצבים המרכזית המאופיינת בהיווצרות רובד המכילה oligodendrocytes איבדה, מיאלין, האקסונים, ותאי עצב. חידוש יצירת המיאלין הוא מנגנון תיקון אנדוגני לפי המיאלין החדש מיוצר לאחר התפשטות, גיוס, והתמיינות של תאי מבשר oligodendrocyte לoligodendrocytes יוצרי מיאלין, ויש צורך להגן על האקסונים מנזק נוסף. נכון לעכשיו, כל התרופה לטיפול בטרשת הנפוצה למקד את הרכיב החריג חיסוני של המחלה, אשר להפחית התקפים דלקתיים אבל לא למנוע התקדמות לירידת נוירולוגית בלתי הפיכה. לכן זה הכרחי כי אסטרטגיות קידום חידוש יצירת המיאלין מפותחות אשר עשוי לעכב את התקדמות מחלה ואולי להפוך סימפטומים נוירולוגיים. מודלים של בעלי חיים כמה מdemyelination קיימים, כוללים Encephalomyelitis אוטואימוניות הניסיוני וcurprizone; עם זאת, יש Limitations בשימוש בם ללימוד חידוש יצירת המיאלין. גישה חזקה יותר היא הזרקת המוקד של רעלים במערכת העצבים המרכזית, כוללים lysolecithin חומר הניקוי לתוך החומר לבן חוט השדרה של מכרסמים. בפרוטוקול זה, אנו מראים כי ההליך הכירורגי הכרוך בהזרקת lysolecithin לחומר לבן הגחון של עכברים הוא מהיר, יעיל וחסכוני, ולא דורש חומרים נוספים מאלה זמינים מסחריים. הליך זה הוא חשוב לא רק ללימוד האירועים הרגילים מעורבים בתהליך יצירת מיאלין מחדש, אלא גם ככלי פרה-קליני לסינון תרופות קידום חידוש יצירת המיאלין מועמד.
Introduction
טרשת נפוצה (MS) היא מחלה כרונית demyelinating של מערכת העצבים המרכזית (CNS) המאופיינת בחדירת תאים חיסונית ושלטים המכילים איבדו המיאלין, oligodendrocytes, אקסונים ותאי עצב. רוב החולים מהלך מחלה מורכב מהתקפים דלקתיים מלווים במגוון רחב של תסמינים נוירולוגיים, ואחריו תקופות של הפוגה. למעלה ממחצית חולים אלו סופו של דבר לעבור לשלב מתקדם משניים ללא הישנות לכאורה אך ירידת נוירולוגית מתמשכת. הוא האמין כי ההידרדרות מתקדמת וזאת בשל נזק ואובדן axonal, תרם בחלקו על ידי demyelination הכרוני. אסטרטגיות כדי לשחזר מיאלין שאבד הם וכך נחשבים גישת טיפול מבטיחה לעכב את התקדמות מחלה ואולי להפוך סימפטומים נוירולוגיים.
חידוש יצירת המיאלין היא תגובת תיקון אנדוגני במערכת העצבים המרכזית לפיה נדני המיאלין חדשים שנוצרו מתאי מבשר oligodendrocyte גויסו(OPCs) שלהתמיין oligodendrocytes יוצרי מיאלין. חידוש יצירת המיאלין הוכח במודלים של בעלי חיים כדי להיות די חזק 1-3, לעומת זאת, היעילות שלה יורדת עם גיל 4. ואכן, חידוש יצירת המיאלין מתרחשת בבני אדם למרות שהוא לא שלם ברוב המכריע של חולי טרשת נפוצה 5. כל התרופות זמינות כעת עבור MS בעיקר למקד את הרכיב חיסוני החריג של המחלה, ובעוד יעילים בהפחתת התקפים, לא במידה ניכרת לעכב את התקדמות מחלה. הדור הבא של אסטרטגיות טיפוליות לניהול MS ישלב התקדמות בתפקוד מערכת חיסון עם השיפור של חידוש יצירת המיאלין אנדוגני כדי למנוע הישנויות שני והתקדמות 6.
שיטה אחת ללמוד דה וחידוש יצירת המיאלין במערכת העצבים המרכזית כרוכה בהזרקה הישירה של חומר הניקוי lysophosphatidylcholine (lysolecithin) ל1,3,7 חומר לבן בחוט השדרה. הליך זה מייצר demyelinat מאופיין היטבing פציעה מורכב בעיקר של מקרופאג / חדירת microglial והפעלה 8,9, astrogliosis תגובתי, ההפרעות של הומאוסטזיס axonal / פציעת axonal, והתפשטות OPC והגירה 10. הנגע צפוי מתפתח על פני תקופה של כמה שבועות, והוא מסוגל באופן מלא remyelinating סופו של דבר. שיטה זו הייתה שימושית במיוחד בלימוד כוריאוגרפיה של אירועים המעורבים בדה וחידוש יצירת המיאלין. יתר על כן, זה כבר אימץ ככלי לבדיקות פרה-קליניות של טיפולי מועמד להאצת תיקון הבאים עלבון demyelinating.
Protocol
הערה: בעלי החיים המשמשים בהליך זה טופלו בהתאם המועצה הקנדית על טיפול בבעלי חיים (CCAC) הנחיות. אתיקה אושרה על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת קלגרי.
1. הכנת מזרק להזרקה
- לפזר lysolecithin לפתרון 1% בפוספט שנאגרו מלוח (PBS; pH 7.4) ולאחסן ב -20 ° C בaliquots הקטן (75 μl). להפשיר בקבוקון לRT.
הערה: אם lysolecithin הוא שלא נמס, sonicate הצינור בשואב קולי (40 kHz) למשך כ 30 דקות כדי ליצור פתרון אחיד. - ידית נימי הזכוכית משך מראש בזהירות רבה כדי למנוע נזק לקצה העדין. להתיר את האגוז של מזרק הזרקת 10 μl ולהשחיל אותו על הקצה השטוח של הנימים ואחריו 2 ferrules, להבטיח כי את קצות ההזדווגות של ferrules ליישר והנימים היא צמודות בטבעת חזוק חרוטי (איור 1). יש לשטוף את המזרק עם isopropאלכוהול י.ל. ולהסיר את הבוכנה. לאחר יבש, והכנס את מכלול מחט היד הדוקה על מזרק הזרקה.
- צרף את מחט רכזת מתכת למזרק תחול. פירס דיסק גומי עם המחט ולהחליק אותו לבסיס. מלא את המזרק תחול עם lysolecithin. בעדינות לוחץ על המזרק תחול עד הנוזל נראה בקצה המחט. הדבר מבטיח בועות אוויר לא הציגו לתוך מזרק ההזרקה.
- הכנס את מחט רכזת מתכת של המזרק תחול לתוך מזרק ההזרקה. מה שהופך את חותם משרד עם דיסק הגומי, לדכא לאט את המזרק תחול עד הנימים ממלאת לקצה עם פתרון. מוציא בזהירות את המזרק תחול בעוד מדכא בו זמנית למלא את החבית של מזרק הזרקה ללא החדרת בועות אוויר. הכנס את הבוכנה לתוך מזרק ההזרקה ולהבטיח פתרון זורם מקצה הנימים כבוכנה מדוכאת בעדינות.
הערה: אם כל בועות אוויר נראות בכובעillary או הזרקת מזרק, הכנת המזרק יש לחזור מההתחלה. נוזל רציף במנגנון ההזרקה הוא קריטי כדי להבטיח כרכי הזרקה מדויקים. - צרף את המזרק המוכן להזרקת הזרוע של micromanipulator stereotactic. מנגנון הושלם זה יהיה מסוגל להזריק 15-20 בעלי חיים לפני הצורך למילוי מחדש.
- מחק את lysolecithin שנותר מהמזרק תחול. לסגת ולדכא באלכוהול רפואי מספר פעמים, ולנתק את מחט רכזת מתכת. חכה כמה שעות לאלכוהול איזופרופיל שנותר במזרק תחול להתאדות לפני המילוי שוב.
2. הכן בעלי החיים לנוהל כירורגי
הערה: הליך זה מתואר לC57BL / 6 נקבות עכברים, גיל 8-10 שבועות.
- להרדים את החיה עם זריקת intraperitoneal של קטמין (200 מ"ג / קילוגרם) ו xylazine (10 מ"ג / קילוגרם) או לתקנות טיפול בבעלי החיים מוסדיות. תכנית לבעלי החיים להיות תחת הרדמה למשך כ 1 שעות אם באמצעות הרדמה בזריקות.
- מבחן כי בעל החיים הוא בהרדמה עמוקה על ידי תקיפות צובטים את הרגל. בעלי חיים הרדימו כראוי לא יגיבו לקמצוץ.
- באמצעות קוצץ, לגלח אזור 2-3 סנטימטר 2 בצד הגב של בעלי החיים, קרובים לאוזניים. היזהר שלא לפגוע באוזניים.
- נגב את האזור נקי עם אתנול 70% יחול על תחבושת. להבטיח את כל השיער הקצוץ הוסר מהאזור. לחטא את האזור עם יוד.
- החל וזלין לעיניים כדי למנוע התייבשות לאורך כל ההליך.
- שמור את החיה בחדר התאוששות מחוממת עד מוכן להתחיל את ההליך.
3. לבצע את ההליך כירורגי
הערה: ודא טכניקת aseptic מתאימה לכל שלביו של ההליך. זה כולל שימוש נכון בכפפות, hairnets, מסכות, ווילאות. צריכים להיות מעוקרים כל הכלים לפני שהגיעו באנשי קשרt עם בעלי החיים.
- הזז את בעלי החיים למסגרת stereotactic, צד גב, גבוה באמצע הקטע במגבות נייר מקופל להגזים העקמומיות של עמוד השדרה. להדק את זרועות וזנב עם קלטת כירורגית ולאבטח את הראש עם מהדק שיניים. ברים אוזן ייצוב נחוצים לא לצורך הליך זה.
- השתמש באזמל לעשות חתך קו האמצע 3 סנטימטר, מתחיל ממש מתחת לאוזניים וחיתוך בכיוון הזנב.
- אתר את הפער בין 2 מבני שומן גדולים ולהשתמש במלקחיים בסדר בכל יד כדי למשוך אלה בנפרד. מורחים מפשקים לפתוח את שדה הניתוח.
- תחת מיקרוסקופ ניתוחי, לאתר את תהליך תולדה הבולט של החוליה T2 (הערה: תכונה זו אופיינית לזן עכבר C57BL / 6). לבצע נתיחה בוטה עם מספריים באביב סגורים דרך השרירים כיסו לדמיין טוב יותר T2. שימוש במלקחיים, מרגיש למשטחים קשים של T3 ו- T4 כדי לוודא את המיקום נכון אנטומיים.
- בעזרת מספריים האביב, לבצע חתכים רדודים לרוחב (2-3 מ"מ עמוקים) של רקמת החיבור בין T3 ו- T4. בשל מרווח טבעי בין החוליות בחלק העליון של בית החזה של עמוד השדרה העכבר, laminectomy אין צורך לחשוף את חוט השדרה. להיות זהיר, כי עמוק מדי קיצוץ יהיה לחדור ולפגוע בכבל.
הערה: במידה קטנה של דימום היא נפוצה בשלב זה. במקרה זה, מחזיק חנית ספוג לאזור עד שוך דימום (30-60 שניות). - דמיין את חוט השדרה. זה יהיה מכוסה בשכבה עבה של דורה גלויה אם שכבת קרום מוח זה עדיין לא לחתוך תוך חשיפת הכבל. כלי דם בולטים פועל הזנב / מקורי דרך קו האמצע המשוער של חוט השדרה.
הערה: אין להשתמש בכלי דם זה כנקודת ציון לקו האמצע. במקום זאת, תאורה נאותה צריכה לחשוף את גבולות חומר אפור-לבן איגוף העמודה הגבי, ויש להשתמש בם כדי להעריך את קו האמצע. - אם הדורהנותר בשלמותה, להפוך את שריטות רוחב עדינות עם מחט מתכת G 32 עד שנוקה. המטרה היא להסיר את הדורה ואילו לא חיתוך קרומי המוח הבסיסי שנותרו, שאינם עבים וקשים יותר לראות.
הערה: שחרור הנוזל השדרתי מציין הפרת נואיד ובזמן הזה יכול להתרחש ללא נזק מכאני לרקמה, הנוזל השדרתי שנצבר יש להסיר עם חנית ספוג כדי להמחיש את פני השטח של החוט טוב יותר. - הזז את מזרק הזרקה במקום ומוריד אותה באיטיות עד קצה הנימים רק בקושי נוגע בחוט השדרה באופן מיידי לרוחב של כל צד של קו האמצע. נעל את הזרוע במקום.
- השתמש במדידות מדורגות של זרוע stereotactic Z-הכיוון כדי להפוך את מדידת עמדה בסיסית. מקריאה זו, לחסר 1.3 מ"מ. השתמש בתנועה כלפי מטה מהירה ורדודה כדי לחדור את הרקמה ולאחר מכן להוריד בזהירות את הנימים עד שתגיע למדידה החדשה. אופציונאלי: אם תרצה בכך,נגעים בעמודת הגב יכולים להיות מיוצרים על ידי אותה תנועת פירסינג על קו האמצע ועומק של 0.3 מ"מ (ראה דיון למידע נוסף).
הערה: ערכים אלה הם ספציפיים להזרקת בין T3 ו- T4. אם בוחר לבצע הזרקה בכל מקום אחר בחוט השדרה, ערכים אלה חייבים להיות נגזרים מכל אטלס מוח עכבר זמין. - השתמש micromanipulator לדכא lysolecithin לחומר לבן בחוט השדרה הגחון. הפוך סיבוב 1 של micromanipulator כל 5 שניות למשך 2 דקות, וכתוצאה מכך נפח סופי של 0.5 μl. השאר את הנימים במקום למשך 2 דקות נוספות כדי למנוע זרימה חוזרת של פתרון, ולאחר מכן הסר את הנימים בזהירות.
- לקשור תפר אחד ברקמת שריר / שומן שכיסתה את עמוד השדרה. השתמש בתפר שאינו מופרע כדי לסגור את העור. החל יותר יוד לאתר החתך.
- מניחים את החיה בחדר התאוששות מחוממת עד שהוא מתאושש, ואז להחזיר אותו לכלוב שלה. החל משככי כאבים שלאחראופרטיבי על פי תקנות טיפול בבעלי החיים מוסדיות. טיפול שלאחר ניתוח נוסף הוא בדרך כלל אין צורך בבעלי החיים הם אמבולטוריים ומסוגלים האכלה עצמית ושתייה באופן מלא ברגע שהם ההתאוששות מן ההרדמה.
- חזור על התהליך עבור בעלי החיים שנותרו.
הערה: עם מיומנות, הפעולה יכולה להסתיים ב10-15 דקות לכל בעל חיים, במיוחד עם העזרה של אדם שני קשירת תפרים. אותו נימי הזכוכית יכולות לשמש לכ 15-20 ניתוחים לפני טיפ הופך בוטה ויש להחליפו. ניתן לבצע ניתוחי שליטה זהה כפי שתוארו, עם הזרקה של PBS לתוך חוט השדרה במקום lysolecithin. אנו לא ממליצים על ניקוי הנימים לשימוש עתידי.
4. עיבוד רקמות וניתוח
- להקריב חיות עם מנת יתר intraperitoneal של קטמין (500 מ"ג / קילוגרם) ו xylazine (25 מ"ג / קילוגרם) בנקודות זמן רצויים. נגעים בדרך כלל להתפתח בfollאופן בגלל: 1-3 ימים, demyelination הפעיל; 3-7 ימים, גיוס OPC; 7-10 ימים, בידול oligodendrocyte; 10-21 ימים, חידוש יצירת המיאלין פעיל 2,10,11.
- כדי להכין רקמות להיסטולוגיה, ראשון לבצע זלוף transcardial 12 עם 20 מיליליטר PBS RT ואחריו 20 מיליליטר paraformaldehyde 4% קרים כקרח בPBS. להכנת רקמה משובצת שרף לחתך למחצה או ultrathin, ראה שלב 4.9.
- הסר את חוט השדרה באמצעות מספריים עצם מעוגלים כדי לחתוך דרך כל חוליות מתחילות בסוף צוואר הרחם של עמוד השדרה ועובדות עד לרמה של בית החזה התחתון. לתקן את חוט השדרה O / N בparaformaldehyde 4% PBS ב 4 ° C. לעבור את מיתרים לסוכרוז 30% PBS ב 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 72 שעות.
- זהה את אתר ההזרקה כחריגות על פני השטח הגבי של חוט השדרה. חותכי חתיכה של רקמה (עם אתר ההזרקה במרכז) 3 מ"מ וליישר את החתיכות בcryomolds מכיל טמפרטורת חיתוך אופטימלית שיתוף (אוקטובר)mpound. להשעות את הצד התחתון של cryomolds בתערובת צוננת של 2-methylbutane וקרח יבש עד-OCT היא קפואה לחלוטין. חנות ב -80 ° C עד מוכן לסעיף.
- סעיף מיתרי השדרה על cryostat ברוחב של 20 מיקרומטר על גבי שקופיות מיקרוסקופ ולאפשר לאוויר היבש O / N לפני אחסון השקופיות ב -20 ° C.
- זהה את מיקום נגע וגודל באמצעות כתם היסטולוגית cyanine eriochrome של המיאלין 13. לבצע את כל השלבים בRT. שקופיות אוויר יבש למשך 30 דקות. מגלשות מקום בניקוי הסוכן עבור 1 דקות ואחריו להחזרת נוזלים בפתרונות אתנול מדורג (100%, 95%, 90%, 70%, 50%, מים) 1 דקות כל אחד.
- מגלשות מקום בeriochrome פתרון cyanine במשך 15 דקות, ואחריו שטיפת 1 דקות במים. להבדיל ב0.5% אמוניום הידרוקסיד במשך 10 שניות, ואחריו שטיפת 1 דקות במים. ליבש בפתרונות אתנול מדורגים (הפוך סדר כפי שתואר לעיל) 1 דקות כל אחד, coverslip עם תקשורת הרכבה, ותמונה במיל בהיר שדהcroscope.
- השתמש אימונוהיסטוכימיה לדמיין אקסונים ומיאלין. שקופיות אוויר יבש למשך 30 דקות. ליבש עם אתנול מדורג (מים, 50%, 70%, 90%, 95%, 100%) עבור 2 דקות כל אחד ב RT, אז הפוך כדי חזרה למים. צעד זה תוצאות ברזולוציה גבוהה יותר של טבעות המיאלין פרט 14.
- לחסום אינטראקציות נוגדן שאינם ספציפיות באמצעות סרום עיזים 10% ו 0.25% X-100 טריטון בPBS במשך 60 דקות ב RT. לדלל נוגדנים ראשוניים (עכבר אנטי-SMI312 1: 2,000, ארנב נגד MBP 1: 1,000) בPBS ולדגור על O שקופיות / N ב 4 מעלות צלזיוס.
- לשטוף 5 פעמים ל5 דקות עם PBS ב RT. לדלל נוגדנים משני (Alexa 488 נגד ארנב 1: 500, 546 Alexa אנטי עכבר 1: 500) בPBS ולדגור על שקופיות עבור 60 דקות ב RT. לשטוף 5 פעמים ל5 דקות עם PBS ב RT. הר שקופיות עם coverslips באמצעות gelvatol ותמונה במיקרוסקופ פלואורסצנטי.
- השתמש אימונוהיסטוכימיה לדמיין תאים של שושלת oligodendrocyte. בצע את ההליך לרח 'ep 4.7, השמטת צעד התייבשות / התייבשות, ושימוש בסרום 10% סוס במקום עז בסרום. השתמש בדילולי הנוגדן הראשוניים הבאים: עז נגד PDGFRα 1: 100, עכבר אנטי-גג 1 '1: 200, ארנב נגד Olig2 1: 200. השתמש בדילולים הבאים המשניים הנוגדן: Alexa 488 אנטי-עז 1: 500, 594 Alexa אנטי עכבר 1: 500, Alexa 647 נגד ארנב 1: 500.
- כדי להכין רקמות לחתך למחצה או ultrathin, ראשון לבצע זלוף transcardial 12 עם 20 מיליליטר PBS RT ואחריו 20 מיליליטר 4% paraformaldehyde glutaraldehyde / 1% קרים כקרח בPBS. הסר חוט השדרה כמתואר בשלב 4.3. תקן O / N ב 4% glutaraldehyde / 1% paraformaldehyde בPBS על 4 מעלות צלזיוס.
- זהה את אתר ההזרקה כמתואר בשלב 4.4. חותכי חתיכה של רקמה המכילה את אתר ההזרקה 1 מ"מ. ניתן להכין בלוקים 1 מ"מ נוסף משני צדי הנגע גם אם תרצה בכך.
- במנדף, להוסיף 10 פעמים 1% tetroxide אוסמיום / ferrocyanide אשלגן 1.5% נפח לכל בלוק על קרחבמשך 60 דקות.
הערה: tetroxide אוסמיום הוא חומר רעיל ביותר ויש לטפל בזהירות רבה. כל החומרים במגע עם tetroxide אוסמיום צריכים להיות ממוקמים בשמן תירס (פעמיים נפח כפתרון tetroxide אוסמיום) לנטרול. - לשטוף מיתרים 3 פעמים עם 0.2 M cacodylate במשך 10 דקות ב RT, השלכת בשמן תירס. ליבש עם פתרונות מדורגים אתנול (מים, 50%, 70%, 90%, פי 2 עם 95%, פי 2 עם 100%, פי 2 עם פרופילן אוקסיד) במשך 10 דקות ב RT.
- מיתרים להטביע בשרף לפי הוראות יצרן.
- לחתוך בלוקים על ultramicrotome והר סעיפים על טיפות מים על שקופיות מיקרוסקופ. מגלשות מקום על צלחת חמה (50 מעלות צלזיוס בערך) עד יבש.
- דמיינו המיאלין על ידי הוספה כמה טיפות של toluidine 1% הכחולים / 2% פתרון בורקס על השקופיות במשך 10-15 שניות על 50 מעלות צלזיוס. לשטוף עם מים ויבשים, וcoverslip עם תקשורת הרכבה. חלקי תמונה על מיקרוסקופ שדה בהיר.
Representative Results
הזרקת מוקד של lysolecithin לחומר לבן הגחון מייצרת נגע demyelinating דיסקרטי שניתן לזהות על פני מרחק של כ -3 מ"מ (איור 2). מכתים immunohistochemical של ליבת הנגע למיאלין (MBP) ואקסונים (SMI312) מראה האקסונים שהופשטו מהמיאלין ב -7 ימים (איור 3). ב -14 ימים, אקסונים רבים מוקפים בטבעות MBP-חיוביות, המציעה את המופע של חידוש יצירת המיאלין. מכתים לתאים של שושלת oligodendrocyte (PDGFRα, Olig2, גג 1 '), יש עלייה משמעותית בשני המספר הכולל של תאים ב 14 ימים לעומת 7 ימים, כמו גם ההפצה של oligodendrocytes הבוגרת בהשוואה לOPCs (איור 4) . עולה בקנה אחד עם ממצא זה, סעיפי semithin המוכתמים בtoluidine הכחול לחשוף את הנוכחות של נדני המיאלין דקים ב -14 ימים שאותרו רק לעתים נדירות ב7 ימים (איור 5), מצביע על כך שאלו remyelinated internodes.
ההליך הוא מאוד לשחזור בין בעלי החיים. וריאציה מתרחשת כאשר נשימה כבדה משנה את המצב הנייח של הנימים-זה בדרך כלל לא בעיה עם הרגעה הולמת. נזק לאקסונים נראה מינימאלי, למעט במרכז מאוד של הנגע, אשר תואר מאז השימוש המוקדם ביותר של המודל 1. אנו מאמינים שזה יהיה פגיעה מכאנית מנימי הזכוכית, כפי שהוא גם נצפים בPBS מוזרק בקרות. עם זאת, שונות נוטה להיות קטן, ואנחנו ואחרים באמצעות הליך דומה זיהינו הבדלים בין תנאי ניסוי עם כמה כמו 4 חיות לכל קבוצה 15.
איור 1. אסיפה של מזרק הזרקה. () האגוז של מזרק ההזרקה היא מושחלת על t הוא קצו השטוח של נימי הזכוכית, ואחריו 2 ferrules כך שההזדווגות שלהם מסתיימת משתלבים. ברגע שהנימים הן צמודה היטב בטבעת חזוק חרוטי, ההרכבה מוברגת יד הדוקה על הסוף של מזרק הזרקה. (ב) חתיכת מרכז דיסק גומי עם מחט רכזת מתכת מחוברת למזרק תחול ולהחליק אותו ל הבסיס. (ג) משיכה lysolecithin פתרון לתוך המזרק תחול. (ד) בעדינות לדכא את המזרק תחול עד הטיפה הראשונה של lysolecithin גלויה בקצה המחט. (E) הכנס את המזרק תחול לתוך החבית של ההזרקה מזרק, מה שהופך את חותם משרד עם דיסק הגומי. בעדינות לוחץ על הפתרון עד שהוא רץ לסוף הנימים. לסגת בזהירות את המזרק תחול תוך שמירה על לחץ על הבוכנה כדי להסיר את מחט רכזת מתכת ללא החדרת בועות אוויר לתוך מזרק הזרקה.להעלות / 52,679 52679fig1large.jpg "target =" / _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
נציג איור 2. lysolecithin הנגע מוכתם בeriochrome cyanine. סעיפים סידוריים (במרווחים 400 מיקרומטר בנפרד) של נגע lysolecithin אופייני בגיל 14 ימים מוכתמים בeriochrome cyanine לדמיין המיאלין (כחול). הערה demyelination שמוגבל לחומר לבן הגחון ושמשתרע על פני כ הנגע 3 מ"מ במקורי / כיוון הזנב. בר סולם = 1 מ"מ. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
האקסונים איור 3. והמיאלין במודל lysolecithin. (א) דמה (PBS) מוזרק בחוט השדרה בשעה 7 ימים תערוכות אקסונים בריאים שמוקפים בטבעות המיאלין. (B) lysolecithin נגע בתערוכות 7 ימים ערומים האקסונים כמו גם המיאלין המושפל. (ג) בגיל 14 ימים, חלקם של האקסונים (דוגמאות מצוינות עם ראשי חץ לבנים) קשורים עם הופעתו של טבעות מיאלין. בר סולם = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. תאי שושלת oligodendrocyte במודל lysolecithin. (A, C) בשעת 7 ימים, יש ייצוג גדול יותר של PDGFRα + OPCs (ברים לבנים) ביחס לoligodendrocytes + גג 1 '(ברים מג'נטה); המספרים בתוך הברים מייצגים אחוזים. Olig2 נבדק ללאשר צביעת תאי שושלת oligodendrocyte. (B, C) בגיל 14 ימים, יש עלייה משמעותית במספר הכולל של תאי שושלת oligodendrocyte לעומת 7 ימים (p <0.05, t-test שני זנב, n = 4 לכל קבוצה ). יש גם עלייה משמעותית בחלוקת oligodendrocytes לOPCs ב 14 ימים לעומת 7 ימים (p <0.0001, הבדיקה המדויקת של פישר). בר סולם = 10 מיקרומטר. כל שדה הוא נתפס בהגדלה מקורית של 60x. ערכים הם ממוצעים ± SD. * מציין p <0.05. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. חידוש יצירת המיאלין במודל lysolecithin. Toluidine כחול חתך המוכתם semithin סעיף של החומר לבן הגחון בhea ()מטונף עכבר תערוכות האקסונים על פני טווח רחב של קליבר עם עובי המיאלין בהתאמה. (ב) בשעה 7 ימים, חוסר נדני המיאלין נצפה בסמוך לאזור מושפע (מימין למטה). (ג) בגיל 14 ימים, נדנים דקים myelinated ( דוגמאות מצוינות עם ראשי חץ אדומים) מופיעות ברחבי הנגע, מעיד על מגזרי remyelinated. בר סולם = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Discussion
מספר המודלים של בעלי החיים פותחו ללמוד MS, רוב recognizably המודל הניסיוני Encephalomyelitis אוטואימוניות (EAE). בEAE, מכרסמים הם חוסנו נגד שבר של פפטיד המיאלין ועוברים התפתחות נגע דלקתית המתבטאת בשיתוק עולה. בעוד מודל זה היה שימושי עבור בדיקות פרה-קליניות של תרופות טרשת נפוצה המערכת החיסונית, זה לא אידיאלי ללימוד חידוש יצירת המיאלין משלוש סיבות עיקריות: ראשית, המיקום של נגעים דלקתיים הוא אקראי במידה מסוימת, ואיתור נגעים בעת עיבוד רקמות ללמחצה או ultrathin חלקים יכולים להיות מאתגרים. השני הוא שחידוש יצירת המיאלין מתרחש על פני כמובן זמן מסוים, והגיל של נגע EAE אחת המדויק לא ניתן לדעת בלי הדמיה מגנטית לא פולשנית מתמשכת תהודה. השלישי הוא שחידוש יצירת המיאלין הוא תופעה מתרחשת באופן טבעי במכרסמים, וראיה לחידוש יצירת המיאלין הבאה טיפול תרופתי בEAE לא יכולה להיות תוצאה העיקרית של התרופה, אבל בסטיד תופעה משנית של הפחתת דלקת.
שיטה נפוצה נוספת של ייצור demyelination מושגת על ידי החדרת cuprizone chelator הנחושת בתזונה. כתוצאה מכך demyelination הנרחב, בעיקר בכפיס המוח. יש מגבלות בלימוד כפיס המוח כאתר של חידוש יצירת המיאלין מהסיבות הבאות: ראשית, קטרי האקסון (ובכך עובי המיאלין) הם קטנים יותר מאשר אזורים אחרים של מערכת העצבים המרכזית, ונדנים כך remyelinated דק יכולים להיות שאין להבחין בין אלה שאף פעם לא היו demyelinated. שנית, משום שכפיס מוח העכבר מכיל אקסונים unmyelinated> 70% 16, זה יכול להיות לא ברור אם קטע remyelinated הוא תיקון אמיתי של המיאלין נפגע או דה נובו סינתזת המיאלין במבוגרים, אשר מתרחש בדרך כלל 17.
זה האמונה שלנו שהמודל הטוב ביותר ללימוד חידוש יצירת המיאלין הוא ההזרקה הישירה של רעלים, או lysolecithin, ethidברומיד ium, או אחר, לpeduncles הזנב המוחית 18 או חומר לבן בחוט השדרה. המיקום לשעבר מושגת רק על ידי הזרקת stereotactic 3-ממד מדויק, ומוגבל למכרסמים גדולים יותר (חולדות) בשל גודלו הקטן של peduncles המוח הקטן. זה אינו כולל את המשאב הנרחב של עכברים הטרנסגניים בלימוד דה וחידוש יצירת המיאלין. חוט השדרה, לעומת זאת, מכיל קטעים רבים גדולים חומר לבנים כי הם בקלות בניתוח נגיש. רווחים בין החוליות במגזר החזה מקורי מאפשרים חשיפה של חוט השדרה ללא הצורך בlaminectomy, אשר הוא צעד הכרחי בפרוצדורות כירורגיות בבית חזה הזנב. יתרון של מיקוד ספציפי בחומר לבן הגחון הוא שהאקסונים הם אחיד יותר גדולים מהחומר לבן גב, מה שהופך את הכימות של חידוש יצירת המיאלין פחות מעורפל משימה דומה לאתגרים הקשורים בכפיס המוח. בנוסף, החומר לבן הגחון מפצה t הרבה יותר גדולarget אזור להזריק; כמה מאה מיקרונים רוחבי באזור הגב יעמידו את הנימים מחוץ לטור, ואילו באותו הסטייה ventrally עדיין לייצר נגע demyelinating בולט. פרוטוקולים כמה להזריק lysolecithin לשני הגב וגחון עמודות של אותה החיה 19. זה יכול להגדיל הן את הסבירות למיקום נימים נכונה ומספר הנגעים לכימות בפחות בעלי חיים. בעוד שהנתונים הנוכחיים המוצגים הנו מבעלי חיים ישנים 8-10 שבוע בזמן של פעולה, גם היה לנו הצלחה באותו אופן על עכברים ישנים 8-10 חודשים, שבו חידוש יצירת המיאלין מתואר כניכר איטי 4.
כימות של חידוש יצירת המיאלין היא לא התחייבות של מה בכך. דוגמה מרכזית טוענת כי מגזרי remyelinated הם קצרים יותר באורך ודק יותר בממוצע מאשר עמיתיהם הבריאים, ולכן חישובי g-יחס (בקוטר האקסון מחולק בהאקסון + קוטר מיאלין) של חתך רוחב-למחצה oסעיפי Ultrathin r הפכו הליך סטנדרטי. עם זאת, ידוע כי מגזרי remyelinated לעבות לאורך זמן 2 ומחקר שנערך לאחרונה באמצעות כתב מהונדס של oligodendrocytes remyelinating עולה כי internodes רב הפך סופו של הדבר שאין להבחין בין שליטה 20. כימות מספר oligodendrocytes הבוגרת בתוך הנגע היא דרך עקיפה למדידת תיקון, כoligodendrocytes מסוגלת לעשות מספר רחב של internodes, וחלק משמעותי במודל בהתאם-חידוש יצירת המיאלין משומש יכול להתרחש מתאי שוואן 3. כמובן, כמו חידוש יצירת המיאלין נקשר לשיקום הולכה הקופצנית 21, המדד האולטימטיבי של תיקון יהיה התאוששות תפקודית של גירעונות נוירולוגיות. בעוד חידוש יצירת המיאלין נקשר להתאוששות של תפקוד בכמה מינים 22,23, זה לא הפך הליך סטנדרטי במחקרי lysolecithin עכבריים. זה כנראה עקב חוסר observ הגלויגירעונות מסוגלים מנגעים או הגבי או הגחון, בהשוואה לדגמי demyelination חזקים יותר כגון EAE ואפילו cuprizone. אנו מאמינים כי ליקויים תפקודיים הנובעים מlysolecithin הזרקה, והתאוששות שלאחר מכן עם חידוש יצירת המיאלין, יהיו רק נצפים באמצעות בדיקות רגישות של תפקוד הסנסורית בסדר.
חיפוש PubMed של "חידוש יצירת המיאלין" לצד אחד מהמודלים של בעלי החיים המפורטים לעיל, אם כי גישה מתודולוגית גסה, תערוכות להיטי חיפוש פחות לlysolecithin (109) בהשוואה לEAE (188) וcuprizone (197). אם הטענה שלנו שlysolecithin demyelination הוא הגישה מעולה ללימוד חידוש יצירת המיאלין, למה זה דן לפחות? אולי חשש לשימוש בשיטה זו נובע מאמונה של קושי טכני בביצוע הפעולה כירורגית. למעשה, הליך זה הוא מהיר, יעיל וחסכוני, ואין קשה יותר מנתיחת רקמה שגרתית, הדורש חומרים שהם כל commerזמין בייחוד-. תקוותנו הוא כי פרוטוקול זה מוכיח שימושי עבור אלה שרוצים להוסיף מודל זה חזק לרפרטואר שלהם ללימוד תחום המרתק והרחבת של תיקון המיאלין.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| spring scissors | Fine Science Tools | 15004-08 | |
| forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| retractor | Fine Science Tools | 17003-03 | |
| clippers | Philips | QG3330 | |
| heating recovery chamber | Peco Services | V1200 | |
| surgical tape | 3M | 1527-1 | |
| scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| scalpel blade | Feather | No. 15 | |
| sponge spear | Beaver Visitec | 581089 | |
| 5-0 Vicryl sutures | Ethicon | J511G | |
| curved ToughCut spring scissors | Fine Science Tools | 15123-12 | |
| 32 G metal needle | BD | 305106 | |
| needle holders | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| angled forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| cotton tipped applicator | Puritan | 806-WC | |
| gauze pads | Safe Cross First Aid | 3763 | |
| 10 μl syringe | Hamilton | 7635-01 | make sure to purchase the microliter, not gastight syringe |
| compression fitting | Hamilton | 55750-01 | contains the 2 ferrules and removable nut, but the nut that comes with the 10 μl syringe is a tighter fit |
| priming kit | Hamilton | PRMKIT | contains the priming syringe, removable hub needle and the rubber discs |
| pre-pulled glass capillaries | WPI | TIP10TW1 (pack of 10) | contains capillaries with 10 μm inner diameter. 30 μm inner diameter also work (TIP30TW1) |
| stereotactic frame | David Kopf instruments | Model 900 | |
| Ultrasonic cleaner | Fisher Scientific | FS-20 | |
| Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound | VWR | 25608-930 | |
| Tissue-Tek intermediate cryomold | VWR | 25608-924 | |
| cryostat | Leica | CM1900 | |
| microscope slides | VWR | 48311-703 | |
| bright field microscope | Olympus | BX51 | |
| ultramicrotome | Leica EM UC7 | EM UC7 | |
| Lysophosphatidylchoine | Sigma | L1381 | |
| 2-methylbutane | Sigma | M32631 | |
| Triton x-100 | Sigma | X-100 | |
| goat serum | Sigma | G9023 | |
| Mouse anti-SMI312 antibody | Covance | SMI-312R | 1:2,000 dilution |
| Rabbit anti-MBP antibody | Abcam | AB40390 | 1:1000 dilution |
| Goat anti-PDGFRα antibody | R&D Systems | AF1062 | 1:100 dilution |
| Rabbit anti-Olig2 antibody | Millipore | AB9610 | 1:200 dilution |
| Mouse anti-CC1 antibody | Calbiochem | OP80 | 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Life technologies | A-11008 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG | Life technologies | A-11003 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG | Jackson Immuno | 705-546-147 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG | Jackson Immuno | 715-586-151 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG | Jackson Immuno | 711-606-152 | 1:500 dilution |
| PBS | Oxoid | BR0014 | |
| isopropyl alcohol | Sigma | 109827 | |
| ketamine | CDMV | ||
| xylazine | CDMV | ||
| iodine | West Penetone | 2021 | |
| Vaseline petroleum jelly | VWR | CA05971 | |
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| sucrose | Sigma | S5016 | |
| Eriochrome Cyanine R | Sigma | 32752 | |
| sulfuric acid | Sigma | 320501 | |
| iron(III) chloride | Sigma | 157740 | |
| ammonium hydroxide | Sigma | 320145 | |
| Acrytol | Leica Biosystems | 3801700 | |
| Citrisolv | Fisher Scientific | 22-143-975 | |
| horse serum | Sigma | H0146 | |
| glutaraldehyde | Electron Micrscopy Sciences | 16220 | |
| osmum tetroxide | Electron Micrscopy Sciences | 19150 | highly toxic |
| potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate | Sigma | P3289 | |
| corn oil | Sigma | C8267 | |
| polyvinyl alcohol | Sigma | P8136 | |
| glycerol | Sigma | G9012 | |
| cacodylic acid | Electron Micrscopy Sciences | 12300 | |
| propylene oxide | Electron Micrscopy Sciences | 20401 | |
| EMBED kit | Electron Micrscopy Sciences | 14120 | |
| Toluidine Blue O | Sigma | T3260 | |
| Sodium tetraborate decahydrate | Sigma | S9640 | |
| Recipes | |||
| Eriochrome cyanine solution | |||
| Ingredient | Amount to add | ||
| Eriochrome Cyanine R | 0.8 g | ||
| sulfuric acid | 400 ml 0.5% | ||
| iron(III)chloride | 20 ml 10% | ||
| water | 80 ml | ||
| *add eriochrome cyanine to sulfuric acid, followed by iron(III) chloride and water. Solution can be kept after use. Make fresh once per year. | |||
| Gelvatol | |||
| Ingredient | Amount to add | ||
| PBS | 140 mL | ||
| polyvinyl alcohol | 20 g | ||
| glycerol | 40 g | ||
| *mix well, place at 37 °C O/N, centrifuge at 1,960 x g 30 min, aliquot into 40 tubes |
References
- Blakemore, W. F., Eames, R. A., Smith, K. J., McDonald, W. I. Remyelination in the spinal cord of the cat following intraspinal injections of lysolecithin. J. Neurol. Sci. 33 (1-3), 31-43 (1977).
- Jeffery, N. D., Blakemore, W. F. Remyelination of mouse spinal cord axons demyelinated by local injection of lysolecithin. J. Neurocytol. 24 (10), 775-781 (1995).
- Blakemore, W. F. Invasion of Schwann-cells into the spinal-cord of rat following local injections of lysolecithin. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 2 (1), 21-39 (1976).
- Shields, S. A., Gilson, J. M., Blakemore, W. F., Franklin, R. J. Remyelination occurs as extensively but more slowly in old rats compared to young rats following gliotoxin-induced CNS demyelination. Glia. 28 (1), 77-83 (1999).
- Patrikios, P., et al. Remyelination is extensive in a subset of multiple sclerosis patients. Brain. 129 (Pt 12), 3165-3172 (2006).
- Keough, M. B., Yong, V. W. Remyelination therapy for multiple sclerosis). Neurotherapeutics. 10 (1), 44-54 (2013).
- Hall, S. M. The effect of injections of lysophosphatidyl choline into white matter of the adult mouse spinal cord. J. Cell Sci. 10 (2), 535-546 (1972).
- Miron, V. E., et al. M2 microglia and macrophages drive oligodendrocyte differentiation during CNS remyelination. Nat. Neurosci. 16 (9), 1211-1218 (2013).
- Kotter, M. R., Setzu, A., Sim, F. J., Van Rooijen, N., Franklin, R. J. Macrophage depletion impairs oligodendrocyte remyelination following lysolecithin-induced demyelination. Glia. 35 (3), 202-212 (2001).
- Lau, L. W., et al. Chondroitin sulfate proteoglycans in demyelinated lesions impair remyelination. Ann. Neurol. 72 (3), 419-432 (2012).
- Fancy, S. P., et al. Dysregulation of the Wnt pathway inhibits timely myelination and remyelination in the mammalian CNS. Genes Dev. 23 (13), 1571-1585 (2009).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), (2012).
- Skihar, V., et al. Promoting oligodendrogenesis and myelin repair using the multiple sclerosis medication glatiramer acetate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (42), 17992-17997 (2009).
- Plemel, J. R., et al. Platelet-derived growth factor-responsive neural precursors give rise to myelinating oligodendrocytes after transplantation into the spinal cords of contused rats and dysmyelinated mice. Glia. 59 (12), 1891-1910 (2011).
- Chong, S. Y., et al. Neurite outgrowth inhibitor Nogo-A establishes spatial segregation and extent of oligodendrocyte myelination. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (4), 1299-1304 (2012).
- Sturrock, R. R. Myelination of the mouse corpus callosum. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 6 (6), 415-420 (1980).
- Young, K. M., et al. Oligodendrocyte dynamics in the healthy adult CNS: evidence for myelin remodeling. Neuron. 77 (5), 873-885 (2013).
- Woodruff, R. H., Franklin, R. J. Demyelination and remyelination of the caudal cerebellar peduncle of adult rats following stereotaxic injections of lysolecithin, ethidium bromide, and complement/anti-galactocerebroside: a comparative study. Glia. 25 (3), 216-228 (1999).
- Mei, F., et al. Micropillar assays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis. Nat. Med. 20 (8), 954-960 (2014).
- Powers, B. E., et al. Remyelination reporter reveals prolonged refinement of spontaneously regenerated myelin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 4075-4080 (2013).
- Smith, K. J., Blakemore, W. F., McDonald, W. I. Central remyelination restores secure conduction. Nature. 280 (5721), 395-396 (1979).
- Jeffery, N. D., Blakemore, W. F. Locomotor deficits induced by experimental spinal cord demyelination are abolished by spontaneous remyelination. Brain. 120 (Pt 1), 27-37 (1997).
- Duncan, I. D., Brower, A., Kondo, Y., Curlee, J. F. Jr, Schultz, R. D. Extensive remyelination of the CNS leads to functional recovery. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (16), 6832-6836 (2009).
