Protocol
1. trin for at udføre på dagen før Assay
- Pick L4 stage orme til frisk nematode vækstmedium (NGM) plader podet med en græsplæne på OP50 E. coli, og kultur dem ved 20 Co / N. Hvert assay tilstand kræver 10 orme; vælge et overskud af orme at muliggøre O / N tab af orme.
- Kun assay dyr, der først dages voksne; mange mutanter vokse langsommere end vildtype. Juster timingen af plukke for stammer, der har forsinket udvikling, således at alle testede dyr er først-dages voksne.
2. trin for at udføre på dagen for analysen
- Forberedelse til analysen:
- Udfør analyser på standard podede 60 x 15 mm NGM plader. Tør alle de plader, der skal anvendes ved 37 ° C i 2 timer med låg off. For hver eksperimentel forsøg, bruge fire tørrede NGM plader; disse vil være 0 mM og 400 mM ethanol assayplader og deres ledsagende akklimatisering plader.
BEMÆRK:Brugen af NGM plader er vigtigt her; forskelle i sammensætningen af pladerne, især deres osmolaritet kan kraftigt påvirke dosisrespons ethanol på adfærd, dette skyldes, i det mindste delvis, at ændringer i mængden af ethanol akkumuleret fra dyrene 20. NGM agar er 160 mOsm. - Efter tørring vejes hver unseeded NGM plader, der skal anvendes i assayet og bemærk vægt. Bestem mængden af mediet i pladerne baseret på vægten af en tom plade. At tilnærme omdannelse af vægten af agar til volumen, antage, at medierne vejer det samme som en tilsvarende mængde vand.
BEMÆRK: Vores mest konsistente resultater er blevet fundet med NGM medier, har dehydrerede tilstrækkeligt, at en original 10 ml volumen har en post-tørring volumen mellem 8,3-8,9 ml. Et alternativ til den 2 hr tørre tid er at tørre indtil pladerne nå denne mængde interval for at tage højde for forskelle i væksthuse. - Smelt 4 kobber ringe (indvendig diameter 1.6 cm) i overfladen af hver af pladerne for at virke som corrals for de forskellige genotyper eller behandlingsgrupper på worms.Grasp hver ring med en pincet, og varme i en flamme (en stærk flamme fra en bunsenbrænder fungerer godt) til ca. 3 sek. Umiddelbart sætte ringen på en plade, mens du stadig holder ringen med pincet for at forhindre det i at "springe".
- Kontroller, at ringen hviler fladt mod overfladen af agar ved at trykke forsigtigt ned med pincet på flere punkter på ringen. Når du placerer ringen, være omhyggelig med at give plads til yderligere tre ringe.
- Smelt de tre yderligere kobberringe i overfladen af pladen, idet man placere dem så tæt sammen som muligt, således at alle fire vil være i synsfeltet af kameraet.
BEMÆRK: Gør en god forsegling med agar er vigtigt at holde ormene i ringene under analysen. Ringe, der springer rundt på pladen er usandsynligt, at den korrekte tætning med agar ogkan ar agar, hvilket tillader orme at grave sig ned og forstyrrer visualisere orme. - For hver assayplade forberede en ledsagende "akklimatisering" plade, som skal tørres og upodet og får ingen ethanol. Placer fire kobber ringe på disse plader.
- Mærk bunden af pladerne ved siden af hver ring med ormen stamme, der skal anvendes i ringen, idet man ikke skrive i synsfeltet af selve ringen. Match etiketterne på assaypladen med sin ledsager akklimatisering plade.
- Beregn mængden af 100% ethanol for at tilføje til hver assay pladen, så at den endelige koncentration er 0 mM eller 400 mM ethanol (vægt til volumen). For hvert forsøg (n = 1), vil der være en 0 mM og en 400 mM ethanol plade; akklimatisering plader modtager ikke ethanol. Tilsæt ethanol, pipettering det omkring overfladen af pladen. Laboratoriebrug film at forsegle pladen og lad det ækvilibrere på bænken toppen for 2 timer.
- Når 1,5 timer er udløbet, begynder akklimatisering trin af assayet, trin 2.2.
- Udfør analyser på standard podede 60 x 15 mm NGM plader. Tør alle de plader, der skal anvendes ved 37 ° C i 2 timer med låg off. For hver eksperimentel forsøg, bruge fire tørrede NGM plader; disse vil være 0 mM og 400 mM ethanol assayplader og deres ledsagende akklimatisering plader.
- Udfør bevægelse assay: Assayplader
- Overføre forsigtigt 10 orme i hver forsøgsgruppe til centrum af en kobber ring på akklimatisering plade. Fjern alle fødevarer, der er synlig på agar på dette tidspunkt ved at skrabe forsigtigt med ormen pick. Varier den rækkefølge, som de eksperimentelle grupper er sat på pladerne tværs eksperimentelle forsøg, således at de samme stammer ikke sættes på pladerne i samme rækkefølge på tværs forsøg.
BEMÆRK: Målet er at overføre dyr til pladen med minimale mængder mad, fordi hvis fødevarer på akklimatisering pladen overføres til assaypladen ormene vil aggregere omkring fødevarer og virkningen af lægemidlet på bevægelse vil blive skjult. - Vær omhyggelig med ikke at bryde overfladen af agar med pick, da dette vil gøre det muligt for orme at grave sig ned og vil forstyrre analysen. Inkuber ormene ved stuetemperatur i 30 min.
- Sørg for at der er en passende interval mellem indvielser af hver plade. En erfaren eksperimentator kan flytte 40 dyr, 10 / ring til 4 ringe i <1,5 min, men enhver interval op til 2 min er acceptabel. Standarden assay har film optagelse på 10-12 min og 30-32 min for eksponering for både 0 mm til 400 mm ethanol.
- Indled akklimatisering plade for 0 mM eksponering og akklimatisering pladen for 400 mM eksponering ca. 2 min og 30 sek fra hinanden for at give mulighed for lagring af den første film fil, før den anden film skal begynde.
- Efter 30 min akklimatiseringsperiode overføre orme fra akklimatisering plader assaypladerne. Overfør orme til assaypladerne (0 mm eller 400 mM ethanol) i samme rækkefølge, som de blev tilsat til akklimatisering plade, holde styr på timingen mellem færdiggørelse af hver plade. Forsegl pladen med laboratoriet film for at minimere tab af ethanol til fordampning.
- USE en scooping bevægelse med en tynd kant fladtrykt orm pick at indsamle orme oven på den flade pick. Udfør overførsel af orme fra upodede akklimatisering pladen til assaypladen uden brug af bakterier, der er almindeligt anvendt til at overføre orme, da det hjælper til at lime ormen til pick.
BEMÆRK: Den hastighed, hvormed dyrene overføres på dette trin er meget vigtigt, fordi de første orme på pladen vil blive udsat for ethanol længere end de sidste orme tilsat til pladen, og tidligere tidspunkter kan vise nogle tidsafhængige virkninger. Dette er den vigtigste grund til at dreje som stammer placeres på en plade først over eksperimentelle gentagelser.
- Overføre forsigtigt 10 orme i hver forsøgsgruppe til centrum af en kobber ring på akklimatisering plade. Fjern alle fødevarer, der er synlig på agar på dette tidspunkt ved at skrabe forsigtigt med ormen pick. Varier den rækkefølge, som de eksperimentelle grupper er sat på pladerne tværs eksperimentelle forsøg, således at de samme stammer ikke sættes på pladerne i samme rækkefølge på tværs forsøg.
- Udfør Locomotion assay: Optagelserne
- Brug et mikroskop / kamera kombination, der giver mulighed for samtidig billeddannelse af alle fire ringe i synsfeltet (ca. 42x42 mm 2 firkant), såsom en 0,5x mikroskop mål 0,8x forstørrelse og et kamera med en 2048x2048 7,481 m pixel CCD.
- Brug selv belysning over synsfeltet, hvilket hjælper objekt anerkendelse på intensiteten tærskel trin (se nedenfor). En 3 "x3" baggrundslys fungerer godt.
- Billede ormene på en plade placeret medie opad (låg ned), som genererer kontrast, der går tabt, når du bruger baggrundsbelysningen sammenlignet med en traditionel mikroskop transmitteres lyskilde.
- Forbered billedanalyse software til at fange time-lapse film af de bevægelige orme. Indstil software til at fange 12-bit gråtonebilleder hver 1 sekund, som en 2-min (120 ramme) film. For at reducere størrelsen på output-filen, men har bevaret tilstrækkelig billedopløsning, bruge en 2x2 binning når du fotograferer 1024x1024 pixel billeder.
- Optag film. Begynd at optage et 120-frame film af den første plade (0 mM ethanol) 10 min efter sidste orme blev placeret på den plade. Gem filmfil.
- Optag den anden plade (400 mM ethanol). Gentag denne proces forbegge plader begynder 30 min efter de sidste orm blev placeret på den første plade (0 mM ethanol) for at fange de 30-32 min tidspunkter for hver eksponering.
BEMÆRK: tilstrækkelig tid til at gemme billedfilerne efter hver fangst session før optagelsen påbegyndes på den næste plade, der skal analyseres. - For fremtidssikring af arkiverede film og give disse film, der skal åbnes og analyseres af andre offentlige domæne open source billedbehandling software programmer, såsom ImageJ 28, konvertere en kopi af hver film til 8-bit 256 gråtoner TIFF-filer.
BEMÆRK: Billedet analyse software, der beskrives her bruger et proprietært filformat.
- Analyse af film vha ImagePro software.
- Når billedet er taget, analysere film med Image-Pro Plus software eller tilsvarende.
BEMÆRK: En række andre objekt tracking software er til rådighed, der er blevet brugt med succes spore flere C. elegans på én gang 29 og en sådansoftware rimelighed erstatte det her beskrives som objekt identifikation trin er baseret på de samme principper. Den beskrevne metode vedrører Image-Pro Plus softwareversioner 6,0-6,3 og 7.0, nyere versioner af Image-Pro Plus software kan have mindre forskelle. - Analyser film på 2-min (120 ramme) segmenter. Først anvende et filter til billederne til at flade baggrunden og forbedre kontrasten af ormen objekter. Vælg filtret som følger: Menu> Proces> Filtre> Enhancement> Samkopier: Parametre: Baggrund = Mørk; Feature Bredde = 20 Pix.
- Re-gemme filmene efter filtreringstrinnet men altid bevare den originale film i sin ufiltreret form.
- Analyser bevægelse af dyr i hver ring for sig med et cirkulært område af interesse (ROI), der er placeret og dimensioneret til at overlappe med kobber ring. Identificere og spore ormene med Menu> Measure> Track Objects ... kommando; dette bringer op Tracking Data Tabel vindue. Knappen Tracking Options giver konkrete spor, der skal udelukkes, og for at begrænse eventuelle eksperimentelle artefakter.
- Under fanen Auto Tracking Brug følgende parametre: Track Parametre: Velocity grænse (søg radius) = 400 um / ramme, Acceleration grænse = Auto, Minimum samlet banelængde = 400 um, Overvejende motion type = kaotisk; Objekter i spor parametre: Tillad partielle spor = ja, Min længde = 21 frames, Tracking forudsigelse dybde = 1 ramme.
- For at starte sporing ved at klikke på Find alle spor automatisk funktion for at åbne Greven / Size dialogboksen Indstillinger og Tracking dialogboksen. Vælg Manuel indstilling for intensiteten Range Selection i Greven / Size dialogboksen, som giver den vigtige tærskel skridt, der bruger den grå skala intensitet af ormen pixels til at fremhæve en orm objekt for analyse og til at ignorere de lysere baggrund pixels.
- Justere intensiteten tærskel SLIdere (en til at indstille den øvre grænse, en til at sætte den nedre grænse) for at skabe et inkluderende interval, der fremhæver alle mørke objekter. En række 0-1,500 på en skala fra 0-4,095 er et godt udgangspunkt for finere tuning.
- Anvend en størrelse filter til at udelukke objekter, der er større og mindre end en enkelt orm objekt, såsom kobber ring og eventuelle rester på pladerne. Sæt to size parametre for at gøre dette, der dækker størrelser for de enkelte orme i en række forskellige stillinger med foranstaltningen> Vælg Målinger menupunkt på greven / Size dialogboksen Indstillinger. (Område sortiment: 28,000-120,000 um 2 og Perimeter rækkevidde: 600-2,500 um).
- Hvis en mutantstamme er væsentligt mindre eller større end andre dyr på pladen, der skal analyseres, udvide spektret af filterindstillingerne for objekt anerkendelse til at rumme forskellige størrelser af stammerne først, før sporing dyr, således at indstillinger ikke behøver at blive ændret mid-analyse.
- Afslut sporing proces ved at klikke på Fortsæt i Tracking dialogboksen. Visuelt sammenligne output spor med forløbet af hver orm i filmen for at sikre, at alle orm er repræsenteret, medmindre der er en gyldig grund til at udelukke det på grundlag af de automatiske indstillinger igen. Manuelt slette spor, der blev produceret af tilstedeværelsen af bekræftede ikke-orm objekter, der opfyldte størrelse filterkriterier.
- Brug softwaren til at beregne hastigheden af hver orm mellem hvert billede (distance til det geometriske tyngdepunkt af en genstand pr 1 sek mellem rammer) og vise den gennemsnitlige hastighed for hvert spor og den gennemsnitlige hastighed på tværs af alle spor for befolkningen i orme i kobber ring. Overvej dette sidste gennemsnit at være n = 1 i form af eksperimentelle forsøg. Eksportere dataene til et regneark til statistiske analyser og data arkivering.
- Når data er blevet registreret for første ring på pladen, skal du flytte ROI til den næste ring oggentage sporing proces, uden at ændre nogen af parametrene.
- Beregn relativ hastighed på bevægelse gennem:
- Relative hastighed (%) = behandlet (400 mM) hastighed / ubehandlet (0 mM) hastighed x 100.
BEMÆRK: Forskellige genetiske manipulationer ofte ændre den basale bevægelse på dyr. For at bestemme virkningen af ethanol på bevægelse hastighed af dyr og at være i stand til at sammenligne disse virkninger på tværs af forskellige genotyper eller betingelser, beregne en relativ hastighed.
- Når billedet er taget, analysere film med Image-Pro Plus software eller tilsvarende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Repræsentative data (figur 1) fra flere forskellige genotyper og deres parrede kontroller præsenteres 8,24; data blev specielt udvalgt som fremhæver forskelle i analyserede dyr. Graden af effekt på 10 min eksponering betragtes som den oprindelige følsomhed af en stamme, som er vist til venstre akser i figur 1B-G. Mutantstammer med en relativ hastighed større end kontrollen ved 10 min anses for at være ethanol resistente (figur 1F, G), mens mutantstammer med en relativ hastighed, der er mindre end kontrollen, anses for at være overfølsom over for ethanol (figur 1D, E). De rigtige akser i figur 1 viser graden af genvinding af hastighed mellem de 10- og 30-min tidsperioder. Dette udgør et mål for graden af udvikling af akut funktionel tolerance (AFT) og beregnes som den relative hastighed på 10 min trukket fra den relative speed ved 30 min. Stammer med større recovery-værdier anses for at have en hurtigere hastighed på udvikling af AFT sammenlignet med kontroldyr (figur 1D, f) og stammer med lavere inddrivelse værdier end kontroldyrene anses for at have lavere udvikling af AFT (figur 1C , E). Bemærk, at den målte AFT for sbp1 (ep79) (figur 1G) er Trendvisning mod en negativ opsving, men var ikke statistisk forskellig fra vildtype grundet stor varians (p = 0,08 for sammenligning mod N2 nyttiggørelse). Kar-1 koder for et tubby homolog ; BBS-1 koder for et homolog til human BBS1; læber-7 koder for et triacylglycerol lipase, fedt-1 koder for en omega-3 fedtsyre acyl desaturase; fedt-3 koder en delta-6-fedtsyredesaturase, SBP-1 koder for et homolog til human Sterol Regulatory Element bindingsproteiner (SREBPs).
Der er flere vigtige egenskaberdata til at bemærke: For det første, N2 (vildtype) kontroldata forskel på, eksperimenter; dette er sandsynligvis på grund af miljømæssige faktorer, som er vanskelige at styre, såsom absolut vandindhold eller saltkoncentration af tørrede medier og temperaturen i laboratoriet. Typisk 400 mM exogent ethanol nedtrykker hastighed N2 til ca. 30% af de ubehandlede kontroller; Men den absolutte grad af depression varierer fra eksperiment til eksperiment. Endvidere mens ca. 12% genvinding af bevægelse hastighed over 30 minutter i N2 normalt forventes, her igen tallene varierer. Vigtigere er det, medens de absolutte niveauer af følsomhed og AFT udviser dag-til-dag variation er sammenligninger mellem genotyper eller betingelser ikke afviger generelt. Det vil sige, vild-type og en mutant vil altid have lignende virkninger i forhold til hinanden; hvis en mutant forårsager et fald i AFT forhold til vild-type, vil denne reduktion skalere med mængden af AFT påvist ved vildtypen. Dette fremhæverbetydningen af udførelse parrede kontroller på samme plader på samme tid for stammer eller betingelser, der er blevet sammenlignet.
For det andet er fænotyper af initial følsomhed og AFT er genetisk adskilles. Bemærk, at oprindelige følsomhed og akut funktionel tolerance kan variere sammen eller hver for sig; eksempler er medtaget af en række fænotyper, hvor oprindelige følsomhed og AFT forskellige uafhængigt af hinanden. En ændring i en af de fænotyper forudsiger ikke en ændring i den anden fænotype, heller ikke forudsige retningen af ændringen af den anden fænotype (enten øget eller nedsat respons på ethanol).
Figur 1. Indledende ethanol følsomhed og hastigheden af udviklingen af akut funktionel tolerance (AFT) er to forskellige adfærdsmæssige reaktioner. (A) Oversigtstabel forretning af effekter af mutationer i de nævnte gener på niveauet for indledende følsomhed over for ethanol og hastigheden af udviklingen af AFT, begge er i sammenligning med de vildtype kontroller (N2 i hvert tilfælde). (B-G) Akutte bevægelseskomponenter svar til 400 mm eksogen ethanol måles til 10-12 min og 30-32 min på kontinuerlig ethanol eksponering. Relative hastigheder (% af ubehandlet hastighed) er vist til venstre akser. De grader af opsving i hastighed vises på de rigtige akser og udgør et mål for graden af AFT i løbet af denne 20-min interval. Antallet af forsøg sammenlignet er som følger: B, C, E: n = 6; G: n = 7; D: n = 9; F: n = 11. Statistisk signifikante sammenligninger (parrede t-tests) er vist: *, p <0,05; **, P <0,01. 8,24 Dataene i denne figur er modificeret fra 8,24. Please klik her for en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den enkle neurobiologi og genetiske værktøjer til rådighed i C. elegans gøre ormen en fremragende model til at studere de molekylære grundlag for virkningerne af ethanol på adfærd. Her beskriver vi et assay, der er blevet anvendt til at identificere adskillige molekylære og miljømæssige mediatorer af den akutte adfærdsmæssige respons på ethanol 8,10,20,24,25. Denne fremgangsmåde tillader differentiering og samtidig behandling af to forskellige ethanol reaktionsevne fænotyper, initial følsomhed og udvikling af akut funktionel tolerance, der tilsammen modellere sammensatte fænotype af niveauet af respons i pattedyr. Samme analyse kan let tilpasses til at studere andre farmakologiske midler, og dermed drage fordel af den samtidige test af flere stammer i vurderingen af de adfærdsmæssige virkninger af andre lægemidler.
Den 10-12 min tid vindue giver et nyttigt tidspunkt at måle indledende følsomhed af en stamme til ethanol. Analyse af virkningerne af 400 mM ethanol over første 10 min af eksponering viser hastighed effekter begynder i det andet minut af eksponering, men en konstant tilstand af effekt opnås ikke, før den syvende minut af ethanol eksponering 20. På grund af denne tidsafhængig effekt på bevægelse hastighed, vil den rækkefølge, som bestemte stammer placeres på pladen være vigtigt for enhver hastighedsmålinger forud for ottende eller niende minut (forudsat det tager mindre end 2 minutter til at placere alle de orme på ethanol plade). På disse tidligere tidspunkter nogle orme vil være mere påvirket af ethanol, blot fordi de blev placeret på pladen tidligere. Selvom en stabil indledende virkning af ethanol opnås ved syvende minut, anbefales det, at den rækkefølge, som stammer anbringes på plader varieres over replikat forsøg på at minimere enhver systematisk effekt tværs stammer på grund af denne tidsafhængige virkning af ethanol og den tid, der kræves for at flytte orme til plate.
Specifikke parametre blev valgt i Genstandssporing skridt til at minimere bias fra orme, der gentagne gange kollidere med kobber ring eller med andre orme. Objektet størrelse filter trin bør fjerne ethvert objekt fra sporing, der er større end en enkelt orm, herunder to rørende orme. Hvis en orm rører en anden orm eller kobber ring derefter sporet ender, og det ikke længere bør anerkendes som et gyldigt objekt, mens det forbliver i kontakt. Når ormen mister kontakt med det andet objekt, bliver det et nyt objekt og initierer et nyt spor. Hvis sporet foretaget af en orm, er mindre end 20 sek langt, skal det automatisk udelukkes ved at definere en banelængde på 21 frames minimum. Dette filter forhindrer forekomster af en orm bevæger sig fremad i et andet objekt (orm eller ring), vende og derefter gå frem til at røre objektet igen, som korte anfald af hurtige tilbageførsler kan skævhed den samlede gennemsnitlige hastighed af befolkningen af dyr. Ved hjælp af disse indstillinger, jegt er muligt og ikke ualmindeligt for en enkelt orm at bidrage med mere end et spor, der er større end 20 sek i længden (men mindre end 99 sek) til det samlede gennemsnit. Indstillingerne kan ændres, således at hver orm bidrager kun et enkelt spor ved at gøre den mindste banelængde 61 sek (ud af i alt 120 sek), men empirisk observation, at dette elimineret et betydeligt antal spor, og det blev konstateret, at langsommere orme, der kolliderede med andre orme mindre hyppigt vil være overrepræsenteret. Alternativt kan nye numre blive afvist at begynde efter det første billede af filmen, men derefter orme, der kolliderer tidligt i 2-minutters periode fjernes fra analyse og nyttige data vil gå tabt. Endelig er anvendelsen af 10 orme pr kobber ring repræsenterer et godt kompromis mellem at have flere repræsentative spor, der bidrager til et gennemsnit, og problemet med for mange orm kollisioner.
Denne adfærdsmæssige assay har flere vigtigefordele for studiet af ethanol respons adfærd i orme. Samtidig afprøvning af flere genotyper på den samme plade er muligt gennem anvendelse af kobber "folde". Denne innovation har flere forskellige fordele. Først i dette assay kontrol tilstand eller stamme altid testet på den samme plade på samme tid som den eksperimentelle betingelse eller stamme, og kun testes samtidigt direkte sammenlignes dyr. Dette er af særlig betydning, fordi adfærdsmæssige assays ofte påvirkes af miljøet, og dag-til-dag variation i adfærdsmæssige reaktioner kan øge støjen i analysen og nedsætte evnen til at detektere signaler. Den side-by-side sammenligning af eksperimentelle grupper i identiske betingelser i det væsentlige nedsætter virkningen af dag-til-dag miljømæssige variation, hvilket er en stor fordel ved denne fremgangsmåde. For det andet, anvendelse af kobber corrals indeholder dyr i synsfeltet, hvilket gør det muligt bevægelseskomponenter assays, der skal udføres i enbsence af fødevarer. Når frataget mad, orme bevæge sig hurtigt og har tendens til at sprede på jagt efter bakterier; uden ringene vil orme forlade synsfeltet i løbet af assayet. Desuden er ormene frastødt af kobber og har tendens til at forblive tættere på midten af ringene, hvilket gør dem nemme at visualisere. Den omstændighed, at ormene bevæge sig hurtigt i disse assaybetingelser væsentligt øger opløsningen at detektere depressive virkninger af ethanol; når orme bevæger sig langsomt, de hastigheder nå gulvet i evnen til at detektere dem tidligere. Bemærk, at kobber er giftigt for orme; mens ringene ikke synes at påvirke de akutte reaktioner til ethanol, analyseret i denne protokol, forlænget inkubation af dyr i ringene (over flere timer) kan ikke anbefales. For det tredje, med denne eksperimentelle design, kan en enkelt analyse vurdere de adfærdsmæssige reaktioner på op til fire forskellige forsøgsgrupper. Derfor tid at akkumulere statistisk meningsfuld data reduceres. I Additipå, da en enkelt digital film er lavet, dette mindsker hukommelse arealkrav for langtidsopbevaring af primære data. Endelig, i hvert forsøg, er opførslen af 10 dyr i hver forsøgsgruppe undersøgt. Hastighederne af de 10 individer midles for at generere en sammensat hastighed i et enkelt assay, således at n = 1 forsøget. Denne gennemsnitsberegning af adfærd mange dyr yderligere formindsker variation i disse følsomme adfærdsmæssige analyser og yderligere øger opløsningen til at opdage subtile effekter på ethanol respons adfærd.
Der er begrænsninger for de metoder, der er beskrevet her, hvoraf nogle gælder for adfærdsmæssige analyser af eventuelle mutant dyr. En væsentlig begrænsning ved denne fremgangsmåde er, at mutante orme, der har meget signifikant reduceret basale hastigheder på grund af manglende koordination eller i nærheden lammelse, kan identificeres som falsk positive for resistens over for virkningerne af ethanol, fordi deres målte hastighed falder til en værdi thpå, er under grænsen på nøjagtig detektion for en bestemt billeddannelse setup. Da de fleste objekt tracking software programmer bruger en tyngdepunkt (tyngdepunkt) som den position, hvorfra at måle afstand mellem rammer, kan en stationær orm, der flytter sit hoved stadig generere et skift i placeringen af tyngdepunkt, og at skift vil blive opdaget som bevægelse. Derfor er en orm skal bevæger sig hurtigere end skyldes subtile skift i kropsholdning for at måle som sande bevægelse. Worms udsat for ethanol er ikke lammet, men de er meget ukoordineret, så med orme, der allerede har et underskud i bevægelse, er det muligt, at ethanol eksponering vil falde deres hastigheder under denne tekniske etage effekt. Øge tiden mellem rammer så større ændringer i kroppens stilling vil være adskilles fra subtile forskydninger i tyngdepunkt holdning ikke løse dette problem, hvis tiden mellem frames forlænges meget mere end 1 sek bliver det vanskeligere for object tracking software for at sikre, at den samme orm bidrager til et spor i stedet for et spor hoppe mellem tæt, men ikke rører orme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Disse undersøgelser blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health, National Institute for alkoholisme og alkoholmisbrug: R01AA016837 (JCB) og P20AA017828 (AGD og JCB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C. elegans strains | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| 60 x 15 mm Petri plates, triple vented | Greiner Bio-One | 628161 | Other plate brands will suffice. |
| NGM agar | Various | NaCl (3 g/L), agar (17 g/L), peptone (2.5 g/L), 1 ml cholesterol (5 mg/ml in ethanol), 1 ml (1 M) MgSO4, 1 ml (1 M) CaCl2, 25 ml (1 M) KPO4, pH=6, 975 ml H2O | |
| Forceps | Various | e.g., Fisher Scientific #10300 | |
| 37 °C Incubator | Various | For drying agar | |
| Digital balance | Various | For determining plate weights and agar volume | |
| Copper rings | Plumbmaster | STK#35583 (48 cap thread gasket) | 1.6 cm inner diameter, 1.8 cm outer diameter copper rings |
| 100% ethanol | Various | ||
| Parafilm M | Bemis | PM996 | |
| CCD camera | QImaging | RET-4000R-F-M-12 | This camera has a large field of view. |
| Stereomicroscope with C-mount and 0.5X objective | Leica | MZ6 | Discontinued model, M60 is current equivalent. |
| Light source | Schott | A08923 | 3”x3” backlight for even illumination across the field of view |
| Imaging and tracking software | Media Cybernetics | ImagePro-Plus v6.0-6.3 | Newer versions of the software have tracking functions. |
References
- Prescott, C. A., Kendler, K. S. Genetic and environmental contributions to alcohol abuse and dependence in a population-based sample of male twins. Am. J. Psychiatry. 156, 34-40 (1999).
- Schuckit, M. A. Genetics of the risk for alcoholism. Am. J. Addict. Article Review. 9, 103-112 (2000).
- Heath, A. C., et al. Genetic differences in alcohol sensitivity and the inheritance of alcoholism risk. Psychol. Med. 29, 1069-1081 (1999).
- Rodriguez, L. A., Wilson, J. R., Nagoshi, C. T. Does psychomotor sensitivity to alcohol predict subsequent alcohol use. Alcohol. Clin. Exp. Res. 17, 155-161 (1993).
- Schuckit, M. A., Smith, T. L. An 8-year follow-up of 450 sons of alcoholic and control subjects. Arch. Gen. Psychiatry. 53, 202-210 (1996).
- Kalu, N., et al. Heritability of level of response and association with recent drinking history in nonalcohol-dependent drinkers. Alcohol. Clin. Exp. Res. 36, 522-529 (2012).
- Davis, S. J., Scott, L. L., Hu, K., Pierce-Shimomura, J. T. Conserved single residue in the BK potassium channel required for activation by alcohol and intoxication in. C. elegans. J. Neurosci. 34, 9562-9573 (2014).
- Raabe, R. C., Mathies, L. D., Davies, A. G., Bettinger, J. C. The Omega-3 Fatty Acid Eicosapentaenoic Acid Is Required for Normal Alcohol Response Behaviors in C. elegans. PLoS ONE. 9, e105999 (2014).
- Topper, S. M., Aguilar, S. C., Topper, V. Y., Elbel, E., Pierce-Shimomura, J. T. Alcohol disinhibition of behaviors in C. elegans. PLoS ONE. 9, e92965 (2014).
- Bhandari, P., et al. Chloride intracellular channels modulate acute ethanol behaviors Drosophila,Caenorhabditis elegans and mice. Genes Brain Behav. 11, 387-397 (2012).
- Davies, A. G., et al. A central role of the BK potassium channel in behavioral responses to ethanol in C. elegans. Cell. 115, 655-666 (2003).
- Davies, A. G., Bettinger, J. C., Thiele, T. R., Judy, M. E., McIntire, S. L. Natural variation in the npr-1 gene modifies ethanol responses of wild strains of C. elegans. Neuron. 42, 731-743 (2004).
- Kapfhamer, D., et al. Loss of RAB-3/A in Caenorhabditis elegans and the mouse affects behavioral response to ethanol. Genes Brain Behav. 7, 669-676 (2008).
- Speca, D. J., et al. Conserved role of unc-79 in ethanol responses in lightweight mutant mice. PLoS Genet. 6, e1001057 (2010).
- Thiele, T. E., Badia-Elder, N. E. A role for neuropeptide Y in alcohol intake control: evidence from human and animal research. Physiol. Behav. 79, 95-101 (2003).
- Treistman, S. N., Martin, G. E. BK Channels: mediators and models for alcohol tolerance. Trends Neurosci. 32, 629-637 (2009).
- Han, S., et al. Integrating GWASs and human protein interaction networks identifies a gene subnetwork underlying alcohol dependence. Am. J. Hum. Genet. 93, 1027-1034 (2013).
- Kendler, K. S., et al. Genomewide association analysis of symptoms of alcohol dependence in the molecular genetics of schizophrenia (MGS2) control sample. Alcohol. Clin. Exp. Res. 35, 963-975 (2011).
- Schuckit, M. A., et al. Autosomal linkage analysis for the level of response to alcohol. Alcohol. Clin. Exp. Res. 29, 1976-1982 (2005).
- Alaimo, J. T., et al. Ethanol metabolism and osmolarity modify behavioral responses to ethanol in C. elegans. Alcohol. Clin. Exp. Res. 36, 1840-1850 (2012).
- Morgan, P. G., Sedensky, M. M. Mutations affecting sensitivity to ethanol in the nematode, Caenorhabditis elegans. Alcohol. Clin. Exp. Res. 19, 1423-1429 (1995).
- Mitchell, P. H., et al. The concentration-dependent effects of ethanol on Caenorhabditis elegans behaviour. Pharmacogenomics J. 7, 411-417 (2007).
- Vidal-Gadea, A., et al. Caenorhabditis elegans selects distinct crawling and swimming gaits via dopamine and serotonin. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 108, 17504-17509 (2011).
- Bettinger, J. C., Leung, K., Bolling, M. H., Goldsmith, A. D., Davies, A. G. Lipid environment modulates the development of acute tolerance to ethanol in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 7, e35129 (2012).
- Davies, A. G., et al. Different genes influence toluene- and ethanol-induced locomotor impairment in C. elegans. Drug Alcohol Depend. 122, 47-54 (2012).
- Newlin, D., Thomson, J. Alcohol challenge with sons of alcoholics: a critical review and analysis. Psychol. Bull. 108, 383-402 (1990).
- Ponomarev, I., Crabbe, J. C. A novel method to assess initial sensitivity and acute functional tolerance to hypnotic effects of ethanol. J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 257-263 (2002).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
- Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook. , The C. elegans Research Community. (2012).
