Protocol
1. trinn for å utføre på dagen før analysen
- Plukk L4 scenen ormer til frisk nematode vekst medium (NGM) plater podet med en plen på OP50 E. coli, og kulturen dem ved 20 CO / N. Hver analyse tilstanden krever 10 ormer; plukke et overskudd av ormer for å tillate O / N tap av ormer.
- Bare analyse dyr som er førstedags voksne; mange mutanter vokse med lavere hastighet enn villtype. Justere timingen av å plukke for stammer som har utviklingsmessige forsinkelser, slik at alle dyr testes er førstedags voksne.
2. trinn for å utføre på dagen av analysen
- Forberedelse for analysen:
- Utføre analyser på standard uanriket 60 x 15 mm NGM plater. Tørk alle de plater som skal brukes ved 37 ° C i 2 timer, med lokk off. For hver eksperimentell studie, bruker fire tørkede NGM plater; disse vil være 0 mm og 400 mm etanol analyseplatene og deres tilhørende akklimatiseringen plater.
NOTAT:Bruken av NGM platene er viktig her; forskjeller i sammensetningen av platene, spesielt deres osmolaritet, kan sterkt påvirke doserespons av etanol på oppførselen, er dette på grunn, i det minste delvis, til forandringer i mengden av etanol akkumulert av dyrene 20. NGM agar er 160 mOsm. - Etter tørking veier hver av de uanriket NGM plater som skal anvendes i analysen, og legg merke til vekten. Bestemme volumet av mediet i platene basert på vekten av en tom plate. For å tilnærme omdannelsen av vekten av agar til volum, anta at mediet veier det samme som et like stort volum vann.
MERK: Våre mest konsistente resultater har blitt funnet med NGM media som har Dehydrert tilstrekkelig at en original 10 ml volum har en ettertørking volum mellom 8.3 til 8.9 ml. Et alternativ til 2 timers tørketid er å tørke før platene nå dette volumområdet for å ta hensyn til forskjeller i inkubatorer. - Smelt fire kobberringer (innvendig diameter på 1.6 cm) inn i overflaten av hver av platene til å virke som innhegninger for de forskjellige genotyper eller behandlingsgrupper på worms.Grasp hver ring med pinsett, og varme i en flamme (en sterk flamme fra en Bunsen-brenner fungerer godt) i ca. 3 sek. Umiddelbart sette ringen på en tallerken mens du fremdeles holder ringen med pinsett for å hindre den fra "hoppe".
- Sørge for at ringen hviler flatt mot overflaten av agar ved å trykke ned forsiktig med pinsett på flere punkter på ringen. Når du plasserer ringen, være forsiktig med å gi rom for ytterligere tre ringer.
- Smelt de tre ekstra kopperringer inn i overflaten av platen, å ta vare for å plassere dem så nær hverandre som mulig, slik at alle fire vil være i synsfeltet for kameraet.
MERK: Å gjøre en god tetning med agar er viktig å holde ormene i ringene under analysen. Ringene som hopper rundt på tallerkenen er lite sannsynlig å gjøre det riktig tetning med agar ogkan arr i agar, som lar ormer å hule og forstyrrer visual ormer. - For hver analyseplate fremstille en tilhørende "akklimatisering" plate, som skal tørkes og uanriket og får ingen etanol. Plassere fire kobberringer på disse platene.
- Etiketten bunnen av platene ved siden av hver ring med snekke stamme som skal brukes i ringen, å ta vare på ikke skrive i synsfeltet av ringen i seg selv. Matche etikettene på analyseplaten med tilhørende akklimatisering plate.
- Beregne mengden av 100% etanol for å legge til hver analyseplate, slik at den endelige konsentrasjonen er 0 mM eller 400 mM etanol (vekt til volum). For hvert eksperiment (n = 1), vil det være en 0 mm og en 400 mM etanol plate; akklimatiseringen plater får ikke etanol. Tilsett ethanol, pipettere den rundt overflaten av platen. Bruk laboratorium film å forsegle platen og la det oppnå på benken toppen for 2 timer.
- Når 1,5 timer er gått, starter akklimatiserings trinnet av analysen, trinn 2.2.
- Utføre analyser på standard uanriket 60 x 15 mm NGM plater. Tørk alle de plater som skal brukes ved 37 ° C i 2 timer, med lokk off. For hver eksperimentell studie, bruker fire tørkede NGM plater; disse vil være 0 mm og 400 mm etanol analyseplatene og deres tilhørende akklimatiseringen plater.
- Utføre bevegelse analysen: Analyse plater
- Nøye overføre 10 ormer i hver forsøksgruppe til sentrum av en kobberring på akklimatiserings plate. Fjern all mat som er synlig på agar på dette punktet ved å skrape forsiktig med ormen hakke. Variere i hvilken rekkefølge de eksperimentelle gruppene blir satt på platene på tvers av eksperimentelle forsøk, slik at de samme stammene ikke er satt på platene i samme rekkefølge på tvers av studier.
MERK: Målet er å overføre dyrene til platen med minimale mengder av mat, fordi hvis mat på akklimatiseringsplaten overføres til analyseplaten ormer vil aggregere rundt mat og effekten av medikamentet på bevegelse vil være skjult. - Vær forsiktig med å bryte overflaten av agar med plukkingen, da dette vil tillate ormer å hule og vil forstyrre analysen. Inkuber ormer ved RT i 30 min.
- Sørg for at det er en passende intervall mellom innvielser av hver plate. En erfaren eksperimentator kan flytte 40 dyr, 10 / ring for 4 ringer i <1,5 min, men noen intervall opp til 2 min er akseptabelt. Standard analyse har filmer opptak på 10-12 minutter og 30-32 minutter av eksponering for både 0 mm og 400 mm, etanol.
- Initiere akklimatisering plate for 0 mm eksponering og akklimatisering plate for 400 mM eksponering ca 2 min og 30 sek fra hverandre for å tillate lagring av den første filmen filen før den andre filmen må begynne.
- Etter 30 min akklimatiseringsperiode, å overføre ormer fra akklimatiserings platene til analyseplater. Overføre ormer til analyseplatene (0 mm eller 400 mM etanol) i samme rekkefølge som de ble lagt til akklimatisering plate, holde styr på timingen mellom avslutningene av hver plate. Forsegl plate med laboratoriefilm for å minimalisere tap av etanol til fordamping.
- USE en scooping bevegelse med en tynn kanter flatet orm hakke å samle ormer på toppen av den flate hakke. Utføre overføring av ormer fra uanriket akklimatisering platen til analyseplaten uten bruk av bakterier, som vanligvis brukes i overføring av ormer som det bidrar til å lime ormen til plukk.
MERK: Hastigheten som dyrene blir overført på dette trinnet er svært viktig fordi de første ormer på plate vil bli utsatt til etanol lenger enn de siste ormer lagt til plate, og tidligere tidspunkter kan vise noen tidsavhengige effekter. Dette er den viktigste årsaken til roterende som stammer er plassert på en plate først over eksperimentelle replikater.
- Nøye overføre 10 ormer i hver forsøksgruppe til sentrum av en kobberring på akklimatiserings plate. Fjern all mat som er synlig på agar på dette punktet ved å skrape forsiktig med ormen hakke. Variere i hvilken rekkefølge de eksperimentelle gruppene blir satt på platene på tvers av eksperimentelle forsøk, slik at de samme stammene ikke er satt på platene i samme rekkefølge på tvers av studier.
- Utfør Locomotion analysen: Filming
- Bruke et mikroskop / kamera kombinasjon som muliggjør samtidig avbildning av alle fire ringer i synsfeltet (ca. 42x42 mm 2 kvadrat), slik som en 0,5x mikroskopobjektiv, 0,8 x forstørrelse og et kamera med en 2048x2048 7.481; m pixel CCD.
- Bruk jevn belysning over hele synsfeltet, som hjelpemidler i objektgjenkjenning på intensitet terskel trinn (se nedenfor). En 3 "x3" baklys fungerer godt.
- Bilde ormer på en plate plassert media-side opp (lokket ned), som genererer kontrast som går tapt når du slår på lyset i forhold til en tradisjonell mikroskop overført lyskilde.
- Forberede bildeanalyse programvare for å fange time-lapse filmer av bevegelige ormer. Still programvare for å fange 12-bits gråtonebilder hver 1 sek, som en 2-min (120 ramme) film. For å redusere størrelsen på utdatafilen, og samtidig beholde tilstrekkelig bildeoppløsning, bruker en 2x2 binning modus for å fange 1024x1024 piksler.
- Spill filmene. Starte innspillingen av en 120-ramme film av den første platen (0 mm etanol) 10 minutter etter siste ormer ble plassert på denne platen. Lagre filmfil.
- Ta opp den andre plate (400 mM etanol). Gjenta denne prosessen forbegge platene som begynner 30 minutter etter den siste ormer ble plassert på den første platen (0 mM etanol) for å fange opp 30 til 32 min tidspunkter for hver eksponering.
MERK: La det være tilstrekkelig tid til å lagre bildefilene etter hver fangst økten før du begynner innspillingen av neste plate som skal analyseres. - For fremtiden korrektur av arkiverte filmer og å la disse filmene som skal åpnes og analysert av andre offentlig tilgjengelige åpen kildekode bildebehandlingsprogrammer, for eksempel ImageJ 28, konvertere en kopi av hver film til 8-bit 256 grå skala TIFF-filer.
MERK: Bildet analyse programvaren som er beskrevet her bruker en proprietær filformat.
- Analyse av filmer ved hjelp ImagePro programvare.
- Når fanget, analysere filmene ved hjelp av Image-Pro Plus programvare eller tilsvarende.
MERK: En rekke andre objekt sporing programvare er tilgjengelig som har blitt brukt for å kunne spore flere C. elegans på en gang 29 og sliktprogramvare med rimelighet kunne erstatte det som er beskrevet her som objekt identifikasjon trinnene er basert på lignende prinsipper. Metoden som er beskrevet gjelder Bilde-Pro Plus programvareversjoner 6,0 til 6,3 og 7,0, nyere versjoner av bilde-Pro Plus programvare kan ha små forskjeller. - Analysere filmer i 2-min (120 ramme) segmenter. Først, bruke et filter på bildene for å flate bakgrunnen og øke kontrasten av ormen stedene. Velg filteret som følger: Meny> Prosess> Filter> Ekstrautstyr> Flat: Parametere: Bakgrunn = Mørk; Feature Bredde = 20 Pix.
- Re-lagre filmer etter filtrering trinn, men alltid beholde den opprinnelige filmen i sin ufiltrert skjema.
- Analyser bevegelse av dyr i hver ring særskilt med et sirkulært område av interesse (ROI) som er plassert og dimensjonert til å overlappe med kobberringen. Identifisere og spore ormer med Meny> Mål> Spor objekter ... kommando; Dette bringer opp Tracking Data Tabell vindu. Sporings Options knappen gir konkrete spor å bli ekskludert, og for å begrense eventuelle eksperimentelle artefakter.
- Under fanen Auto Tracking, kan du bruke følgende parametere: Spor Parametere: Velocity grense (søk radius) = 400 mikrometer / ramme, Acceleration limit = Auto, Minimum total spor lengde = 400 mikrometer, Dominerende bevegelse type = kaotisk; Objekter i spor parametre: Tillat delvis spor = ja, Min lengde = 21 rammer, Spore prediksjon dybde = 1 ramme.
- Å starte sporingsprosessen, klikk Finn alle sporene automatisk fungere knappen for å få opp greven / Størrelsesalternativer dialogboksen og Tracking dialogboksen. Velger du alternativet Manuell for Utvalg Intensitet Range i Antall / størrelse dialogboksen, som gir den viktige avgjørende skritt som bruker den grå-skala intensiteten av ormen piksler for å markere en orm gjenstand for analyse og å ignorere de lysere bakgrunns piksler.
- Justere intensiteten terskel SLIders (ett for å sette den øvre grensen, en til å sette den nedre grensen) for å skape et inkluderende utvalg som fremhever alle mørke objekter. En rekke 0-1,500 på en skala fra 0-4,095 er et godt utgangspunkt for finere tuning.
- Anvende en størrelse filter for å ekskludere objekter som er større og mindre enn en enkelt orm objekt, som for eksempel kobber ring og eventuelle rester på platene. Satt to dimmensjoner å gjøre dette som dekker størrelser for enkelte ormer i en rekke stillinger med Measure> Velg Målinger menyvalget på greven / Størrelsesalternativer dialogboksen. (Area Område: 28,000-120,000 mikrometer 2 og Perimeter utvalg: 600-2,500 mikrometer).
- Hvis en mutant belastningen er betydelig mindre eller større enn andre dyr på plate som skal analyseres, utvide utvalget av filterinnstillingene for objektgjenkjenning for å imøtekomme de forskjellige størrelser av stammene først før spore dyr, slik at innstillingene ikke må endres mid-analyse.
- Fullfør sporing prosessen ved å klikke på Fortsett i Tracking dialogboksen. Sammenligne visuelt utgangsspor med fremdriften for hver orm i filmen for å sikre at hver ormen er representert med mindre det er en gyldig grunn til å utelukke det basert på de automatiske filterinnstillinger. Manuelt slette sporene som ble produsert av tilstedeværelsen av bekreftet ikke-ormen gjenstander som møtte størrelse filterkriterier.
- Bruk programvare for å beregne hastigheten av hver orm mellom hver ramme (distanse for tyngdepunktet til en gjenstand per 1 sek mellom rammer), og viser den gjennomsnittlige hastighet for hvert spor, og den gjennomsnittlige hastighet over alle sporene for populasjonen av ormer i kobber ring. Tenk på dette endelig gjennomsnittlig å være n = 1 i form av eksperimentelle forsøk. Eksportere data til et regnearkprogram for statistiske analyser og data arkivering.
- Når dataene er registrert for første ringen på tallerkenen, flytter ROI til neste ring oggjenta sporingsprosessen, uten å endre noen av parametrene.
- Beregne relativ hastighet av bevegelse gjennom:
- Relativ hastighet (%) = behandlet (400 mM) hastighet / ubehandlet (0 mm) hastighet x 100.
MERK: Ulike genetiske manipulasjoner ofte endre basal locomotion rate av dyr. For å bestemme effekten av etanol på bevegelseshastigheten til dyr, og for å kunne sammenligne disse effektene på tvers av forskjellige genotyper eller tilstander, beregne en relativ hastighet.
- Når fanget, analysere filmene ved hjelp av Image-Pro Plus programvare eller tilsvarende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representative data (figur 1) fra flere forskjellige genotyper og deres sammenkoblede kontroller presenteres 8,24; data ble spesielt valgt som synliggjør forskjeller i de analyserte dyr. Graden av virkningen på 10 min eksponering regnes som den første følsomheten av en stamme, som er vist til venstre aksene i figur 1B-G. Mutantstammer med en relativ hastighet som er større enn kontrollen ved 10 min anses å være resistente etanol (figur 1F, G), mens mutantstammer med en relativ hastighet som er mindre enn kontrollen anses å være overfølsom for etanol (figur 1D, E). De rette akser i figur 1 viser graden av gjenvinning av hastighet mellom 10- og 30-min tidsperioder. Dette representerer et mål på hastigheten for utvikling av akutt funksjonelle toleranse (AFT) og er beregnet som den relative hastighet på 10 min subtrahert fra den relative spesert ved 30 min. Stammer med større utvinning verdier anses å ha en høyere hastighet for utviklingen av AFT sammenlignet med kontrolldyrene (Figur 1D, F) og stammer med lavere utvinning verdier enn kontrolldyrene anses å ha lavere priser for utvikling av AFT (figur 1C , E). Legg merke til at den målte AFT for sbp1 (ep79) (figur 1G) er trending mot en negativ utvinning, men var ikke statistisk forskjellig fra villtype på grunn av stor varians (p = 0,08 for sammenligning mot N2 recovery). Tub-en koder en lubben homolog ; bbs-1 koder for en homolog til human BBS1; lepper-7 koder for et triacylglycerol lipase; fett-1 koder for en omega-3 fettsyre acyl-desaturase; fett-3 koder for en delta-6-fettsyre-desaturase; SBP-1 koder for en homolog til menneskelig Sterol Regulatory Element bindende proteiner (SREBPs).
Det er flere viktige kjennetegn veddata å merke seg: Først N2 (villtype) kontrolldata er forskjellig på tvers av eksperimenter; Dette er sannsynligvis på grunn av miljømessige forhold som er vanskelig å kontrollere, såsom absolutte vanninnhold og saltkonsentrasjon i de tørkede media og temperaturen i laboratoriet. Vanligvis depresses 400 mM eksogen etanol hastigheten av N2 til omtrent 30% av de ubehandlede kontroller; Men den absolutte grad av depresjon varierer fra eksperiment for å eksperimentere. Videre, mens ca 12% gjenvinning av bevegelse hastighet over 30 min i N2 er vanligvis forventet, her igjen tallene varierer. Viktigst, mens de absolutte nivåer av følsomhet og AFT utstillings dag-til-dag variasjon, sammenligninger mellom genotyper eller tilstander vanligvis ikke avvike. Det vil si, villtype og mutant alltid vil ha lignende effekter i forhold til hverandre; Hvis en mutant fører til en reduksjon i AFT i forhold til villtype, vil det reduseres skalerer med mengden av AFT demonstrert av villtype. Dette fremheverviktigheten av å utføre sammenkoblet kontroller på de samme plater på samme tid for belastninger eller forhold som blir sammenlignet.
For det andre fenotyper av innledende følsomhet og AFT er genetisk skilles. Merk at innledende følsomhet og akutt funksjonell toleranse kan variere sammen eller hver for seg; eksempler er blitt tatt med av en rekke fenotyper som innledende følsomhet og AFT avviker uavhengig av hverandre. En endring i en av de fenotyper ikke forutsi en endring i den andre fenotype, og heller ikke forutse den retning av endring av den andre fenotype (enten øket eller redusert respons til etanol).
Figur 1. Initial etanol følsomhet og hastighet på utvikling av akutt funksjonell toleranse (AFT) er separable atferdsmessige reaksjoner. (A) Oppsummering tabell forretning av virkningene av mutasjoner i de nevnte gener på nivået av utgangs følsomhet for etanol og hastigheten av utviklingen av AFT, begge er i sammenligning med villtype-kontroller (N 2 i hvert tilfelle). (B-G) Akutte locomotion responser til 400 mM eksogen etanol er målt til 10-12 min og 30-32 min av kontinuerlig etanol eksponering. Relative hastigheter (% av ubehandlet hastighet) er vist til venstre akser. Den grad av gjenvinning i hastighet er vist på de rette akser og representerer et mål for frekvensen av AFT i løpet av den 20-minutters intervall. Antallet forsøk sammenlignet som følger: B, C, E: n = 6; G: n = 7; D: n = 9; F: n = 11. Statistisk signifikante sammenligninger (parvise t-tester) blir vist: *, p <0,05; **, P <0,01. 8,24 Dataene presenteres i denne figuren er endret fra 8,24. Please klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den enkle nevrobiologi og genetiske verktøy tilgjengelig i C. elegans gjøre ormen en utmerket modell for å studere de molekylære grunnlaget for effekten av etanol på atferd. Her beskriver vi en metode som har blitt brukt for å identifisere flere molekylære og miljømessige mediatorer av den akutte atferdsmessige respons til etanol 8,10,20,24,25. Denne metoden gjør det mulig for differensiering og samtidig undersøkelse av to forskjellige etanol responsoppførsel fenotyper, initielle følsomhet og utvikling av akutt funksjonelle toleranse, som sammen modellere den sammensatte fenotypen til nivået av respons i pattedyr. Den samme analysen kan enkelt tilpasses til å studere andre farmakologiske midler, og dermed dra nytte av den samtidige testing av flere stammer i vurderingen av de atferdsmessige effekten av andre legemidler.
10-12 min tidsvinduet gir en nyttig tidspunkt å måle opprinnelige følsomheten en belastning til etMetanol. Analyse av effektene av 400 mM etanol over de første 10 min av eksponering viser hastighetseffekter som begynner i det andre minutt av eksponering, men en jevn tilstand av effekten oppnås ikke før det syvende minutt av etanol eksponering 20. På grunn av denne tidsavhengig virkning på bevegelseshastigheten, vil rekkefølgen for spesielle stammer er plassert på platen være viktig for eventuelle hastighetsmålinger før den åttende eller niende minutt (forutsatt at det tar mindre enn to minutter for å plassere alle de ormer på etanol plate). På disse tidligere tidspunkter noen ormer vil være mer påvirket av etanol rett og slett fordi de ble plassert på plate tidligere. Selv om et stabilt innledende virkning av etanol oppnås ved den syvende minutt, er det anbefalt at rekkefølgen som stammer er plassert på plater varieres over replikate forsøk for å minimalisere enhver systematisk virkning på tvers av påkjenningen på grunn av denne tidsavhengige effekt av etanol og den tid som kreves for å bevege ormer til plate.
Spesifikke parametre ble valgt i objektsporings skritt for å minimere skjevhet fra ormer som gjentatte ganger kolliderer med kobber ring eller sammen med andre ormer. Objektet størrelse filter skritt bør eliminere ethvert objekt fra sporing som er større enn en enkelt orm, inkludert to rørende ormer. Hvis en orm berører en annen orm eller kobber ring deretter sporet slutter, og det bør ikke lenger bli anerkjent som en gyldig objekt mens det forblir i kontakt. Når ormen mister kontakten med den andre objekt, blir det et nytt objekt og starter et nytt spor. Hvis sporet gjort av en orm er mindre enn 20 sek i lengden, så det blir automatisk ekskludert ved å definere et minimums spor lengde på 21 rammer. Dette filteret hindrer at forekomster av en orm fremover inn i et annet objekt (orm eller ring), rygging og deretter fremover til å berøre dette objektet igjen, så korte anfall av raske reverse kan skjevhet den samlede gjennomsnittshastighet av befolkningen av dyr. Ved hjelp av disse innstillingene, jegt er mulig, og ikke uvanlig for en enkelt orm å bidra med mer enn ett spor som er større enn 20 sek lengde (men mindre enn 99 sekunder) til det totale gjennomsnitt. Innstillingene kan bli endret slik at hver snekke bidrar bare et enkelt spor ved å gjøre den minste sporlengden 61 sek (av totalt 120 sekunder), men empirisk observasjon fastslått at dette fjernes et betydelig antall spor, og det ble funnet at langsommere ormer som kolliderte med andre ormer sjeldnere ville være overrepresentert. Alternativt kan nye spor bli forbudt å begynne etter det første bildet i filmen, men da ormer som kolliderer tidlig i 2-minutters periode er fjernet fra analysen og nyttige data vil gå tapt. Til slutt, bruk av 10 ormer per kobber ring representerer et godt kompromiss mellom å ha flere representative spor som bidrar til et gjennomsnitt og problemet med for mange ormen kollisjoner.
Denne atferdsanalyse har flere viktigefordeler for studiet av etanol respons atferd i ormer. Samtidig testing av flere genotyper på samme plate er mulig gjennom bruk av kobber "paddocken." Denne innovasjonen har flere klare fordeler. Først i denne analysen, styre tilstand eller belastning er alltid testet på samme plate på samme tid som den eksperimentelle tilstand eller belastning, og bare dyr som ble testet samtidig, sammenlignet direkte. Dette er av særlig betydning fordi atferdsmessige analyser er ofte påvirket av miljøet, og dag-til-dag variasjon i atferdsmessige responser kan øke støyen i analysen og redusere evnen til å detektere signaler. Side-ved-side-sammenligning av eksperimentelle grupper i det vesentlige identiske betingelser avtar virkningen av dag-til-dag miljøvariasjon, noe som er en stor fordel med denne fremgangsmåten. For det andre inneholder bruken av kobber innhengninger dyr i synsfeltet, da det lar locomotion analyser som skal utføres i enbsence av mat. Når fratatt mat, ormer bevege seg raskt og har en tendens til å spre på jakt etter bakterier; uten at ringene, vil ormer forlater synsfeltet i løpet av analysen. I tillegg er ormer frastøtt av kobber og har en tendens til å holde seg nærmere midten av ringene, noe som gjør dem lette å visualisere. Det faktum at ormene bevege seg raskt i disse analysebetingelser i vesentlig grad øker oppløsningen for å detektere depressive effekter av etanol; når ormer bevege seg sakte, hastighetene når gulvet av evnen til å oppdage dem tidligere. Legg merke til at kobber er giftig for ormer; mens ringene ikke ut til å påvirke akutte reaksjoner til etanol analysert i denne protokollen, utvidet inkubasjon av dyr i ringene (over flere timer) anbefales ikke. For det tredje, med denne eksperimentell design, kan et enkelt assay vurdere de atferdsrespons opp til fire forskjellige forsøksgrupper. Derfor er den tid det tar å samle statistisk meningsfull data blir redusert. I additipå, siden en enkelt digital film er laget, synker denne plassbehov for langsiktig lagring av primærdata til minne. Til slutt, i hvert eksperiment, blir oppførselen til 10 individuelle dyr i hver forsøksgruppe undersøkt. Hastighetene av de 10 individer er gjennomsnitt for å generere et sammensatt hastigheten for en enkelt analyse, slik at n = 1 forsøket. Denne midling av oppførselen til mange dyr ytterligere reduserer variabiliteten i disse følsomme atferdsmessige analyser, og videre øker oppløsningen for å detektere subtile effekter på etanol respons atferd.
Det finnes begrensninger for de metoder som er beskrevet her, og noen av disse gjelder for atferdsmessige analyser av eventuelle muterte dyr. En vesentlig begrensning for denne tilnærmingen er at mutante ormer som har meget betydelig reduserte basal hastigheter, på grunn av manglende koordinasjon eller i nærheten av lammelse, kan bli identifisert som falskt positivt for motstandsdyktighet mot virkningene av etanol fordi deres målte hastighet avtar til en verdi thpå er under grensen for nøyaktig deteksjon for en bestemt bildeoppsett. Som de fleste objekt sporing programmer bruker en Tyngdepunktet (tyngdepunkt) som posisjonen for å måle distanse mellom rammer, kan en stasjonær orm som beveger hodet fortsatt generere et skifte i den posisjonen tyngdepunktet og at skift ville bli oppdaget som bevegelse. Derfor en orm må flytte raskere enn er forårsaket av subtile endringer i kroppsholdning for å måle så sant bevegelse. Ormer utsatt for etanol er ikke lammet, men de er svært sprikende, så med ormer som allerede har et underskudd i bevegelse det er mulig at etanol eksponering vil redusere sine priser av fart under denne tekniske etasjen effekt. Å øke tiden mellom rammene slik at større forandringer i kroppsstilling vil være separerbar fra subtile endringer i tyngdepunktstilling løser ikke dette problem, dersom tiden mellom rammene forlenges mye mer enn 1 sekund blir det vanskeligere for object sporing programvare for å sikre at den samme ormen bidrar til et spor i stedet for et spor hopping mellom nære, men ikke berøre ormer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Disse studiene ble støttet med tilskudd fra National Institutes of Health, National Institute for alkoholisme og alkoholmisbruk: R01AA016837 (JCB) og P20AA017828 (AGD og JCB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C. elegans strains | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| 60 x 15 mm Petri plates, triple vented | Greiner Bio-One | 628161 | Other plate brands will suffice. |
| NGM agar | Various | NaCl (3 g/L), agar (17 g/L), peptone (2.5 g/L), 1 ml cholesterol (5 mg/ml in ethanol), 1 ml (1 M) MgSO4, 1 ml (1 M) CaCl2, 25 ml (1 M) KPO4, pH=6, 975 ml H2O | |
| Forceps | Various | e.g., Fisher Scientific #10300 | |
| 37 °C Incubator | Various | For drying agar | |
| Digital balance | Various | For determining plate weights and agar volume | |
| Copper rings | Plumbmaster | STK#35583 (48 cap thread gasket) | 1.6 cm inner diameter, 1.8 cm outer diameter copper rings |
| 100% ethanol | Various | ||
| Parafilm M | Bemis | PM996 | |
| CCD camera | QImaging | RET-4000R-F-M-12 | This camera has a large field of view. |
| Stereomicroscope with C-mount and 0.5X objective | Leica | MZ6 | Discontinued model, M60 is current equivalent. |
| Light source | Schott | A08923 | 3”x3” backlight for even illumination across the field of view |
| Imaging and tracking software | Media Cybernetics | ImagePro-Plus v6.0-6.3 | Newer versions of the software have tracking functions. |
References
- Prescott, C. A., Kendler, K. S. Genetic and environmental contributions to alcohol abuse and dependence in a population-based sample of male twins. Am. J. Psychiatry. 156, 34-40 (1999).
- Schuckit, M. A. Genetics of the risk for alcoholism. Am. J. Addict. Article Review. 9, 103-112 (2000).
- Heath, A. C., et al. Genetic differences in alcohol sensitivity and the inheritance of alcoholism risk. Psychol. Med. 29, 1069-1081 (1999).
- Rodriguez, L. A., Wilson, J. R., Nagoshi, C. T. Does psychomotor sensitivity to alcohol predict subsequent alcohol use. Alcohol. Clin. Exp. Res. 17, 155-161 (1993).
- Schuckit, M. A., Smith, T. L. An 8-year follow-up of 450 sons of alcoholic and control subjects. Arch. Gen. Psychiatry. 53, 202-210 (1996).
- Kalu, N., et al. Heritability of level of response and association with recent drinking history in nonalcohol-dependent drinkers. Alcohol. Clin. Exp. Res. 36, 522-529 (2012).
- Davis, S. J., Scott, L. L., Hu, K., Pierce-Shimomura, J. T. Conserved single residue in the BK potassium channel required for activation by alcohol and intoxication in. C. elegans. J. Neurosci. 34, 9562-9573 (2014).
- Raabe, R. C., Mathies, L. D., Davies, A. G., Bettinger, J. C. The Omega-3 Fatty Acid Eicosapentaenoic Acid Is Required for Normal Alcohol Response Behaviors in C. elegans. PLoS ONE. 9, e105999 (2014).
- Topper, S. M., Aguilar, S. C., Topper, V. Y., Elbel, E., Pierce-Shimomura, J. T. Alcohol disinhibition of behaviors in C. elegans. PLoS ONE. 9, e92965 (2014).
- Bhandari, P., et al. Chloride intracellular channels modulate acute ethanol behaviors Drosophila,Caenorhabditis elegans and mice. Genes Brain Behav. 11, 387-397 (2012).
- Davies, A. G., et al. A central role of the BK potassium channel in behavioral responses to ethanol in C. elegans. Cell. 115, 655-666 (2003).
- Davies, A. G., Bettinger, J. C., Thiele, T. R., Judy, M. E., McIntire, S. L. Natural variation in the npr-1 gene modifies ethanol responses of wild strains of C. elegans. Neuron. 42, 731-743 (2004).
- Kapfhamer, D., et al. Loss of RAB-3/A in Caenorhabditis elegans and the mouse affects behavioral response to ethanol. Genes Brain Behav. 7, 669-676 (2008).
- Speca, D. J., et al. Conserved role of unc-79 in ethanol responses in lightweight mutant mice. PLoS Genet. 6, e1001057 (2010).
- Thiele, T. E., Badia-Elder, N. E. A role for neuropeptide Y in alcohol intake control: evidence from human and animal research. Physiol. Behav. 79, 95-101 (2003).
- Treistman, S. N., Martin, G. E. BK Channels: mediators and models for alcohol tolerance. Trends Neurosci. 32, 629-637 (2009).
- Han, S., et al. Integrating GWASs and human protein interaction networks identifies a gene subnetwork underlying alcohol dependence. Am. J. Hum. Genet. 93, 1027-1034 (2013).
- Kendler, K. S., et al. Genomewide association analysis of symptoms of alcohol dependence in the molecular genetics of schizophrenia (MGS2) control sample. Alcohol. Clin. Exp. Res. 35, 963-975 (2011).
- Schuckit, M. A., et al. Autosomal linkage analysis for the level of response to alcohol. Alcohol. Clin. Exp. Res. 29, 1976-1982 (2005).
- Alaimo, J. T., et al. Ethanol metabolism and osmolarity modify behavioral responses to ethanol in C. elegans. Alcohol. Clin. Exp. Res. 36, 1840-1850 (2012).
- Morgan, P. G., Sedensky, M. M. Mutations affecting sensitivity to ethanol in the nematode, Caenorhabditis elegans. Alcohol. Clin. Exp. Res. 19, 1423-1429 (1995).
- Mitchell, P. H., et al. The concentration-dependent effects of ethanol on Caenorhabditis elegans behaviour. Pharmacogenomics J. 7, 411-417 (2007).
- Vidal-Gadea, A., et al. Caenorhabditis elegans selects distinct crawling and swimming gaits via dopamine and serotonin. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 108, 17504-17509 (2011).
- Bettinger, J. C., Leung, K., Bolling, M. H., Goldsmith, A. D., Davies, A. G. Lipid environment modulates the development of acute tolerance to ethanol in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 7, e35129 (2012).
- Davies, A. G., et al. Different genes influence toluene- and ethanol-induced locomotor impairment in C. elegans. Drug Alcohol Depend. 122, 47-54 (2012).
- Newlin, D., Thomson, J. Alcohol challenge with sons of alcoholics: a critical review and analysis. Psychol. Bull. 108, 383-402 (1990).
- Ponomarev, I., Crabbe, J. C. A novel method to assess initial sensitivity and acute functional tolerance to hypnotic effects of ethanol. J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 257-263 (2002).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
- Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook. , The C. elegans Research Community. (2012).
