Introduction
Las células madre mesenquimales (MSCs) juegan un papel importante en la medicina regenerativa y la ingeniería de tejidos. Ellos pueden migrar, diferenciarse en diversos tipos de células 1 y injertarse, lo que les hace candidatos ideales para las terapias autólogas 2,3. Últimamente, los ensayos clínicos con MSC para la reparación de hueso y cartílago, se lanzaron enfermedad injerto contra huésped o enfermedad cardíaca 4. Estos MSCs se pueden cosechar a partir del tejido del cordón umbilical o tejido adiposo pero los resultados más prometedores se obtuvieron a partir de la médula ósea células madre derivadas 5.
La cresta ilíaca permite recoger una cantidad considerable de médula ósea y por lo tanto sirve como sitio principal de la aspiración 6. Sin embargo, la calidad del aspirado disminuye con el aumento de volumen de la médula ósea retirada. Mientras que los primeros 5 ml de aspirado de médula ósea contienen MSCs de alta calidad, la retirada de volúmenes más grandes conduce a la dilución de la sangre periférica con aspirado de fesde el hueso altamente vascularizado 7. Debido a los presentes megacariocitos y plaquetas, aspirado de médula ósea son propensos a la coagulación, a menos que se utilizan anticoagulantes. Pero incluso con anticoagulantes, se pueden producir coágulos.
En la médula ósea, MSCs representar sólo una pequeña proporción de la piscina total de células 8 y tienen que ser expandida en cultivo durante más de ingeniería de tejidos o aplicaciones terapéuticas 4. La calidad de una cultura de este tipo depende en gran medida de la piscina célula inicial, es decir., La diversidad y un alto número de partida 9. Los números bajos de las MSC de retiros pueden explicarse en parte por la variabilidad de los donantes. Por otro lado, las MSC de muestras de baja calidad requieren más tiempo en la cultura y pases extendido para alcanzar el número deseado de células. En cualquier caso, los pases extendida es una fuente de la senescencia celular y puede conducir a la pérdida de la diferenciación potencial 10. Por lo tanto, los protocolos que pueden maximizar celular y optimizadoield y prevenir los efectos perjudiciales tienen que desarrollarse 11,12.
Cuando empezamos a trabajar con las MSC caninos, nos quedamos asombrados al ver que alrededor de tres de cada cuatro muestras de médula ósea canina contenían coágulos, mientras que las muestras humanas afortunadamente coagulada (uno de cada diez) fueron menos frecuentes. Por otra parte no fue una sorpresa, que observamos rendimientos mucho más bajos de las MSC de muestras coaguladas. Para resolver el problema recurrente de muestras coaguladas, hemos desarrollado el protocolo mediante el uroquinasa fármaco trombolítico en lugar de remuestreo.
Terapias trombolíticos pueden contrarrestar situaciones que amenazan la vida tales como la oclusión de los vasos sanguíneos que causan ataques cardiacos, derrames cerebrales o embolias debido a la coagulación no deseada. Trabajan por la degradación de los coágulos a través de la escisión enzimática de la fibrina por la plasmina y de plasminógeno enzimática activadores. A pesar de la amplia utilización para el tratamiento de los pacientes, sólo existen muy pocas publicaciones que las actividades trombolíticos utilizadospara aplicaciones de laboratorio para rescatar muestras coaguladas, centrándose sobre todo en los linfocitos. En 1987, Niku et al. describe el uso de estreptoquinasa para disolver los coágulos de sangre que resulta en linfocitos funcionales 13 y cuatro años más tarde, De Vis et al. extendido el uso de estreptoquinasa para aislar las células leucémicas de la sangre y la médula ósea para aplicaciones de citometría de flujo 14. Una publicación más reciente sugiere el uso de alteplasa para el diagnóstico del cáncer 15. Mientras utiliza el mismo enfoque enzimática, nuestro protocolo se centra en el aislamiento de multipotentes MSC forma médula ósea para proporcionar una herramienta para los investigadores en el campo de las células madre.
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Protocol
NOTA: aspirados de médula ósea humana de la cresta ilíaca se obtuvieron de consentir los donantes con la aprobación del comité de ética del cantón de Lucerna. Aspirados de médula ósea canina de la cresta ilíaca se recogieron con consent.Human del dueño del perro (aprox. 20 ml) y canina (aprox. 10 ml) aspirados de médula ósea eran anti-coagulado mediante la adición de 15 ml de 3,8% de citrato de sodio inmediatamente después de la retirada en el teatro de operaciones. Las muestras se transfirieron al medio ambiente de laboratorio para el procesamiento de la misma día como retirada.
1. Preparación de uroquinasa (Antes del 1 st Uso)
- Reconstituir la uroquinasa usando solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) de acuerdo con las instrucciones del fabricante: Añadir 10 ml de PBS al matraz-septum de entrada utilizando una jeringa de 10 ml. Disolver la sustancia seca por agitación para obtener 50.000 unidades de inyección (U) por ml.
- Preparar alícuotas de 500 mu l (25.000 U) en cada stubos terile. Alícuotas Tienda -20 ° C y usarlo cuando sea necesario durante al menos 6 meses.
2. Preparativos Pasos (Antes de cada hueso Tratamiento Ósea)
- Descongelar una alícuota de la uroquinasa (25.000 U) por aspirado de médula ósea coagulada (volúmenes aspirado hasta 25 ml han sido tratados con éxito utilizando una única alícuota de 25.000 U).
- Precaliente un baño de agua o incubadora de agitación a 37 ° C.
3. digestión enzimática del Clot
- Realizar todo el trabajo en un gabinete de bioseguridad de flujo laminar para evitar la contaminación microbiana de las muestras de médula ósea durante el procesamiento. Cuando se trabaja con material humano potencialmente infecciosos, se recomienda el uso de guantes de protección, así como un manejo cuidadoso.
- Colocación de un filtro 100 micras de células en la parte superior de un tubo de 50 ml estéril. Vierta cuidadosamente el aspirado de médula ósea a través del filtro de células, inclinando el colador o en movimiento alrededor del material de coágulo. Utilice una punta de pipeta estéril paramejor flujo a través de la malla del filtro.
NOTA: Evite cualquier dilución del coágulo, por ejemplo, lavando el coágulo con PBS. Urokinase actúa indirectamente y requiere componentes del suero (es decir., Plasminógeno) de la biopsia de efectivo resumen. Mientras continúa el procedimiento con el material de coágulo, el filtrado se puede mantener a temperatura ambiente hasta su uso posterior en el paso 3.6. - Transferir el material de coágulo de médula ósea en una placa de cultivo celular vacía utilizando pinzas estériles. Cortar los escombros en trozos pequeños de aproximadamente 2 mm 3 utilizando un bisturí estéril.
- Transferencia de las pequeñas piezas de coágulo en un tubo de reacción de 50 ml utilizando las pinzas estériles. Asegúrese de que el coágulo picada tiene una apariencia húmeda. Si parece estar seca, use algo del filtrado desde el paso 3.1 para humedecer.
- Se tritura el coágulo pipeteando arriba y hacia abajo para 5 veces usando una pipeta de 5 ml de microtitulación. Añadir 1 alícuota de uroquinasa a la muestra. Incubar durante 30 minutos a 37 ° C, ya sea en un baño de agua o enun (suavemente) incubador con agitación.
- Se tritura pipeteando arriba y hacia abajo para 5 veces usando una pipeta de 5 ml. Realice este paso en un gabinete de bioseguridad. Incubar durante 30 minutos a 37 ° C. Después de la incubación, se tritura de nuevo 5 veces usando una pipeta de 5 ml. Pasad una fresca filtro celular 100 micras para poner en común con el filtrado del paso 3.2.
- Centrifugar la suspensión celular a temperatura ambiente durante 10 min a 500 x g. Eliminar el sobrenadante. Vuelva a suspender el sedimento celular en medios de comunicación como se describe a continuación o de acuerdo con el procedimiento estándar de su laboratorio para el cultivo de expansión MSC.
4. Siembra de Cultura de expansión de células y placas UFC
- Resuspender las células (que consta de eritrocitos y células mononucleares) en 50 ml de medio basal: Alpha-MEM suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y 2,5 mg / ml de anfotericina B . Contar las células 1:10 diluido en solución de azul de tripano usando un chambe Neubauerr.
- Placa de las células en matraces de cultivo celular en la densidad de 5 x 10 7 células / cm 2 y se incuban en un incubador humidificado a 37 ° C. Si está disponible, utilice hipóxicas (5% oxígeno). Para el control de ensayo CFU, placa 10 9 células en una placa de cultivo celular de 10 cm de diámetro.
- Después de 3 días de cultivo, las células madre mesenquimales están unidos a la placa de cultivo celular mientras que otras células permanecen en suspensión. Cambiar los medios de comunicación con medio basal suplementado con 5 ng / ml de factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF). Para el control de ensayo CFU, tratar la placa de cultivo celular de igual manera.
- Continuar el cultivo de células para un total de 2 semanas, el intercambio de los medios de comunicación tres veces a la semana. Si las células superan el 80% de confluencia, dividido por tripsinización. Para el control de ensayo CFU, intercambiar los medios de comunicación del mismo modo, pero no dividir las células durante el transcurso de las dos semanas.
5. Giemsa para ensayo CFU
- Preparar 10 ml de solución de Giemsa-por plato: dilUTE La solución madre (7,6 g / l Giemsa en glicerol: metanol) 1:10 en agua estéril (siempre preparar una dilución de trabajo fresco).
- Retire el papel de la placa de cultivo celular y se lavan las células con PBS. Sea muy precavido al aplicar el líquido a la placa de Petri y evitar el lavado de las células.
- Fijar las células en metanol puro durante 5 min a RT. Deseche el metanol. Añadir la solución de Giemsa y se incuba durante 60 minutos en un incubador humidificado a 37 ° C.
- Lavar dos veces con PBS. Deje secar al aire la cabeza primera placa sobre una toalla de papel. Contar las colonias manualmente. Esto se logra mejor utilizando un rotulador en la parte posterior de la placa.
6. MSC Diferenciación
- MSC caninos diferenciación
NOTA: MSCs caninos se diferenciaron en condrogénica, osteogénica y linajes adipogénicas por estimulación con el sustrato adecuado durante cuatro semanas. - Para Diferenciación Adipogénico, MSC cultura en monocapa a 4 x 10 5 ceLLS / cm 2 alternando dos condiciones de cultivo diferentes como sigue;
- Cultivo en medios de mantenimiento adipogénesis que contiene DMEM + GlutaMAX, 3% de FBS, 100 unidades / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 2,5 mg / ml de anfotericina B y la insulina 170 mM.
- Cultura en la adipogénesis medios de inducir con medio de mantenimiento suplementado con 3% de FBS, 5% de suero de conejo, dexametasona 1 mM, 500 mM 3-isobutil-1-metilxantina, 33 mM biotina, 5 mM rosiglitazona y 17 mM pantotenato 16.
- Revel las gotas de lípidos mediante tinción con rojo aceite-O. En pocas palabras, fijar las células con formaldehído al 10%, lavar con PBS y manchar con 0,35% de aceite rojo O en isopropanol.
- Para el cultivo de la diferenciación osteogénica MSCs en monocapa a 7 x 10 3 células / cm 2 y estimular en el siguiente:
- Advanced DMEM (GIBCO) + GlutaMAX, 5% de FBS, 100 unidades / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 2,5 mg / ml de anfotericina B, 501; M de ácido L-ascórbico 2-fosfato, 10 mM ß-glicerofosfato y 100 nM de dexametasona.
- Identificar los depósitos de mineralización por tinción Von Kossa (5% AgNO3). Brevemente, fijar las células con 10% de formaldehído, se lava con PBS y se mancha con 5% AgNO 3 en agua destilada.
- Diferenciación condrogénica
- Cubos de corte (3 mm por lado) de un dispositivo médico en forma de esponja, constituidas a partir de liofilizado de colágeno de tipo I, y se utilizan como material de soporte para apoyar las células 17.
- MSCs semilla en la parte superior de los cubos a la concentración de 4 x 10 6 células / ml (~ 70.000 células / cubo).
- Antes de la adición de medios de comunicación, permiten que las células se adhieran a los cubos de 30 min.
- Mantener construcciones-MSC colágeno en medios condrogénica que consisten en DMEM / F12 + GlutaMAX, 2,5% de FBS, 100 unidades / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 2,5 mg / ml de anfotericina B, 40 ng / ml de dexametasona, 50 g / ml ascórbico ácido 2-fosfato,50 mg / ml de L-prolina, 1x insulina-transferrina-selenio X, y 10 ng / ml factor de crecimiento transformante-β1.
- Utilice la tinción con azul Alcian para visualizar la acumulación de proteoglicanos en construcciones secciones. En pocas palabras, manchar las secciones O / N con 0,4% de azul alcián disuelto en 0,01% de H 2 SO 4 y 0,5 M hidrocloruro de guanidina. A continuación, lavar las secciones se lavaron durante 30 minutos en el 40% de DMSO y 0,05 M de MgCl2. Las células fueron counterstained con rojo nuclear.
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Representative Results
Los hechos que el 74% de las muestras de médula ósea caninas (n = 54) contenía coágulos cuando llegaron a nuestro laboratorio (Figura 1 A) junto con la disminución de los rendimientos de MSC partir de estas muestras, nos hizo creer que un número considerable de las MSC estaba atrapado dentro de los coágulos . De hecho, un simple DAPI-mancha del material de coágulo seccionada confirma la presencia de células nucleadas en alta densidad (Figura 1B). Da lugar a un bajo número de MSC disponibles para la cultura de expansión, lo que nos activan para desarrollar el protocolo utilizando uroquinasa. Normalmente coágulos desaparecen casi por completo al aplicar nuestro protocolo. Sin embargo, durante el desarrollo del método se abordó la cuestión de la coagulación de digerir sistemáticamente por pesada antes y después del resumen. Estos experimentos revelaron que los restos no digeridos fueron del 15% (perro) o 9% (humana) del peso del coágulo inicial (Figura 2A).
Una característica típica de la médula ósea derivada MSCs es la unabilidad de adherirse a placas de cultivo celular. Los investigadores hacen uso de esta característica para seleccionar las MSC. Como consecuencia, un ensayo de formación de colonia permite evaluar la calidad de la piscina de células de una manera sencilla, cuantitativa y fiable. En nuestro laboratorio, el ensayo de formación de colonias descrito en el presente documento ha sido aplicada rutinariamente a todas las muestras de médula ósea procesados (también los no coagulada). Esto nos permitió utilizar el ensayo como criterio principal para determinar la eficacia de la urocinasa resumen. Para permitir la comparación directa, las células de filtrados de muestra coagulada (es decir, como si muestras coaguladas se acaba filtraron pero no tratadas enzimáticamente) y se digirieron coágulos fueron sembradas en placas de 10 cm separados seguido de incubación durante dos semanas. Cuando la visualización de unidades formadoras de colonias (UFC) con tinción de Giemsa (como se muestra en la Figura 2B), se observó 3,8 veces más CFU de las reacciones de uroquinasa de muestras caninas que partir de los correspondientes filtrados iniciales (Figura 2C). Although menos prominente, muestras humanas siguieron una tendencia similar con 1,6 veces más CFU de las muestras tratadas, lo que confirma la idoneidad del protocolo. De hecho, las placas de coágulo digerido ilustrados en la fila derecha en la Figura 2B corresponden al resultado típico visto para una muestra conjunta. Sin embargo, la variación donante puede fácilmente resultar en números de CFU de la mitad al doble de lo que se representa.
Tomando el tamaño de la colonia como indicador de la calidad de la piscina celular, más medio (2-5 mm) y grandes (> 5 mm) que aparecieron las colonias en las placas sembradas de coágulos en comparación con el CFU de filtrados (Figura 2C). En general, esto indica que las MSC crecen normalmente después del tratamiento uroquinasa. También en el agregado, la comparación de las muestras caninas digeridos (n = 21) a las muestras sin coágulo (n = 7) proporcionó números comparables de MSCs totales para las muestras tratadas, aunque una gran variación entre las muestras se observó debido a la población de donantes heterogénea (Figura2D).
Como última prueba funcional de idoneidad, se indujo la diferenciación de las MSC derivados de muestras de médula ósea digeridos. Las aplicaciones en terapias con células madre autólogas se basan en MSC diferenciación en cartílago, hueso o tejido adiposo o MSC paracrina de señalización 18. Las células pueden ser guiados hacia el camino deseado de la diferenciación por la elección de las condiciones de cultivo adecuadas para la diferenciación adipogénico 19, la diferenciación osteogénica 20 o linaje condrogénico 17. Por lo tanto, se compararon las MSC de coágulo de médula ósea a las MSC derivadas de la muestra coagulada médula ósea. Después de cuatro semanas en cultivo, fue posible diferenciar las MSC en los tres linajes mencionados anteriormente. Esto fue probado histológicamente con Von Kossa (por linaje osteogénico), Oil Red O (adipogenic) y azules (Alcian condrogénicas) coloraciones, que no muestran diferencias en el grado de diferenciación entre los grupos ( 
Figura coágulos de médula ósea. 1. Porcentaje de muestras caninas y de médula ósea humana en estado parcialmente coagulada a la llegada (A). Además, hemos encontrado que los rendimientos de MSC de muestras coaguladas fueron fuertemente reducidas debido a un alto número de células atrapadas dentro de los coágulos. Un alto número de células nucleadas están presentes dentro de los coágulos como se demuestra por tinción DAPI de un cryosection de un coágulo de médula ósea canino (B). La barra de escala representa 200 micras. 
Figura 2. Aislamiento de MSC de médula ósea de coágulos digeridos con uroquinasa. (A) Por lo general, los coágulos de médula ósea desaparecen casi por completo de la uroquinasa resumen.Tras el desarrollo del método, se evaluó pesos coágulo de canino (n = 5, con una media ± DE, ** p ≤0.01) y muestras humanas (n = 3, media ± SD, ns = no significativo p = 0,10) que se redujeron en gran medida de uroquinasa resumen. (B) Un ensayo de CFU simple puede servir como una herramienta informativa para evaluar la calidad de una preparación de MSC. Para evaluar la eficacia de la digestión, se realizó el ensayo de CFU para los filtrados y los coágulos digeridos a partir de aspirados de médula ósea por separado. Después de dos semanas de cultivo, 10 placas de control cm fueron teñidas con Giemsa y CFU se contaron. El ensayo confirmó que el alto número de CFU puede ser liberado del coágulo por la uroquinasa digerir y seguir siendo funcional. Esto se confirma también por la alta frecuencia de colonias grandes (clase de división:.> 5 mm en negro, de 2-5 mm de color gris oscuro y <2 mm en color gris claro barras de error representan SD del total CFU (n = 5 para perro , n = 3 para el consumo humano, ** p ≤0.01, ns = no significativo, p = 0,17). (C) Imagens de placas teñidas con Giemsa confirmar los resultados mostrados. Las placas que se muestran para coágulo digerido corresponden a un resultado típico para una muestra de médula ósea digerido - sin embargo, los números pueden variar debido en gran medida a la variabilidad de los donantes. (D) En la suma, la aplicación de la uroquinasa digerir protocolo (n = 21) se traduce en rendimientos MSC totales comparables después de la cultura expansión de forma natural coágulo muestras gratuitas (n = 7, media ± DE). Se realizó un análisis estadístico para toda la Figura 2, utilizando la prueba t de Student. 
Figura 3. Comparación del potencial de diferenciación de las digerido frente a muestras de forma nativa no coagulada. MSC caninas aisladas de coagulada médula ósea tratados con uroquinasa (fila superior) y la médula ósea no coagulada (fila inferior) se diferenciaron en el fenotipo osteogénico y manchado de Von Kossa (barra =200 micras), fenotipo adipogénico estaba manchada por Oil Red O (barra = 100 m; en las inserciones mayor ampliación de vacuolas de grasa), mientras que la condrogénesis fue revelado por tinción con azul Alcian (barra = 100 m; counterstaining rojo nuclear). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura .
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Discussion
Rutinariamente muestra de médula ósea, mientras que el paciente está sometido a cirugía (en nuestro caso la cirugía, principalmente la columna vertebral), con la ventaja de que sólo poco trabajo adicional tiene que ser llevada a cabo por el personal de la sala de operaciones. A pesar de que las muestras se mezclan con citrato de sodio inmediatamente después de la retirada, muchas muestras fueron parcialmente coagulada cuando llegaron en el laboratorio para su procesamiento. En esta etapa, el remuestreo para reemplazar muestras coaguladas sería una intervención adicional separada que requiere de nuevo la anestesia local o general 6. Esto requiere la voluntad tanto del personal clínico y el donante de contribuir y consume una gran cantidad de recursos 21.
Aquí ofrecemos un protocolo que utiliza urocinasa humana recombinante en muestras de médula ósea coagulados aislar MSC multipotentes. Hemos podido demostrar que el tratamiento uroquinasa no daña las células y se conserva el potencial de diferenciación. El protocoloes corto, ya que prolonga procesamiento de la muestra sólo en aproximadamente 1 ½ h, en comparación con las muestras no coagulada mientras produciendo conjuntos de células comparables. Hasta la fecha, este protocolo se ha aplicado con éxito en la formación de coágulos de médula ósea procedentes de diferentes personas y perros usando uroquinasa de varios lotes y ha demostrado un éxito robusto y reproducible. Aparte de esto, la uroquinasa actúa indirectamente a través de la activación de la muestra intrínseca del plasminógeno. Esto implica que la reacción uroquinasa requiere el plasma y el medio ambiente. Por tanto, es aconsejable introducir etapas de enjuagar coágulo o por igual con, por ejemplo, PBS. Esto diluiría el medio ambiente suero y dar lugar a una desaceleración significativa de la reacción enzimática.
La decisión de utilizar uroquinasa para nuestro método y no otro fármaco trombolítico era trivial: se desarrolló el protocolo basado en el fármaco trombolítico fácilmente disponibles en nuestra farmacia del hospital. Para otros grupos de investigación que, por tanto, puede ser más fácil de usar un pañuelo típicoe activador del plasminógeno (es decir., un fármaco diferente, como la alteplasa, reteplasa o tenecteplasa) si uroquinasa no está disponible. Sin embargo, existen diferencias potencialmente importantes entre los fármacos: a diferencia de los activadores del plasminógeno de tipo tisular, uroquinasa puede desencadenar la activación y la proliferación celular cuando se une al receptor del activador del plasminógeno de tipo uroquinasa (uPAR) 22. Tras la unión, las cascadas de señalización intracelular que se activan conducir a la migración y proliferación celular. En una situación fisiológica Esto se ve apoyado por la secreción de metaloproteinasas de la matriz por las células activadas. Sin embargo, en nuestro sistema, uroquinasa se diluye y elimina gradualmente en la cultura expansión sin mostrar efectos perjudiciales. Aún así, con respecto al uso previsto de las MSC aisladas, la idoneidad de cualquiera de los fármacos trombolíticos necesita ser determinado individualmente.
En general, se recomiendan dosis altas de coágulo rápido y completo compendio de MIsignifica quitar importancia a la selección no deseada durante el procesamiento de coágulos. , Muchos estudios anteriores notables utilizan estreptoquinasa bacteriana para digerir la sangre y la médula ósea coágulos 13,14. Sin embargo, este medicamento puede provocar la activación y la respuesta del sistema inmune, que puede ser un gran inconveniente, especialmente cuando se pretende la aplicación de las células a los pacientes no deseado.
Por ello creemos que nuestro protocolo no sólo ayuda a los investigadores y profesionales de la medicina para ahorrar tiempo y reducir los costos. Utilizando uroquinasa - una droga enzimática aprobado sin antigenicidad conocido - incluso puede proporcionar una herramienta valiosa para muchos laboratorios de investigación traslacional, para una utilización terapéutica de las preparaciones de MSC.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Basal Medium Components | |||
| PenStrep 100X | Gibco | 15140122 | |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| MEM Alpha w/ Nucleoside, w/ stable Glutamine | Amimed | 1-23S50-I | |
| FBS Heat Inactivated | Amimed | 2-01F36-I | |
| Amphotericin B | Applichem | A1907 | |
| Adipogenic Medium Components | |||
| DMEM-HAM F12 + GlutaMAX | Amimed | 1-26F09-I | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| Rabbit serum | Gibco | 16120099 | |
| Dexamethasone | Applichem | D4902 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| Rosiglitazone | Sigma | R2408 | |
| Pantothenate | Sigma | P5155 | |
| Oil Red-O | Sigma | O0625 | |
| Osteogenic Medium Components | |||
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
| ß-glycerophosphate | Sigma | G9422 | |
| Silver nitrate (AgNO3) | Sigma | S6506 | |
| Chondrogenic Medium Components | |||
| Biopad - sponge shaped medical device | Euroresearch | ||
| L-proline | Sigma | P5607 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium X | Gibco | 51500056 | |
| Human transforming growth factor-β1 | Peprotech | 100-21 | |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A3157 | |
| Nuclear fast red | Sigma | N8002 | |
| Generic | |||
| Tri-Sodium citrate dihydrate | Applichem | A3901 | |
| PBS | Applichem | 964.9100 | |
| Urokinase | Medac | 1976826 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 | |
| Giemsa stain | Applichem | A0885 | |
| Formaldehyde | Applichem | A0877 | |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Applichem | A0655 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Applichem | A1584 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Applichem | A3618 | |
| Guanidine hydrochloride | Applichem | A1499 | |
| Consumables | |||
| 50 ml reaction tube | Axygen | SCT-50ML-25-S | |
| 10 ml syringe | Braun | 4606108V | |
| Sterican needle (22G) | Braun | 4657624 | |
| 1.7 ml Microtubes | Brunschwig | MCT-175-C | |
| 100 μm cell strainer | Falcon | 6.05935 | |
| sterile forceps | Bastos Viegas, SA | 489-001 | |
| sterile scalpel | Braun | 5518059 | |
| Primaria cell cuture dish | Falcon | 353803 | |
| C-Chip Neubauer Improved | Bioswisstech | 505050 | |
| cell culture flask - Flask T300 | TPP | 90301 | |
| Equipment | |||
| Microbiological biosafety cabinet class II | Skan | 82011500 | |
| water bath | Memmert | 1305.0377 | |
| Stripettes Serological Pipette 5ml | Corning | 4487-200ea | |
| microscope | Olympus | CKX41 | |
| humidified incubator Heracells 240 | Thermo scientific | 51026331 | |
| Heraeus Multifuge 1S-R | Thermo scientific | 75004331 |
References
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