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Engineering

भूतल EBL गढ़े Nanostructured Substrates का प्रयोग biomolecules की रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी जांच बढ़ी

doi: 10.3791/52712 Published: March 20, 2015

Abstract

निर्माण और स्थिर biomolecules के साथ ठोस समर्थन करता है पर धातु के nanostructures interfacing एकत्रित नैनो जैविक प्रणालियों के लक्षण वर्णन सूचना दी है। प्रासंगिक प्रयोगात्मक चरणों का पूरा दृश्य इलेक्ट्रॉन बीम लिथोग्राफी, substrates पर biomolecules के स्थिरीकरण का उपयोग कर nanostructured substrates के निर्माण से जुड़े, वर्णन किया गया है, और उनके लक्षण वर्णन का उपयोग सतह बढ़ाया रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी (SERS)। नैनो जैविक प्रणालियों के तीन अलग अलग डिजाइनों के एक प्रोटीन, ग्लूकोज बाध्यकारी प्रोटीन, और एक डोपामाइन बाध्यकारी डीएनए aptamer सहित कार्यरत हैं। बाद के दो मामलों में, संबंधित ligands, ग्लूकोज़ और डोपामाइन के बंधन, भी शामिल है। biomolecules के तीन प्रकार के अलग अलग तरीकों से nanostructured substrates पर स्थिर रहे हैं, और SERS इमेजिंग के परिणामों को रिपोर्ट कर रहे हैं। SERS की क्षमताओं सतह प्रोटीन से कंपन मोड पता लगाने के लिए, साथ ही प्रोटीन ligand के एक पर कब्जा करने के लिएडी aptamer-ligand के प्रदर्शन कर रहे हैं बाध्यकारी। परिणाम यह भी सतह nanostructure ज्यामिति, biomolecules स्थिरीकरण रणनीति, अणुओं और अधिग्रहण के SERS स्पेक्ट्रा पर बाध्यकारी ligand की उपस्थिति या अनुपस्थिति के रमन गतिविधि के प्रभाव के उदाहरण देकर स्पष्ट करना।

Introduction

ठोस nanostructures और जैविक पॉलिमर interfacing एकत्रित नैनो जैविक प्रणालियों को विकसित करने और चिह्नित करने के लिए क्षमताओं को अगली पीढ़ी के जैव संवेदन और जैव प्रवर्तन प्रौद्योगिकियों 1,2 में आगे प्रगति करने के लिए तेजी से महत्वपूर्ण होते जा रहे हैं। यह एक ऐसी उचित ठोस राज्य घटकों (सूक्ष्म या नैनो इलेक्ट्रोड, नैनो इंजीनियर कोटिंग्स, nanowires, या नैनोकणों) 2,3,4 के निर्माण के रूप में अनुसंधान क्षेत्रों की एक संख्या भर में बहु-विषयक पढ़ाई शामिल है; वांछित bioconjugates 5,6,7 बनाने के लिए सतहों पर biomolecules के स्थिरीकरण; और नैनो जैविक इंटरफेस एक निगरानी। ज्यादातर मामलों में, इष्टतम निर्माण, जैव functionalization, और लक्षण वर्णन तरीकों में से चयन दृढ़ता से अंतर से संबंधित है। जाहिर है, nanofabrication तकनीकों की पसंद, प्रणाली की ठोस राज्य घटकों की आवश्यकताओं के द्वारा संचालित किया जाएगा पता लगाने के विधि, पर काफी हद तक निर्भर होने जो टू मेंआर.एन. शामिल बायोपॉलिमरों की प्रकृति और इंटरफ़ेस निगरानी के उद्देश्य से निर्धारित होता है।

Bioconjugate सिस्टम 1,3, सतह बढ़ाया रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी (SERS) चिह्नित करने के लिए लागू किया तकनीकों का एक व्यापक विविधता से बाहर सतहों 8,9,10,11 पर रासायनिक और जैविक प्रजातियों का पता लगाने के लिए एक बेहद होनहार पद्धति के रूप में उभरा है। SERS आणविक कंपन करने के लिए इसी अद्वितीय हस्ताक्षरों का कब्जा अनुमति देने के लिए सतह immobilized biomolecules (चित्रा 1) द्वारा एक रंग का प्रकाश की स्थिर बिखरने कार्यरत हैं। यह क्षमता लेबल, जटिल रसायन विज्ञान, या समय लेने वाली चरणों को शामिल किए बिना विभिन्न अणुओं के बीच भेद करने के लिए, SERS जैव का पता लगाने के एक संभावित बहुत कारगर तरीका बनाता है। SERS का एक अन्य महत्वपूर्ण लाभ यह है कि इसकी उच्च संवेदनशीलता है। महान धातु nanostructures (SERS substrates,) के साथ बातचीत के दौरान प्रकाश के द्वारा स्थानीय सतह plasmons की उत्तेजना को नाटकीय ढंग से पूर्णांक बढ़ जाती हैरमन monolayers से एकल अणु सीमा 8,9,10,11 करने के लिए नीचे, अणुओं की बहुत थोड़ी मात्रा का पता लगाने के लिए अनुमति देता है, विश्लेष्य द्वारा बिखरने की ensity। अंत में, सबसे biomolecules स्थिर हो जलीय समाधान की आवश्यकता है। पानी अक्सर सीमित रमन गतिविधि है, क्योंकि जलीय नमूनों से पृष्ठभूमि संकेत 9 कम से कम है। SERS के आवेदन पिछले एक दशक में 10 से अधिक एक घातीय वृद्धि का प्रदर्शन किया है। हालांकि, SERS का एक बहुत चर्चा की चुनौती रमन बिखरने के विद्युत चुम्बकीय वृद्धि plasmonic लहरों 11,12,13 प्रेरित कर रहे हैं, जहां धातु nanostructures के आकार, आकार, और रिक्ति पर गंभीर रूप से निर्भर करता है। सब्सट्रेट ज्यामिति के nanoscale आयामों पर आवश्यक है अधिक कुशल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य SERS माप को प्राप्त करने के लिए, नियंत्रित करते हैं।

चित्र 1
चित्रा 1. सुप्रीम कोर्टसतह बढ़ाया रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी का हीम।

SERS substrates, 11,12,13 निर्माण करने के लिए कार्यरत कई तरीके मोटे तौर पर नीचे-ऊपर और ऊपर से नीचे के तरीकों में वर्गीकृत किया जा सकता है। पहले प्रकार के तरीके आत्म विधानसभा या nanostructures के उत्पादन के लिए निर्देशित रासायनिक संश्लेषण की विभिन्न प्रक्रियाओं को रोजगार। अक्सर उदाहरण ठोस समर्थन करता है 11,12,13, थर्मल, धूम, या roughened धातु फिल्मों 11,12 की विद्युत बयान है, और विभिन्न रासायनिक संश्लेषण के तरीकों पर 13 monodisperse नैनोकणों के स्थिरीकरण शामिल संबोधित किया। इस तरह की तकनीक अपेक्षाकृत सरल और सस्ती हो जाते हैं हालांकि, उनमें से ज्यादातर एक संरचनाओं के स्थान पर नियंत्रण की कमी है, और सीमित नमूना नमूना reproducibility के द्वारा चुनौती दी है।

इसके विपरीत, ऊपर से नीचे लिथोग्राफी तकनीक सतहों पर वांछित पैटर्न बनाने के लिए इस तरह के कण मुस्कराते हुए के रूप में manipulable उपकरणों को रोजगार। सबसे अक्सर इस्तेमाल में से एकठोस समर्थन 11,12 पर अलग सब्सट्रेट डिजाइन के लिए अनुमति देने के लिए भी 10 एनएम और नीचे एक लचीलापन करने के लिए नीचे सुविधाओं पर नैनोलिथोग्राफी तरीकों, इलेक्ट्रॉन बीम लिथोग्राफी (EBL), शानदार नियंत्रण प्रदान करता है। EBL में, इलेक्ट्रॉनों की एक किरण उजागर क्षेत्रों में एक रासायनिक परिवर्तन के कारण एक इलेक्ट्रॉन संवेदनशील सामग्री (विरोध) की एक सतह भर में व्यास स्कैन में कुछ नैनोमीटर के एक जगह करने के लिए नीचे ध्यान केंद्रित किया। सकारात्मक टोन के लिए इस तरह तैयार नहीं एक उपयुक्त विलायक (डेवलपर) में एक वृद्धि की विलेयता के लिए अग्रणी polymethylmethacrylate (PMMA) का विरोध रचना बहुलक श्रृंखला का बँटवारा में इलेक्ट्रॉन बीम लोगों तक पहुंचाने के परिणाम के रूप में। इलेक्ट्रॉन बीम लिथोग्राफी की प्रक्रिया एक सब्सट्रेट पर विरोध का एक समान परत के स्पिन कोटिंग भी शामिल है; एक इलेक्ट्रॉन बीम के साथ एक निर्वात चैम्बर में लक्षित विरोध सामग्री के प्रदर्शन; और नमूने के विकास घुलनशील क्षेत्रों को दूर करने के लिए।

ऐसे जुड़े सिलिका के रूप में धातु nanostructures के नीचे ढांकता का समर्थन करता है, ख हैदिखाया een काफी होने के कारण ऐसे सिलिकॉन 14,15 के रूप में अन्य सामग्री की तुलना में plasmonic तरंगों का स्थानीयकरण करने के लिए SERS में तीव्रता बढ़ाने के लिए। हालांकि EBL patterning के ढांकता हुआ substrates पर, विशेष रूप से nanoscale पर, प्रदर्शन के दौरान बिल्ड अप को चार्ज करने के कारण महत्वपूर्ण चुनौतियों शामिल है। इससे पहले, हम इन कठिनाइयों का विरोध से ऊपर प्रवाहकीय बहुलक परतों रखकर दूर किया जा सकता है कि 16,17 से पता चला है। चित्रा 2 इनकार पर धातु nanostructures के उत्पादन के लिए धातु बयान और liftoff के द्वारा पीछा EBL जोखिम और विकास का उपयोग समग्र निर्माण की प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध से पता चलता है सिलिका का समर्थन करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
ई 2. योजना चित्रा। किरण लिथोग्राफी, धातु बयान, और liftoff के प्रक्रिया ढांकता हुआ substrates के 16-19 पर धातु nanostructures के निर्माण करने के लिए कार्यरत चरणों lectron इस पत्र में, हम EBL, substrates के जैव functionalization के द्वारा SERS substrates, निर्माण से जुड़े प्रक्रिया कदम का पूरा दृश्य उपस्थित है, और रमन स्पेक्ट्रा का संग्रह। हमारे हाल ही में काम करता 18,19 में पता लगाया तीन डिजाइनों (देखें आंकड़े 3 और 4, और तालिका 1) को संबोधित कर रहे हैं। डिजाइन एक में, पुनः संयोजक प्रोटीन एक एक जुड़े सिलिका (एफएस) का समर्थन 18 पर जैव क्रियाशील एयू के nanostructures पर स्थिर है, और प्रोटीन की SERS पता लगाने प्रदर्शन किया है। डिजाइन 2 में, पुनः संयोजक ग्लूकोज बाध्यकारी लिगेंड (ग्लूकोज़) के साथ और बिना प्रोटीन 21,26,27 नी-लेपित एफएस पर एजी nanostructures के बीच रिक्त स्थान में हिस्टडीन टैग के माध्यम से स्थिर है, और प्रोटीन से ग्लूकोज के बंधन पता चला है। डिजाइन 3 में, thiolated डोपामाइन बाध्यकारी डी.एन.एक aptamer 19,23 एफएस पर एयू के nanostructures पर स्थिर है, और स्थिर aptamer द्वारा डोपामाइन के बंधन प्रदर्शन किया है। सब्सट्रेट रमन स्पेक्ट्रा अधिग्रहण करने के लिए तैयारी, और विभिन्न biomolecules और स्थिरीकरण की रणनीतियों के प्रतिनिधि से सभी प्रासंगिक प्रायोगिक कदमों के समावेशी, इन उदाहरणों के SERS के विकास के लिए SERS द्वारा नैनो जैविक इंटरफेस पूछताछ अन्वेषण अनुसंधान से, आवेदन की एक व्यापक विविधता के लिए उपयोगी होते हैं एक मान्यता पद्धति के रूप में बाध्यकारी प्रोटीन या aptamer-ligand के रोजगार छोटे अणुओं की biosensors। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
Immobiliza के तरीकों, विभिन्न biomolecules का उपयोग कर तीन प्रतिनिधि डिजाइन 3. योजनाएं चित्राtion, और सब्सट्रेट सामग्री: (ए) एक आत्म इकट्ठे monolayer डि पानी में 11-mercaptodecanoic एसिड की (एसएएम) (MUA) से क्रियाशील महान धातु नैनो डॉट्स पर स्थिर प्रोटीन एक; (बी) के महान धातु नैनो डॉट्स के बीच सब्सट्रेट सतह पर स्थिर ग्लूकोज़ के साथ complexed हिस्टडीन टैग ग्लूकोज बाध्यकारी प्रोटीन (जीबीपी); (सी) महान धातु नैनो डॉट्स पर स्थिर डोपामाइन (यूके) के साथ पूरा डोपामाइन बाध्यकारी aptamer thiol समाप्त। तालिका 1 में अधिक जानकारी के लिए देखें। पैनल (बी) से यह साफ डिजाइन 2 में, इसी ligand के बिना एक नमूना भी तुलना के लिए तैयार किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4।तीन डिजाइनों में कार्यरत biomolecules: (ए) के एक प्रोटीन; (बी) ग्लूकोज बाध्यकारी प्रोटीन और ग्लूकोज़; (सी) डीएनए aptamer और डोपामाइन बाध्यकारी डोपामाइन। में प्रोटीन तृतीयक संरचनाओं (क) और (ख) क्रमशः, और LINUXAMD64 के लिए VMD के साथ तैयार प्रोटीन डाटा बैंक, PDB आईडी 1BDD 20 और 2HPH 21, संस्करण 1.9.1 22 से ले रहे हैं। (ग) में aptamer माध्यमिक संरचना ValFold 24 सॉफ्टवेयर का उपयोग कर अनुक्रम में 23 से भविष्यवाणी की है और PseudoViewer 3.0 25 के साथ तैयार की है। जी, ए, टी, और सी गुआनिन, एडिनाइन, थाइमिन, और साइटोसिन न्यूक्लियोटाइड के अनुरूप पत्र, क्रमशः। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

डिजाइन एक डिजाइन 2 डिजाइन 3
Biopolymer एक प्रोटीन ग्लूकोज बाध्यकारी प्रोटीन (जीबीपी) डोपामाइन बंधन aptamer (यूके)
बाइंडर 11-Mercaptoundecanoic एसिड (MUA) आत्म इकट्ठे monolayer (एसएएम) हिस्टडीन टैग Thiol Linkers
Ligand कोई नहीं ग्लूकोज़ डोपामाइन
समाधान विआयनीकृत (डीआई) पानी पोटेशियम फॉस्फेट बफर Tris (hydroxymethyl) aminomethane (TRIS) और ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) बफर; फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस)
सब्सट्रेट एफएस पर एयू संरचनाओं नी-लेपित एफएस पर एजी संरचनाओं एफएस पर एयू संरचनाओं
नमूनों की गिरफ्तारीईए एक्स 10 माइक्रोन चार माइक्रोन एक्स 8 माइक्रोन चार माइक्रोन एक्स 10 माइक्रोन चार माइक्रोन
पैटर्न एयू डॉट्स, 50 एनएम पिच एजी डॉट्स, 40 एनएम पिच एयू hexagons, 200 एनएम पिच
एजी hexagons, 200 एनएम पिच एयू असंरचित पैड
एजी असंरचित पैड
EBL जोखिम खुराक डॉट्स: डॉट्स: 105 μC / 2 सेमी Hexagons: 180 μC / 2 सेमी
ऐरे मैं 120 μC / 2 सेमी Hexagons: 170 μC / 2 सेमी
ऐरे द्वितीय 96 μC / 2 सेमी
ऐरे तृतीय 72μC / 2 सेमी
लेजर उत्तेजना तरंगदैर्ध्य 532 एनएम 532 एनएम 780 एनएम

तालिका 1. नैनो जैविक प्रणालियों के तीन डिजाइन।

Protocol

1. सब्सट्रेट तैयारी

  1. 1 सेमी में × 1 सेमी या छोटे पासों एक जुड़े सिलिका (एफएस) मे कटौती करने के लिए एक अर्धचालक dicing देखा प्रयोग करें।
  2. एक पिरान्हा समाधान में स्वच्छ नमूने (एच 2 अतः 4: एच 22, 3: 1; चेतावनी: मजबूत आक्सीकारक) 15 मिनट के लिए स्नान 28, फिर विआयनीकृत पानी में पासा कुल्ला और नाइट्रोजन में सूखा।
  3. एक hotplate पर नमूने 15 मिनट के लिए 180 डिग्री सेल्सियस पर सामना रखें। आरटी के लिए hotplate से हटाने के बाद नमूने शांत।
  4. डिजाइन 1 और 3 के लिए, दो कदम आगे बढ़ना।
  5. डिजाइन 2 के लिए, नी के एक 10 एनएम परत के साथ एक इलेक्ट्रॉन बीम वाष्पीकरण कक्ष और कोट में नमूना जगह है।

इलेक्ट्रॉन बीम लिथोग्राफी का उपयोग नैनो नमूनों PMMA मास्क 2. निर्माण (EBL)

  1. स्पिन कोट PMMA के विरोध और substrates पर प्रवाहकीय परतें।
    1. अलग-अलग चक पर केंद्र में एक निर्वात चक और जगह के नमूनों के साथ एक वेफर स्पिनर का प्रयोग करें। जगहPolymethylmethacrylate (PMMA) की एक बूंद एक दो सेकंड रैंप समय के साथ 60 सेकंड के लिए 3500 rpm पर एक गिलास पिपेट और स्पिन का उपयोग कर नमूने के केंद्र पर विरोध।
    2. 3-5 मिनट के लिए 180 डिग्री सेल्सियस पर substrates के लिए बनाओ। Substrates के पाक के बाद, आरटी के लिए नमूने शांत करते हैं।
    3. Substrates के ठंडा और स्पिनर चक को लौट साथ, सब्सट्रेट पर प्रवाहकीय बहुलक की एक बूंद फैल गया। एक दो सेकंड रैंप समय के साथ 3000 rpm पर 40 सेकंड के लिए सब्सट्रेट स्पिन। 1 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर सेंकना नमूने हैं।
  2. मानक प्रक्रिया 16,17,18,29 के अनुसार EBL जोखिम प्रदर्शन करते हैं।
    1. निर्माता के निर्देशों का प्रयोग, छोटी संभव किरण कदम आकार के साथ तालिका 1 से सुविधा खुराक को रोजगार एक जोखिम डिजाइन तैयार करते हैं।
    2. इलेक्ट्रॉन बीम लिथोग्राफी चेंबर में नमूना लोड। EBL प्रणाली autofocusing नहीं है, ध्यान देने के लिए मनका किनारे से दूर पैटर्न से अवगत कराया जा रहा है, जहां से और दूर एक छोटी सी खरोंच का उपयोगआईएनजी।
    3. निर्माता के निर्देशों का प्रयोग, ध्यान केंद्रित की जरूरत है और उचित रूप में दृष्टिवैषम्य सुधार के रूप में अच्छी तरह के रूप में लिखने क्षेत्र संरेखण, और बेनकाब नमूना प्रदर्शन करते हैं। उचित जोखिम प्रोफाइल और सबसे अच्छा पैटर्न की गुणवत्ता के लिए अनुमति देने के लिए, एक 30 कीव इलेक्ट्रॉन बीम ऊर्जा और निवेश के लिए 7.5 माइक्रोन एपर्चर का उपयोग करें।
  3. प्रवाहकीय बहुलक निकालें और उजागर नमूने का विकास।
    1. एक डेवलपर के मिश्रण के साथ प्रवाहकीय बहुलक और एक दूसरे बीकर को हटाने के लिए विआयनीकृत (डीआई) पानी के साथ एक बीकर तैयार करें (आईपीए: एच 2 हे, 7: 3), और आरटी पर 5 मिनट के लिए हलचल। एक कुल्ला एजेंट के रूप में एक तिहाई बीकर में isopropanol (उच्च शुद्धता) तैयार करें।
    2. चिमटी का प्रयोग, तब, प्रवाहकीय बहुलक फिल्म को दूर डेवलपर में नमूना जगह है और धीरे-धीरे ऊपर और नीचे 20 सेकंड के लिए चिमटी ले जाने के लिए तीन सेकंड के लिए पानी में नमूने जगह है। तुरंत isopropanol के लिए substrates के हस्तांतरण और 10 से अधिक सेकंड के लिए कुल्ला, तो नाइट्रोजन के साथ नमूना सूखी।
    3. </ राजभाषा>

    3. महान धातु nanostructures निर्माण

    1. नमूने के सामने चेहरे पर जमा किया जा सुखाया धातु के लिए अनुमति देने के लिए उल्टा इलेक्ट्रॉन बीम बाष्पीकरण प्रणाली में नमूने लोड। लगभग 0.1 एनएम / सेकंड की दर से डिजाइन 1 और 3, और डिजाइन 2 के लिए एक 10 एनएम मोटी एजी परत के लिए नमूने पर एक 10 एनएम मोटी एयू परत जमा।
    2. पानी के साथ की सिफारिश की ऊंचाई करने के लिए एक sonication प्रणाली भरें और एसीटोन के साथ एक अलग बीकर भरें। बीकर के तल में एक नमूना चेहरे को रखें और नमूना 10 मिनट के लिए सोख करने के लिए अनुमति देते हैं। बीकर होल्डिंग, नहाने के पानी में डाल दिया है और एसीटोन की ऊंचाई पानी की ऊंचाई से मेल खाते हैं और sonication प्रणाली चालू करने के लिए अनुमति देते हैं। Sonication के लिए 60 सेकंड के लिए उत्पन्न करने के लिए अनुमति दें।
    3. 3.1 कदम में विस्तृत रूप में एक ही प्रक्रिया का उपयोग करना, एफएस (डिजाइन एक और 3) और नी-लेपित एफएस (डिजाइन) 2 substr पर 10 एनएम मोटी धातु फिल्मों के बयान से वर्दी Au और एजी पैड substrates के को तैयारचरण 2 लंघन ates।

    Substrates के 4. जैव functionalization

    1. डिजाइन एक नमूने तैयार:
      1. आरटी पर इथेनॉल में 11-mercaptodecanoic एसिड (MUA) के एक 1 मिमी समाधान तैयार है। 10 मिनट के लिए sonicate।
      2. 48 घंटा के लिए MUA के समाधान में उचित nanostructured सब्सट्रेट विसर्जित कर दिया। आरटी पर 5 मिनट के लिए इथेनॉल के साथ तीन बार और सूखी नमूना कुल्ला।
      3. (3 (dimethylamino) propyl) carbodiimide (ईडीसी) डि पानी में - एन -ethyl- 'एन के एक 75 मिमी समाधान तैयार है। डि पानी में एन -hydroxysuccinimide (एनएचएस) के एक 15 मिमी समाधान तैयार है।
      4. सब्सट्रेट पर एयू पर एक micropipette जमा एनएचएस के 100 μl का उपयोग करना, और तुरंत ही क्षेत्र पर ईडीसी के 100 μl जोड़ें। आत्म इकट्ठे monolayer MUA की (एसएएम) को सक्रिय करने के लिए एक मिनट के लिए सेते हैं।
      5. प्रोटीन की एक 100 μl ड्रॉप सब्सट्रेट के एक ही क्षेत्र पर एक समाधान (47 माइक्रोन) प्लेस और एक बहु डिब्बे पेट्री विकास में 5 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए नमूना की दुकानदूसरे डिब्बे में डि पानी के 1 मिलीलीटर के साथ ish, और एक मुहरबंद लिफाफे के साथ।
      6. लगातार प्रत्येक बीकर में 20 सेकंड के लिए अलग बीकर में नमूने सरगर्मी से डि पानी में नमूना तीन बार कुल्ला। नमूने rinsing के बाद या कुल्ला के दौरान सूखा मत देना।
      7. 5 कदम आगे बढ़ना।
    2. डिजाइन दो नमूने तैयार:
      1. पोटेशियम फॉस्फेट बफर में ग्लूकोज बाध्यकारी प्रोटीन (जीबीपी) के एक 0.9 मिमी समाधान (कश्मीर 2 HPO 4, 25 मिमी, पीएच 7.5) तैयार करें। बफर में ग्लूकोज़ की एक 100 मिमी समाधान तैयार है।
      2. 100 मिमी ग्लूकोज़ समाधान के 30 μl और 1 मिलीलीटर प्लास्टिक microtube कंटेनर और एक micropipette का उपयोग 0.9 मिमी जीबीपी समाधान के 30 μl मिलाएं। 30 मिनट के लिए सेते हैं।
      3. जमा ligand के मुक्त जीबीपी समाधान की और एक micropipette का उपयोग कर तैयार substrates पर ligand बाध्य जीबीपी समाधान प्रत्येक के 20 μl। एक मुहरबंद लिफाफे के साथ एक पेट्री डिश में 24 घंटे के लिए 5 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की दुकान।
      4. नमूनों में तीन बार कुल्लाआरटी पर पोटेशियम फॉस्फेट बफर समाधान।
      5. 5 कदम आगे बढ़ना।
    3. डिजाइन 3 नमूने तैयार:
      1. 7.4 की एक अंतिम पीएच के साथ TRIS EDTA के बफर का उपयोग कर एक माइक्रोन की एक एकाग्रता के लिए डोपामाइन aptamer बाध्यकारी (यूके), समाधान पतला।
      2. एक विश्लेषणात्मक संतुलन पर डोपामाइन पाउडर मापने और 5 मिनट के लिए एक हलचल मनका के साथ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में यह मिश्रण से एक 5 माइक्रोन एकाग्रता के लिए एक डोपामाइन समाधान तैयार है।
      3. प्रत्येक सब्सट्रेट की सतह पर डीबीए समाधान की एक 20 μl ड्रॉप जमा और नमूने पेट्री डिश पर एक कवर के साथ आरटी पर 1 घंटे के लिए बैठते हैं।
      4. नमूने एक पोटेशियम फॉस्फेट बफर में तीन बार (कश्मीर 2 HPO 4, 25 मिमी, पीएच 7.5) कुल्ला।
      5. ईमानदार एक cleanroom ग्रेड के शीर्ष पर नमूने रखें सब्सट्रेट के सामने की ओर एक फिल्म बनाए रखते हुए पीठ सुखाने के लिए पोंछे। एक नियंत्रण के रूप में एक तरफ एक नमूना सेट करें।
      6. डोपामाइन समाधान ओ के 5 μl बूंद रखेंएन वांछित डोपामाइन सांद्रता के साथ शेष नमूनों पर पीबीएस बफर समाधान के मौजूदा बूंद की सतह। 10 मिनट के लिए नमूना सेते हैं।
      7. Aptamer बिना एयू पैड सतह पर डोपामाइन समाधान की एक बूंद रखें। 10 मिनट के लिए सेते हैं।
      8. पोटेशियम फॉस्फेट बफर समाधान में 3 बार नमूने कुल्ला।

    5. रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी

    1. लेजर जोखिम से वाष्पीकरण से बचने के लिए एक पानी के सबूत कक्ष में प्रत्येक नमूने रखें।
      1. गिलास स्लाइड पर रासायनिक निष्क्रिय उच्च वैक्यूम तेल, जगह के नमूनों के साथ एक प्लास्टिक सिरिंज भरें और नमूनों को छूने के बिना नमूने आसपास के तेल की कुछ मिलीमीटर बांटना।
      2. बफर वैक्यूम तेल के साथ संपर्क में आने की अनुमति के बिना substrates और coverslips के बीच एक पतली तरल इंटरफ़ेस बनाने, एक सील फार्म नीचे प्रेस धीरे substrates के शीर्ष पर एक खुर्दबीन coverslip जगह और।
    2. का प्रयोग एकऑप्टिकल रमन माइक्रोस्कोप प्रणाली, लेजर पर बदल के बिना जांचा जा करने के लिए धातु नैनो नमूनों क्षेत्र की सतह पर एक ध्यान प्राप्त करते हैं।
    3. 10x बढ़ाई के उद्देश्य से नमूना करने के लिए नुकसान को रोकने के लिए कम से कम 20 सेकंड की कुल अवधि के साथ 2.4-3.1 मेगावाट के बीच एक लेजर तीव्रता के साथ रमन नमूना 18,19 प्रदर्शन करते हैं। तालिका 1 में संकेत के रूप में। उत्तेजना तरंग दैर्ध्य का उपयोग करते हुए डिजाइन 1, 2, और 3 से नमूने के लिए रमन स्पेक्ट्रा मोल भी प्रोटीन ए, ब्रिटिश पाउंड, और ग्लूकोज़, और डोपामाइन पाउडर के लिए धातु के बिना गिलास स्लाइड को रोजगार के समाधान के लिए नियंत्रण रमन स्पेक्ट्रा के अधिग्रहण के रूप में nanostructures तुलना के लिए समर्थन करता है।

Representative Results

समाधान में मुफ्त प्रोटीन और धातु युक्त substrates के प्रयोग के बिना समाधान में या पाउडर के रूप में मुक्त ligands के सहित, मुख्य घटकों के लिए नियंत्रण रमन स्पेक्ट्रा एकत्रित, व्याख्या उद्देश्यों के लिए है और साथ ही एक उचित तुलना सक्षम करने के लिए महत्वपूर्ण है। चित्रा 5A एक ठेठ रमन प्रस्तुत करता है nanostructured substrates के बिना एक गिलास स्लाइड पर डि पानी में मुफ्त प्रोटीन एक के लिए स्पेक्ट्रम। उच्चतम रमन तीव्रता के साथ दो बैंड, 2931 सेमी में बैंड -1 और 1091 सेमी -1, क्रमशः, दर्पण और सीएस बांड को शामिल कंपन के अनुरूप हैं। 563 सेमी -1, 1450 सेमी -1, 1653 सेमी -1 और 2426 सेमी -1 के रूप में इस तरह के एक कम रमन तीव्रता के साथ अन्य बैंड, कंपन मोड 18,32,33,34 के एक superposition के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। तीन अलग अलग सांद्रता, 0.3, 0.9 और 1.3 मिमी के साथ बफर समाधान में ligand मुक्त GPB के लिए नियंत्रण रमन स्पेक्ट्रा, चित्रा 5 ब में दिखाए जाते हैं। टी में वह 2935 सेमी में बैंड, जबकि विलायक से 35 ब्रॉड बैंड के आसपास 3400 सेमी -1 मेल खाती है, आंकड़ा -1 32,33। चित्रा 5C में ग्लूकोज़ के लिए उच्च तरंगदैर्ध्य रमन स्पेक्ट्रम से पता चलता है प्रोटीन का दर्पण बांड को शामिल कंपन का प्रतिनिधित्व करता है 1, 6, 100, 200, और 400 मिमी: अलग सांद्रता के लिए बफर समाधान। ग्लूकोज की एकाग्रता बढ़ जाती है, तो दर्पण बांड कंपन बैंड 2890 सेमी -1 और 2960 सेमी -1 में उत्पन्न होती हैं। दोनों 532 एनएम और 780 एनएम उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के साथ प्राप्त क्रिस्टल के रूप में डोपामाइन का नियंत्रण रमन स्पेक्ट्रा चित्रा 5D में दिखाए जाते हैं। रमन स्पेक्ट्रम की ज्यादातर झुकने और अणु 19,36 के सीएच बंधन हिस्सों बेंजीन रिंग से आता है। लगभग 3,000 सेमी -1 में बैंड के कुछ ही 532 एनएम पर मनाया नहीं बल्कि 780 एनएम उत्तेजना तरंगदैर्ध्य कर रहे हैं।

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डि पानी में प्रोटीन एक चित्रा 5. नियंत्रण रमन स्पेक्ट्रम 532 एनएम उत्तेजना तरंगदैर्ध्य 18 (ए) में प्राप्त; बफर समाधान में ligand मुक्त ग्लूकोज बाध्यकारी प्रोटीन की रमन स्पेक्ट्रा 532 एनएम उत्तेजना तरंगदैर्ध्य (बी) पर प्राप्त; बफर समाधान में ग्लूकोज़ की रमन स्पेक्ट्रा 532 एनएम उत्तेजना तरंगदैर्ध्य (सी) में प्राप्त; और डोपामाइन पाउडर के स्पेक्ट्रा 532 एनएम और 780 एनएम उत्तेजना तरंग दैर्ध्य 19 (डी) में प्राप्त की। सभी स्पेक्ट्रा नियमित रूप से समाधान की रमन स्पेक्ट्रा nanostructured substrates के बिना गिलास स्लाइड पर (ए, बी, सी) और पाउडर (डी) कर रहे हैं। (डी) में, विभिन्न आणविक कंपन करने के लिए रमन पारी सरकारों का काम कहीं और 19 विस्तृत रूप में जनरल परमाणु और आण्विक संरचना इलेक्ट्रॉनिक प्रणाली (GAMESS) 30 और MacMolPlt 31 सॉफ्टवेयर का उपयोग किया गया था। 18 Americ से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित पैनल (एक)एक वैक्यूम सोसायटी। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

1-3 चरणों में वर्णित के रूप में सतह immobilized biomolecules के लिए SERS स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए आदेश में, जुड़े सिलिका का समर्थन करता है पर धातु के nanostructures शामिल substrates के गढ़े हैं। गढ़े substrates की गुणवत्ता स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) का उपयोग करते हुए नजर रखी है। मानक SEM के प्रक्रियाओं कहीं और 16,17,18, 19 में वर्णित है और वर्तमान प्रोटोकॉल में शामिल नहीं हैं। 6 प्रतिनिधि SEM के Au और एजी नैनो डॉट्स और संरचनाओं (पैनलों विज्ञापन) जैसे नैनो षट्भुज की छवियों, साथ ही गैर रूप से पता चलता है -structured Au और एजी पैड (क्रमशः पैनलों ई और एफ)। अगले कदम जैविक 1 टेबल में सूचीबद्ध तीन डिजाइनों को रोजगार नैनो संरचित substrates पर सामग्री, और उनके SERS स्पेक्ट्रा के अधिग्रहण के स्थिरीकरण शामिल है। मैं नहीं रमन इमेजिंग के दौरान एक जलीय वातावरण बनाए रखने के लिए rder, प्रत्येक नमूने अपनी इसी घोल में रख दिया गया है 7 चित्रा में सचित्र के रूप में एक पतली गिलास को कवर के साथ छाया हुआ है, और सील, (1 टेबल देखें)।

चित्रा 6
चित्रा 6 स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (SEM) SERS substrates के रूप में कार्यरत 10 एनएम मोटी Au और एजी सतह nanostructures की छवियों: (ए, बी) nanodots की सरणियों; (सी, डी) नैनो hexagons के सरणियों; (ई, एफ) असंरचित पैड। एजी संरचनाओं (दाएं) के साथ substrates एफएस पर एक 10 एनएम मोटी नी कोटिंग का उपयोग जबकि एयू संरचनाओं के साथ substrates (बाएं), एफएस का समर्थन करता है रोजगार। कहीं और 16,17,18 वर्णित के रूप में छवियों को प्राप्त किया गया।पीजी "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
चित्रा समाधान में जैव क्रियाशील नमूनों की रमन इमेजिंग के लिए पानी के सबूत चैंबर के 7. योजना।

डिजाइन एक में, पुनः संयोजक प्रोटीन एक डि पानी 18 में 11-mercaptodecanoic एसिड (MUA) के एक आत्म इकट्ठे monolayer के द्वारा functionalized substrates पर स्थिर है। इस डिजाइन में substrates के एक 50 एनएम पिच और जुड़े सिलिका पर बदलती अंतर-डॉट दूरी (आंकड़े 6A और 8 देखें) के साथ Au डॉट्स की तीन सरणियों शामिल। प्रोटीन स्थिरीकरण की प्रक्रिया substrates पर एक एसएएम के गठन के साथ शुरू होता है। सैम और प्रोटीन के बीच बाध्यकारी सहसंयोजक प्राप्त करने के लिए, Sams के कार्बोक्जिलिक एसिड समूहों एन के एक मिश्रण के साथ इलाज के द्वारा एमाइन प्रतिक्रियाशील एनएचएस एस्टर के रूप में तब्दील कर रहे हैं एन '- (3- (dimethylamino) propyl) carbodiimide (ईडीसी) समाधान और डि पानी में एन -hydroxysuccinimide (एनएचएस) समाधान। प्रोटीन एक के स्थिरीकरण प्रोटीन 37 की लाइसिन अवशेषों से एन एच एस समूह के विस्थापन से उत्पन्न होती है। एयू के nanostructures पर स्थिर प्रोटीन एक साथ डिजाइन एक के लिए इमेजिंग के नमूने का एक उदाहरण चित्र 9 में दिखाया गया है। (देखें चित्र 9A विभिन्न अंतर-डॉट अंतराल के साथ जैव क्रियाशील एयू nanodots के तीन सरणियों शामिल है जो नमूने, के एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप छवि प्रस्तुत करता है यह भी 3AA और 8) के आंकड़े, और चित्रा 9B इन सरणियों से अधिक रमन वर्णक्रमीय मैपिंग से पता चलता है। यह उच्चतम रमन तीव्रता ऐरे कम तीव्रता व्यापक अंतर-डॉट के अंतराल के साथ सरणी III के लिए प्राप्त कर रहे हैं, जबकि अंतर-डॉट अंतराल, सबसेसंकरेमें हैं जहां मैं के लिए पाए जाते हैं कि देखा जा सकता है। इस उच्च बिजली धिक द्वारा उत्पादित एक मजबूत plasmon युग्मन प्रभाव से समझाया जा सकता हैडॉट्स के बीच संकीर्ण रिक्त स्थान में LDS 18। चित्रा 9C सारणियों मैं और द्वितीय के लिए प्राप्त की सबसे मजबूत SERS स्पेक्ट्रा से पता चलता है। स्पेक्ट्रा चित्रा 5A में देखा समाधान में मुफ्त प्रोटीन एक की रमन मोड से निकटता में कई बैंड (1630 सेमी -1, 1964 सेमी -1, 2280 सेमी -1, 2577 सेमी -1, और 2916 सेमी -1) दिखा रहे हैं। प्रोटीन में पाया विभिन्न बांड की कंपन के कारण, इन बैंड दोनों स्थिर प्रोटीन में इसी तरह के स्थानों पर और समाधान में दिखाई देते हैं, या स्थिर जब थोड़ा कुछ अधिक wavenumbers करने के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं या तो। इसके विपरीत, प्रोटीन के बिना MUA सैम द्वारा functionalized समान nanostructured substrates के SERS स्पेक्ट्रा कि 9 चित्रा की पुष्टि की, जो पूरी तरह से अलग पैटर्न 18 दिखाने सतह immobilized प्रोटीन ए के SERS मानचित्रण का प्रतिनिधित्व करता है एक देखने के लिए यहां क्लिक करें इस आंकड़े का बड़ा संस्करण।

आंकड़ा 8
चित्रा डिजाइन एक 18 में इस्तेमाल किया एफएस सब्सट्रेट पर एयू nanodots के तीन सरणियों 8. SEM छवियों। सरणियों वही 50 एनएम पिच और अंतर-डॉट अंतराल के विभिन्न चौड़ाई में जिसके परिणामस्वरूप थोड़ा अलग डॉट त्रिज्या है। इस तीन सरणियों के लिए PMMA मास्क का उत्पादन करने के लिए विभिन्न EBL जोखिम खुराक लगाने से हासिल की है (1 टेबल देखें)। उच्च जोखिम खुराक धातुरूप और liftoff के बाद बड़े एयू डॉट आकार के लिए अनुमति देता है, PMMA, मास्क में व्यापक छेद में परिणाम। 18 अमेरिकी वैक्यूम सोसायटी से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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डिजाइन एक 18 में सब्सट्रेट-स्थिर प्रोटीन एक चित्रा 9. SERS इमेजिंग। एक जुड़े सिलिका सब्सट्रेट पर 50 एनएम पिच और विभिन्न अंतर-डॉट अंतराल के साथ Au nanodots के तीन सरणियों शामिल (ए) का नमूना ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप छवि, (यह भी देखें चित्रा 6), जैव क्रियाशील चित्रा 3A में दिखाया गया है। (बी) नमूने के रमन मानचित्रण। डॉट ऐरे मैं और द्वितीय से (सी) के SERS स्पेक्ट्रा। पैनल (बी) में, ऊर्ध्वाधर अक्ष सब्सट्रेट भर दूरी, क्षैतिज अक्ष रमन पारी का प्रतिनिधित्व करता है का प्रतिनिधित्व करता है, और कथा बार रमन तीव्रता इंगित करता है। कार्यक्षेत्र पैनल में पैनल में लाइनें (बी) और (सी) और समाधान में मुफ्त प्रोटीन एक के बेंचमार्क रमन बैंड का प्रतिनिधित्व करते हैं (*) धराशायी (सी) ऐरे आई रमन स्पेक्ट्रा से SERS बैंड इंगित करता है 532 एनएम उत्तेजना प्राप्त किया गयातरंगदैर्ध्य। 18 अमेरिकी वैक्यूम सोसायटी से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

डिजाइन 2 में, पुनः संयोजक ग्लूकोज बाध्यकारी प्रोटीन (GBP) के 21 ग्लूकोज़ (ligand के) के साथ complexed पोटेशियम फॉस्फेट बफर समाधान में उपयुक्त substrates पर स्थिर है। स्थिर ligand के मुक्त जीबीपी के साथ नमूने भी तुलना के लिए तैयार कर रहे हैं। इस डिजाइन में, ग्लूकोज बाध्यकारी प्रोटीन महान धातु से 6 अच्छी तरह से नी के लिए नहीं बल्कि बांधता है जो एक हिस्टडीन टैग, के माध्यम से सतह से जुड़ी है। Substrates के नी-लेपित एफएस पर एजी की सरणियों नैनो डॉट्स, नैनो hexagons, और असंरचित एजी पैड शामिल चूंकि (आंकड़े 6B, 6D, और 6F, क्रमशः), एक स्थिर प्रोटीन अणुओं के अधिकांश के बीच अंतराल में स्थित होने की उम्मीद कर सकते हैं नी कोटिंग ए वी है जहां एजी nanostructuresailable। रमन स्पेक्ट्रा के लिए प्राप्त स्थिर ग्लूकोज मुक्त और ग्लूकोज बाध्य जीबीपी क्रमशः आंकड़े 10A और 10B, में दिखाए जाते हैं। इन सभी स्पेक्ट्रा प्रदर्शनी बफर समाधान 35 से मेल खाती है, जो एक व्यापक बैंड पर लगभग 3300 सेमी -1,। एक असंरचित एजी पैड के साथ प्राप्त स्पेक्ट्रा केवल इस एक बैंड होते हैं और उम्मीद के रूप में स्थिर प्रोटीन एजी सतह पर नहीं मिला है, पुष्टि है कि किसी भी प्रोटीन कंपन मोड नहीं दिखाते। इसके विपरीत, स्पेक्ट्रा विश्लेष्य 32,33 का प्रतिनिधित्व करते हैं, जो 1550 सेमी -1 और 2900 सेमी -1 के आसपास एजी नैनो डॉट्स और नैनो hexagons प्रदर्शनी बैंड की सरणियों, साथ प्राप्त की। विशेष रूप से, ब्रॉड बैंड के आसपास 1550 सेमी -1, एमाइड द्वितीय बैंड के रूप में जाना जाता है, प्रोटीन 33,34 में बांड कंपन पेप्टाइड के कारण है। माना मामले में, इस बैंड एजी फीचर के बीच नी सतह पर स्थिर जीबीपी से कंपन मोड के एक superposition का प्रतिनिधित्व करता हैनैनो डॉट्स या नैनो hexagons युक्त substrates के लिए उपयोग किया जाता है जब, और महान धातु nanostructures के आसपास के क्षेत्र में इन विधियों की SERS वृद्धि का संकेत है। इस बैंड बाध्यकारी प्रोटीन के लिए उपलब्ध नी सतह के बिना एजी पैड पर अनुपस्थित SERS संवर्धन (चित्रा 5 ब) और के अभाव में समाधान में प्रोटीन के लिए बहुत कमजोर है, लेकिन यह अच्छी तरह से प्रोटीन के लिए सुलभ कुछ नी सतह के साथ nanostructured substrates के लिए स्पष्ट है बाँधने के लिए। हालांकि, इससे भी ज्यादा महत्वपूर्ण वर्तमान अध्ययन के लिए अन्य, संकरा बैंड के चारों ओर लगभग 2900 सेमी -1 32,33 wibrations सीएच बंधन के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है कि कर रहे हैं। ग्लूकोज मुक्त जीबीपी के स्पेक्ट्रम 2933 सेमी -1 नैनो hexagons सब्सट्रेट (चित्रा 10A) के साथ एक समान तरंग दैर्ध्य में नैनो डॉट्स सब्सट्रेट, और एक कमजोर लेकिन प्रत्यक्ष बैंड के साथ में एक स्पष्ट बैंड से पता चलता है। ग्लूकोज मुक्त प्रोटीन के मामले से अलग, ग्लूकोज बाध्य जीबीपी की SERS स्पेक्ट्रा figu में दिखाया गया है 10B प्रदर्शनी 2850 सेमी -1 और 2910 सेमी -1 में, बॉन्ड कंपन शासनों चर्चा करने के लिए इसी दो बैंड फिर से। बैंड अच्छी तरह से नैनो hexagons सब्सट्रेट पर ग्लूकोज बाध्य जीबीपी के स्पेक्ट्रम में स्पष्ट कर रहे हैं, और वे भी नैनो डॉट्स सब्सट्रेट पर जीबीपी के स्पेक्ट्रम में देखा जा सकता है। 2850 सेमी में बैंड -1 अन्य बैंड जबकि (2910 सेमी में, 2890 सेमी करने के लिए काफी करीब -1 एक समाधान में ग्लूकोज़ से नियंत्रण रमन स्पेक्ट्रम में है, और इसलिए यह प्रोटीन के लिए बाध्य ग्लूकोज के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है -1) प्रोटीन और ग्लूकोज दोनों के सीएच बंधन कंपन के कारण है। एक ग्लूकोज मुक्त और ग्लूकोज बाध्य सब्सट्रेट-immobilized जीबीपी से SERS हस्ताक्षर के अंतर यह है कि निष्कर्ष निकाल सकते हैं कि इस क्षेत्र में मानने योग्य है, और प्रोटीन बाध्य ग्लूकोज का दर्पण बंधन कंपन वर्णित डिजाइन रोजगार detectable हैं।

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Ligand-मुक्त (ए) और डिजाइन 2 में तीन अलग अलग substrates पर स्थिर। स्पेक्ट्रा 780 एनएम उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के साथ प्राप्त किया गया ligand-बाउंड (बी) ग्लूकोज बाध्यकारी प्रोटीन। चित्रा 10 SERS स्पेक्ट्रा एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें इस आंकड़े की।

डिजाइन 3 में, thiol समाप्ति 23 के साथ अनुकूलित डोपामाइन बाध्यकारी aptamer (यूके) Tris में सब्सट्रेट (hydroxymethyl) aminomethane (TRIS) ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) बफर समाधान पर स्थिर है, और डोपामाइन तो स्थिर aptamer 19 के लिए बाध्य है। इस डिजाइन के लिए substrates एफएस (चित्रा 6C) पर एयू नैनो hexagons के सरणियों होते हैं। असंरचित एयू पैड (चित्रा 6E) भी नियंत्रण प्रयोजनों के लिए उपयोग किया जाता है। डीएनए आंतरिक रूप से फ्लोरोसेंट है के बाद से 38, 780 एनएम उत्तेजना waveleng वें इस पहलू को कम करने के लिए डिजाइन 3 में प्रयोग किया जाता है। डोपामाइन इस क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण रमन गतिविधि से पता चलता है, जबकि इस डिजाइन में, मान्यता तत्व (aptamer), चित्रा 11 में माना रमन पारियों के क्षेत्र में सक्रिय रमन नहीं है। स्थिर aptamer बिना ही डोपामाइन उजागर करने के लिए नमूनों से संकेत कोई परिणामी डोपामाइन बैंड 19 से पता चलता है के बाद से, मनाया SERS बैंड 11 चित्रा। Aptamer बाध्य डोपामाइन से ही शुरू होने की उम्मीद से पहले और बाद इसके अलावा सोने के nanostructures पर स्थिर aptamer के SERS स्पेक्ट्रा तुलना कर रहे हैं डोपामाइन। जैसी कि उम्मीद थी, स्थिर डोपामाइन मुक्त aptamer रमन बैंड प्रदर्शन नहीं करता है। इसके विपरीत, स्पष्ट रमन बैंड के एक नंबर डोपामाइन बाध्य स्थिर aptamer के लिए मनाया जाता है। 11 चित्रा में सबसे बैंड के पदों के आयाम में मतभेद के साथ यद्यपि, क्रिस्टलीय डोपामाइन में उन लोगों के लिए बंद कर रहे हैं।

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के लिए ligand-मुक्त (बैंगनी लाइन) और ligand-बाउंड (नीली रेखा) डोपामाइन बाध्यकारी डिजाइन में एयू नैनो षट्भुज substrates पर स्थिर aptamer 3 19। लाल रेखा डोपामाइन पाउडर के एक नियंत्रण SERS स्पेक्ट्रम को दर्शाता है। चित्रा 11. SERS स्पेक्ट्रा करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

SERS कई अद्वितीय फायदे की पेशकश जैव का पता लगाने के एक अत्यंत शक्तिशाली तकनीक के रूप में एक मान्यता प्राप्त कर रहा है। अत्यंत उच्च संवेदनशीलता विश्लेष्य 9,10,11,35 की बहुत थोड़ी मात्रा का पता लगाने के लिए यह संभव बनाता है, जबकि आणविक कंपन के साथ संबंध चुनिंदा SERS स्पेक्ट्रा से विशिष्ट analytes की "उंगलियों के निशान" की पहचान करने की अनुमति देता है। इसके अलावा, SERS भी पानी के लिए अपेक्षाकृत असंवेदनशील है कि एक nondestructive तकनीक है, और इस तरह यह बहुत अच्छी तरह से उनके प्राकृतिक जलीय पर्यावरण 9 में जैविक सामग्री की जांच के लिए अनुकूल है। प्रस्तुत परिणाम इन फायदों के साथ ही आगे जैव पता लगाने के लिए एक बहुत ही लचीला लेबल से मुक्त तकनीक के रूप में SERS की मजबूत क्षमता प्रदर्शित जोर। अलग सब्सट्रेट-immobilized biomolecules के monolayers के रोजगार तीन डिजाइनों में, रमन मोड आत्मविश्वास से विशेष analytes के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है कि खोजा गया है। यही कारण है कि इन biomolecules, का पता लगाने के ओआर उनके संबंधित ligands, SERS substrates के लिए समर्थन के रूप में जुड़े सिलिका की तलीय सतहों को रोजगार का प्रदर्शन किया गया है, इलेक्ट्रॉनिक की सतहों के साथ जैविक सामग्री interfacing जैव इलेक्ट्रॉनिक आर्किटेक्चर उभरते के साथ संबंध में अनेक अनुप्रयोगों का वादा किया है, वर्तमान इलेक्ट्रॉनिक्स और microfluidics सेटिंग्स के साथ संगत डिजाइन बनाता है और विद्युत उपकरणों 2,3। महत्वपूर्ण बात है, दो तीन के डिजाइनों में SERS पता लगाने मान्यता तत्व के रूप में, इस तरह के ग्लूकोज और डोपामाइन, क्रमशः सतह immobilized प्रोटीन और aptamer के monolayers के रोजगार के रूप में छोटे अणुओं की विशिष्ट बंधनकारी के लिए प्रदर्शन किया गया है।

हालांकि, कई पहलुओं "पर चिप" सेटिंग में एक कुशल SERS जैव-खोज को प्राप्त करने के क्रम में ध्यान रखा जाना चाहिए। सबसे पहले, सबसे biomolecules के लिए आम है कि एक जाने-माने चुनौती ऐसे शुष्क पर्यावरण के रूप में गैर प्राकृतिक परिस्थितियों से अवगत कराया है, खासकर जब नीचा करने के लिए उनकी प्रवृत्ति हैपर्यावरण या तीव्र प्रकाश लेजर। प्रोटोकॉल के दौरान, हम हमेशा रमन स्पेक्ट्रा का अधिग्रहण करने के लिए नमूनों की तैयारी से पूरे प्रयोग के दौरान उचित समाधान में डूबे जैव क्रियाशील नमूने रखने के महत्व पर जोर दिया है। बाद के लिए, एक कस्टम पानी के सबूत चैम्बर लेजर जोखिम के दौरान तरल के वाष्पीकरण से बचने के लिए (चित्रा 7) बनाया गया है। नमूनों की क्षति से बचने के लिए प्रोटोकॉल के कदम 5.3 में वर्णित के रूप में जोखिम और लेजर तीव्रता की अवधि भी सीमित किया जाना चाहिए।

SERS का पता लगाने के परिणामों कार्यरत सब्सट्रेट, और धातु nanostructures की विशेष रूप से अंतर-सुविधा जुदाई की ज्यामिति के प्रति संवेदनशील पाए जाते हैं। यह आंकड़े 8 और 9 से इस प्रकार के रूप में, डिजाइन एक नमूनों की SERS तीव्रता जुड़े सिलिका पर एयू नैनो डॉट्स के बीच अंतराल की चौड़ाई पर दृढ़ता से निर्भर करता है। एयू nanodots से बाहर के तीन सरणियों मैं परीक्षण कियाn इस डिजाइन (चित्रा 8), उच्चतम रमन तीव्रता एयू सुविधाओं के बीच सबसेसंकरेमें अंतराल है और इसलिए इसे और अधिक कुशल विद्युत चुम्बकीय क्षेत्र वृद्धि प्रदान करता है जो ऐरे मैं, साथ हासिल की है। 9 चित्रा रूप में दिखाता है, 10-20 एनएम या उससे कम के स्तर पर अंतर-सुविधा separations के नियंत्रण की आवश्यकता है। SERS substrates, fabricating के लिए EBL रोजगार, यहां प्रदर्शन के रूप में, अंतर-सुविधा अंतराल की चौड़ाई को नियंत्रित करने के लिए विशेष रूप से एक कुशल संकल्प प्रदान करता है। एक सकारात्मक टोन EBL साथ PMMA के रूप में इस तरह के विरोध, PMMA, मास्क में छेद के आकार बस जोखिम खुराक बदलने के द्वारा अलग किया जा सकता है। लिफ्ट बंद करने के बाद इस गढ़े धातु डॉट्स के विभिन्न आकारों में यह परिणाम है, और 18 खुराक उचित EBL लोगों तक पहुंचाने का चयन करके वांछित के रूप में डॉट्स के बीच अंतराल की चौड़ाई देखते जा सकता है।

अन्य चुनौती विशिष्ट जैव-खोज आवेदन के लिए SERS सब्सट्रेट ज्यामिति का अनुकूलन है। वृद्धि प्रभाव मैं यद्यपिअंतर-सुविधा अंतराल की कमी के साथ ncreases, जैविक अणुओं के अपेक्षाकृत बड़े आकार के अंतराल हो सकता है कि कैसे संकीर्ण पर सीमाओं लगाता है। इस पर नहीं डॉट्स खुद को (3B चित्रा देखें), स्थिरीकरण विधि प्रोटीन कुशलता से केवल महान धातु डॉट्स के बीच सतह को बांधता है कि इस तरह की है, जहां डिजाइन 2, के लिए परिणाम से स्पष्ट है। यह आंकड़ा 10 से इस प्रकार के रूप में, असंरचित एजी पैड के लिए SERS स्पेक्ट्रा विश्लेष्य से किसी भी बैंड नहीं दिखाते। पैड बहुत पतली अंतर-द्वीप अंतराल के साथ एक नैनो क्रिस्टलीय संरचना का प्रदर्शन हालांकि इन कमियों एक प्रोटीन अणु को समायोजित करने के लिए बहुत संकीर्ण हैं (चित्रा 6F देखें)। फिर भी जटिलता का एक और आयाम प्रोटीन ligand के बंधन का पता लगाया जाना है जब जोड़ा गया है। चित्रा 10 में, SERS सीएच बैंड परिकल्पित जीबीपी रचना में परिवर्तन के द्वारा समझाया जा सकता है, जो लिगेंड से मुक्त एक में से ligand बाध्य जीबीपी से स्पेक्ट्रा में और अधिक स्पष्ट कर रहे हैं, ग्लूकोज़ दो 7,27 के बंधन में वृद्धि हुई रमन गतिविधि के साथ एक और अधिक कठोर संरचना में जिसके परिणामस्वरूप पर। एक दो nanostructured substrates के ligand के मुक्त प्रोटीन से सीएच बैंड ligand बाध्य प्रोटीन से प्रोटीन और ग्लूकोज सीएच बैंड दोनों नैनो hexagons के साथ और अधिक स्पष्ट कर रहे हैं, जबकि नैनो डॉट्स सब्सट्रेट के साथ प्राप्त SERS स्पेक्ट्रा में मजबूत है तुलना तो सब्सट्रेट। दो कारकों इन मतभेदों में कमी की उम्मीद कर रहे हैं, एजी के बीच की जगह की उपलब्धता जीबीपी नी करने के लिए बाध्य कर सकता है, जहां सुविधाएँ, और 'हॉट स्पॉट' में बिखरने रमन के विद्युत चुम्बकीय वृद्धि करने के लिए ligand के समयबद्ध और ligand मुक्त प्रोटीन की संवेदनशीलता इन सुविधाओं के बीच। एक तरफ, नैनो डॉट्स पैटर्न प्रोटीन एजी नैनो डॉट्स सब्सट्रेट पर ग्लूकोज मुक्त जीबीपी के लिए मनाया एक और अधिक स्पष्ट सीएच बैंड समझा जा सकता है, जो बाँध के लिए के लिए नी कोटिंग उपलब्ध है, जहां एक अपेक्षाकृत बड़ा अंतर-सुविधा क्षेत्र प्रदान करता है। दूसरी ओर, उनके गैर वर्दी struc कारणसंरचना (चित्रा 6D देखें), एजी नैनो hexagons नैनो hexagons सब्सट्रेट पर ग्लूकोज बाध्य जीबीपी से मजबूत सीएच कंपन बैंड में जिसके परिणामस्वरूप नैनो hexagons भीतर एजी द्वीपों के बीच संकीर्ण अंतराल में एक मजबूत विद्युत चुम्बकीय वृद्धि दिखाने के लिए खतरा हो सकता है। इस परस्पर क्रिया के कुछ विवरण आगे सत्यापन की आवश्यकता होती है, और इस तरह के जीबीपी के रूप में बड़े प्रोटीन को शामिल जटिल analytes के लिए SERS substrates के अनुकूलन पाइपलाइन में अब भी है।

अन्य घटकों नहीं कर रहे हैं, जबकि केवल ligand के एक चयनित क्षेत्र में सक्रिय रमन, जब जाहिर है, एक मान्यता तत्व के रूप में immobilized biomolecules रोजगार बाध्यकारी ligand के SERS का पता लगाने में मदद की है। इस aptamer बाध्य डोपामाइन का स्पष्ट SERS बैंड प्राप्त कर रहे हैं, जहां डिजाइन 3, (चित्रा 11) का मामला है। aptamer-डोपामाइन जोड़ी उत्कृष्ट विशिष्टता दर्शाती है और SERS स्पेक्ट्रम किसी भी महत्वपूर्ण पृष्ठभूमि संकेत बिना स्पष्ट बैंड शामिल हैं।

11,12,13 "नीचे से ऊपर" वैकल्पिक रोजगार निर्मित कर रहे हैं जब इस का एक व्यापक विविधता के लिए इष्टतम सब्सट्रेट डिजाइन का एक विश्वसनीय पहचान की ओर धातु nanostructure के आकार और स्थिति का एक बेहतर नियंत्रण के लिए अनुमति देता है, reproducibility के प्रमुख चुनौती का पता होता एप्लीकेशन। इन तकनीकों के scalability बाद में इस तरह के नैनो के रूप में पूरक नैनोलिथोग्राफी तरीकों के साथ EBL संयोजन से सुधार किया जा सकता हैnanoscale के डिजाइन के भविष्य के बड़े पैमाने पर उत्पादन की ओर छाप लिथोग्राफी 19 ट्यून करने योग्य EBL तकनीक काम अनुकूलित।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
11-Mercaptoundecanoic acid (MUA) Sigma Aldrich 450561  ALDRICH Used for surface functionalization in Design 1
Conductive polymer Mitsubishi Rayon aquaSAVE-57xs A 70 nm thick layer is used as anti-charging coating for EBL exposures
D-glucose Collaborator Lab. Ligand in Design 2
Dopamine Collaborator Lab. Ligand in Design 3
Dopamine binding aptamer (DBA) Integrated DNA Technologies Inc. 5'- /Thiol Modifier C6 S-S/ AAAAAAAAAA GTCTCTGTGT GCGCCAGAGA ACACTGGGGC AGATATGGGC CAGCACAGAA TGAGGCCC-3'  Biopolymer in Design 3
Fused silica wafers Mark Optics
Glucose binding protein (GBP) Collaborator Lab. PDB ID 2HPH Biopolymer in Design 2
High vacuum grease Dow Corning Used to seal water-proof chamber
Hydrogen Peroxide 30%, H2O2 J.T. Baker Used for pirahna solution
N-ethyl-N'-(3-(dimethylamino) propyl) carbodiimide (EDC) Sigma Aldrich 03450 FLUKA Used for immobilization of biopolymer in Design 1
N-Hydroxysuccinimide (NHS) Sigma Aldrich 130672 ALDRICH Used for immobilization of biopolymer in Design 1
Potassium phosphate buffer Collaborator Lab. Buffer used in Raman sampling
Phosphate buffered  saline (PBS) Collaborator Lab. Solvent in Design 3
Polymethylmethacrylate (PMMA) 950 A2 MicroChem  A 90 nm thick layer is used as EBL positive tone resist
Recombinant protein A Protein Mods Inc PDB ID 1BDD Biopolymer in Design 1
Sulfuric acid 96%, H2SO4 J.T. Baker Used for pirahna solution
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS) and ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) buffer Sigma Aldrich T9285 SIGMA Buffer in Design 3
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Equipment
Name Company Catalog Number Comments
Dicing saw Diamond Touch Technology Inc.
(17301 W Colfax Ave # 152, Golden, CO)
Used to cut FS wafer
Electron beam evaporator Kurt J. Lesker Used for Au and Ag evaporation
Electron beam evaporator Johnsen Ultravac (JUV) JuV E-gun Used for Ni evaporation
Microscope cover slips (25 mm) Fisher Scientific 12-545-102 Used in water-proof chamber
Microscope slides (3×1 in.) Fisher Scientific Used in water-proof chamber
Raith 150TWO EBL exposure system Raith Inc. Raith 150TWO  system Used for EBL exposures
Raman microscope Thermo Scientific Nicolet Almega XR Used for Raman spectroscopy
Sonicator system Branson Used for liftoff and solutions mixing
Spinner Brewer Spinner and Hotplate Cee 200X and Cee 1300X Used to spin-coat PMMA and conductive polymer

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References

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भूतल EBL गढ़े Nanostructured Substrates का प्रयोग biomolecules की रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी जांच बढ़ी
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Peters, R. F., Gutierrez-Rivera, L., Dew, S. K., Stepanova, M. Surface Enhanced Raman Spectroscopy Detection of Biomolecules Using EBL Fabricated Nanostructured Substrates. J. Vis. Exp. (97), e52712, doi:10.3791/52712 (2015).More

Peters, R. F., Gutierrez-Rivera, L., Dew, S. K., Stepanova, M. Surface Enhanced Raman Spectroscopy Detection of Biomolecules Using EBL Fabricated Nanostructured Substrates. J. Vis. Exp. (97), e52712, doi:10.3791/52712 (2015).

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