Protocol
1. Preparação de 3% de 2-Hidroxietil agarose
- Em uma, seco de 100 ml frasco de vidro limpo, adicionar 0,9 g de 2-hidroxietilo de agarose (agarose VII), seguido por 30 ml de água destilada.
- Micro-ondas a mistura durante 15 seg e agitar suavemente. Repita este passo pelo menos mais três vezes até que o pó se dissolve totalmente agarose.
- Autoclavar a garrafa contendo solução durante 15 min.
- Permitir que a solução de agarose a arrefecer até à temperatura ambiente antes de utilização posterior. Guardar a solução à TA.
2. Preparação da camada inferior: 0,6% do gel de agarose
- Pré-quente vários 5 ml e 10 ml pipetas num banho a 37 ° C para evitar a incubadora de agarose de solidificação na pipeta durante o manuseamento.
- Parcialmente soltar a tampa do frasco e microondas a 3% de solução de pré-fabricados de agarose a 2-hidroxietil durante 15 seg. Em seguida, agite suavemente a solução e microondas por mais 15 segundos. CUIDADO: Tenha cuidado quando agitando o agarosolução se porque a solução sobe quando exposto ao ar e pode transbordar.
- Se houver gel sólido residual no frasco, com microondas, durante mais alguns segundos.
- Manter o frasco contendo a solução de agarose, num banho de 45 ° C a água durante os próximos passos para impedir que a solução de agarose de solidificação prematura.
- Mídia MCF10DCIS quente em um banho de água a 37 ° C. Nota: meios MCF10DCIS consiste de DMEM / F12, 5% de soro de cavalo, 5% de penicilina estreptomicina.
- Transferência de 3 ml da solução de agarose a 3% utilizando as pipetas pré-aquecido para uma estéril tubo de 50 ml.
- Imediatamente adicione 12 ml de mídia MCF10DCIS quentes e inverter cuidadosamente o tubo cônico para misturar a agarose com a mídia. Tente não formam quaisquer bolhas que pode interferir com a contagem das colónias mais tarde.
- Adicionar cuidadosamente 2 ml desta mistura para cada poço de uma placa de cultura de 6 cavidades, sem formar quaisquer bolhas de ar.
- Incubar a placa de 6 poços de cultura horizontally sobre uma superfície plana, a 4 ° C durante 1 h para permitir que a mistura de solidificar.
- Após as mistura solidificar, colocar a placa numa incubadora a 37 ° C durante 30 min. A camada inferior é agora pronto para o uso.
3. Preparação da Camada contendo celular: 0,3% do gel de agarose
- Tripsinizar as células e dilui-los MCF10DCIS a uma concentração celular de 4 x 10 4 / ml.
- 2 ml de agarose a 3% usando pipetas pré-aquecida e transferir para um tubo de 50 mL estéril cónico.
- Imediatamente adicionar 8 ml de mídia MCF10DCIS para o tubo cônico e gentilmente inverter para misturar a agarose com a mídia. Evite a formação de bolhas.
- 2 ml de células MCF10DCIS (4 x 10 4 / ml) e trata-se com BB-CLA (0 uM (DMSO) ou 1 uM).
- Em uma diluição de 1: 1, misturar as células com agarose a 0,6%.
- Tomar 1 ml da mistura de células-agarose e adicionar suavemente sobre a camada de fundo da cultura de 6 poços ptardios (2 x 10 4 células / mL).
- Colocar a placa de cultura de 6 poços horizontalmente sobre uma superfície plana, a 4 ° C durante pelo menos 15 minutos para permitir que a camada superior solidificar.
- Após as mistura solidificar, colocar a placa num incubador a 37 ° C durante uma semana antes de se adicionar a camada de alimentação.
4. Preparação da Camada de alimentador: 0,3% do gel de agarose
- Microondas a 3% de 2-Hidroxietil solução de agarose pré-fabricados durante 15 seg. agite suavemente a solução e microondas por mais 15 segundos.
- Equilibrar o frasco de solução de agarose, num banho de água a 45 ° C.
- Aquecer os meios MCF10DCIS num banho de água a 37 ° C.
- Misture 1 ml de solução de agarose 3% com 9 ml de mídia MCF10DCIS quente em um tubo de 50 ml e gentilmente inverter para misturar a agarose com a mídia. Evite a formação de bolhas de ar.
- Tratar a mistura com BB-CLA (0 uM (DMSO) ou 1 uM).
- Suavemente adicionar 1 ml desta mistura (sem paraming bolhas) em cada poço da placa de cultura de 6 poços contendo o fundo e as camadas macias.
- Colocar a placa de cultura de 6 poços horizontalmente sobre uma superfície plana, a 4 ° C durante pelo menos 15 minutos para permitir que a mistura de solidificar.
- Após a camada alimentadora solidifica, colocar a placa num incubador de 37 ° C.
- Repetir este procedimento semanalmente alimentação sobrepondo 1 ml de solução de agarose / médio / tratamento de 0,3% para a camada de alimentação existente para repor as células com novos meios, até a formação de colónias é observado. Nota: Agar nas camadas moles e de alimentação é muito suave e, por conseguinte, os nutrientes adicionados a partir da camada de alimentação irá facilmente difundir-se na camada contendo as células para atingir as células.
5. Coleta de Dados
- Depois de 2,5 semanas de crescimento celular no agar mole, contar o número de colónias em cada poço usando um microscópio de luz. Para facilitar a quantificação, imprimir uma grade em uma transparência e anexar a grade para o6-poços para ajudar a localizar onde as células são, durante a contagem. Uma vez que o tamanho da colónia (como quantificado por o diâmetro de cada colónia) irá variar, predefinir um tamanho de colónias de referência para determinar quais as colónias serão marcados. Por exemplo, incluem dimensões das colónias de 70 mm ou maior na análise de dados.
- Armazenar as amostras a 4 ° C para evitar uma maior formação de colónias e de contagem futuro. Selar a placa de cultura de 6 poços com Parafilm para evitar que os géis de secar.
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Representative Results
O ensaio de formação de colónias em ágar mole pode ser utilizado para uma larga gama de aplicações que documentam a tumorigenicidade das células cancerosas. Uma importante vantagem desta técnica é que a matriz semi-sólida favorece selectivamente o crescimento de células que podem proliferar de uma forma independente de ancoragem. Esta característica é exibido principalmente por células cancerosas, mas não por células normais. Utilizamos esta técnica principalmente para testar a eficácia de inibição do crescimento do tumor por drogas e para testar o efeito de sobre-expressão ou esgotamento dos genes de interesse, incluindo os genes padi, na tumorigenicidade de células de cancro da mama. Aqui, nós avaliamos o efeito de BB-CLA na inibição de células tumorigenic MCF10DCIS-overexpressing PADI2 (Figura 1 e 2).
Os resultados demonstram que o BB-CLA inibe significativamente a formação de MCF10DCIS colónias derivadas de células. A Figura 3 mostra que, na presença de um inibidor de padi t, aqui foi uma redução tanto na formação de colónias e de colónias de tamanho, quando comparado com o controlo de DMSO. [Nota:. BB-CLA foi dissolvido em DMSO e, assim, DMSO foi usado como um controle] O tamanho de colónias para BB-CLA tratada MCF10DCIS células eram predominantemente dentro da gama de 20 a 100 um, enquanto o tamanho de colónias para o DMSO controlo exibiu uma maior gama de 70 a 150 um, após 2,5 semanas de crescimento.
As colónias maiores do que 70 um foram contados e analisados (Figura 4). Houve uma média de 3536 colónias no controlo de DMSO enquanto que apenas 1967 colónias foram observadas no grupo tratado com CLA-BB após 2,5 semanas de cultura em agar mole. Isto representa uma diminuição de 44% na formação média de colónias na presença de 1 uM BB-CLA, indicando uma inibição significativa tumorigénico de células de cancro da mama (células MCF10DCIS) pelo inibidor padi.
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Figura 1. Estrutura química de BB-CLA.
Figura 2. Diagrama esquemático Resumo do Protocolo para o Ensaio de Formação de Colónia agar mole. Cada poço das placas de cultura de 6 poços foi revestido primeiro com 0,6% de gel de agarose (camada inferior). Uma mistura de gel de agarose a 0,3% contendo as células MCF10DCIS e ou o inibidor de BB-CLA (1 uM) ou DMSO (controlo) foi em seguida mergulhada no topo do gel de 0,6%. Uma vez por semana, a mistura em gel de agarose 0,3% (contendo o BB-CLA) foi adicionado em cima da camada macia. Após 2 a 4 semanas, foi observada a formação de colónias e contou para análise de dados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. As imagens da formação de colónias em células tratadas MCF10DCIS-BB-CLA. MCF10DCIS células foram cultivadas em agar mole na presença (1 uM BB-CLA) ou ausência de BB-CLA (0 ^ M DMSO). Depois de 2,5 semanas, as colónias foram fotografadas usando um microscópio invertido para imagens de baixa ampliação e um microscópio de luz para imagens de alta ampliação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Quantificação do Número MCF10DCIS Colony após células BB-CLA tratamento. MCF10DCIS foram cultivadas em agar mole, em diferentes concentrações de BB-CLA (0 uM (DMSO), ou 1 uM BB-CLA). Depois de 2,5 semanas, colónias individuais maior thum 70 um foram contadas. As experiências foram repetidas quatro vezes (n = 4). A significância estatística da diferença total de contagem celular entre as amostras de controlo e de tratamento foi determinada pelo teste t de duas amostras de Student (* p <0,005).
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Discussion
A taxa de formação de colónias em agar mole varia dependendo do tipo de célula 9. Portanto, o número de células para iniciar com deve ser optimizado e ajustado em conformidade. Uma gama de partida sugerida é de entre 5 x10 2 a 1 x 10 4 culas por po numa placa de 6 poços. Além disso, o tamanho da colónia varia dependendo da taxa de crescimento de cada célula. Portanto, um pré-definido um limite para o tamanho da colónia é necessária para anotar colónias individuais para análises quantitativas a jusante. Aqui, as colónias maiores que 70 um foram quantificadas para evitar a inclusão de células não proliferantes derivados do plaqueamento inicial.
Para o crescimento óptimo, ao fazer os géis de agarose 3D, é aconselhável utilizar o mesmo meio de cultura celular normalmente usado para culturas de células em 2D. Isto é porque a alteração na forma muitas vezes altera a taxa de crescimento de células, necessitando assim passaging adicional para permitir que as células se adaptarem ao novo meio. Por exemplo, As células podem ser cultivadas MCF10DCIS optimamente em meio RPMI-1640, DMEM, ou meio DMEM / F12. No entanto, quando o meio de cultura é mudado MCF10DCIS de meio RPMI-1640 para DMEM / F12, há uma redução significativa na taxa de proliferação celular. Além disso, deve ser tomado cuidado para manter a concentração no soro a um nível constante, porque, sem soro, a formação de colónias 10 será inibida. Além disso, após a agarose é microondas, permitir que a garrafa se equilibrar em um banho de água a 45 C ° antes da mistura com meio contendo as células para evitar o sobreaquecimento das células. Dado que agarose solidifica rapidamente à temperatura ambiente, recomendamos também que todas as pipetas e placas de cultura de 6 poços são pré-aquecidos em um 37 ° C incubadora antes de adicionar solução de agarose para evitar a solidificação prematura durante o manuseio.
Enquanto a técnica de formação de colónias em agar mole é uma valiosa ferramenta para medir a tumorigenicidade numa variedade de linhas celulares de cancro, algumas linhas não crescem em agar mole. Anotseu potencial desvantagem do método é que as células viáveis não podem ser recuperados, uma vez que são plaqueadas em agar mole. Além disso, se um composto tem uma biodisponibilidade mais curto período, a etapa de alimentação deverá ser realizada com maior frequência (isto é, todos os outros dias) e as amostras terão de ser recolhidos em menos de sete dias. O limite para o tamanho da colônia também terão de ser reduzidos permitindo ainda para os potenciais diferenças entre as amostras a serem observados. Nesses casos, teriam de ser incorporadas para optimizar os parâmetros experimentais para minimizar resultados falso-positivos e falso-negativos controles. Além disso, esta técnica pode ser demorado e difícil ao testar um grande número de amostras. No entanto, os avanços tecnológicos têm ajudado a superar algumas destas limitações. O ensaio de agar mole convencional (conforme documentado neste manuscrito) geralmente usa placas de cultura de 6 poços ou placas de cultura de 6 milímetros. Com leitores de placas automatizados, no entanto, multiple as amostras podem ser processadas em placas de 384 poços 11. Por exemplo, os pesquisadores pré-carregado células tumorais com corantes como alamarBlue e corantes de tetrazólio e colônias são quantificados utilizando leitor de placas, eliminando assim a necessidade de contar manualmente número colônia 11. Esta capacidade de alta produtividade é, portanto, favorável para telas de drogas cancro grande escala.
Em resumo, o ensaio de agar mole é uma técnica de pré-clínico valioso que pode ser utilizado para avaliar a tumorigenicidade de um vasta gama de células de cancro (mama, próstata, ovário, e outros) em relação à sua sensibilidade aos medicamentos, hormonas, calor, hipóxia, e uma grande variedade de outras condições de tratamento. O ensaio continua a oferecer uma ferramenta simples e informativo para os pesquisadores de câncer que desejam entender melhor os mecanismos de progressão do câncer e testar o potencial anti-tumoral de novas terapias contra o câncer.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeiss Axiopot | Carl Zeiss Microscopy | 1021859251 | |
| Inverted Microscope | Olympus | CKX41 | |
| DMEM/F-12 | Lonza BioWhittaker | 12-719F | |
| HyClone Donor Equine Serum | Fisher Scientific | SH30074.03 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| 2-Hydroxyethylagarose: Type VII, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | 39346-81-1 |
References
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- Vossenaar, E. R., Zendman, A. J., van Venrooij, W. J., Pruijn, G. J. PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease. Bioessays. 25 (11), 1106-1118 (2003).
- Horibata, S., Coonrod, S. A., Cherrington, B. D. Role for peptidylarginine deiminase enzymes in disease and female reproduction. J Reprod Dev. 58 (3), 274-282 (2012).
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