Protocol
1. Preparazione del 3% 2-idrossietile Agarose
- In un secco bottiglia di vetro pulito, 100 ml, aggiungere 0,9 g di 2-idrossietile agarosio (Agarose VII) seguiti da 30 ml di acqua distillata.
- Forno a microonde la miscela per 15 secondi e delicatamente agitare. Ripetere questa operazione almeno altre tre volte fino a quando la polvere si dissolve completamente agarosio.
- Autoclave la bottiglia soluzione contenente per 15 min.
- Lasciare che la soluzione di agarosio raffreddare a RT prima di un ulteriore utilizzo. Conservare la soluzione a temperatura ambiente.
2. Preparazione dello strato inferiore: 0,6% agarosio gel
- Pre-warm vari 5 ml e 10 ml pipette a 37 ° C incubatore per impedire l'agarosio solidificazione nella pipetta durante la manipolazione.
- Parzialmente allentare il coperchio della bottiglia e forno a microonde il 3% soluzione di agarosio 2-idrossietile pre-made per 15 sec. Quindi, agitare delicatamente la soluzione e forno a microonde per altri 15 secondi. ATTENZIONE: Fare attenzione quando roteando il agarosoluzione se perché la soluzione si alza quando esposto all'aria e può traboccare.
- Se c'è gel solido residuo nella bottiglia, microonde per pochi secondi.
- Mantenere il flacone contenente la soluzione di agarosio in un bagno d'acqua a 45 ° durante le fasi successive per impedire la soluzione di agarosio solidificazione prematuramente.
- Supporti MCF10DCIS caldo in un bagno di 37 ° C Acque. Nota: MCF10DCIS supporto costituito da DMEM / F12, siero di cavallo 5%, 5% di penicillina streptomicina.
- Trasferimento 3 ml della soluzione di agarosio al 3% usando le pipette preriscaldate in un tubo da 50 ml sterile.
- Immediatamente aggiungere 12 ml di media MCF10DCIS caldi e capovolgere delicatamente il tubo conico per mescolare il agarosio con i media. Cercate di non formare eventuali bolle come essa possa interferire con la colonia conta più tardi.
- Aggiungere delicatamente 2 ml di questa miscela in ciascun pozzetto di una piastra di coltura a 6 senza formare bolle d'aria.
- Incubare il 6 pozzetti cultura horizontally su una superficie piana a 4 ° C per 1 ora per permettere la miscela a solidificare.
- Dopo solidifica miscela, posizionare la piastra in un incubatore a 37 ° C per 30 min. Lo strato inferiore è ora pronto per l'uso.
3. Preparazione del Layer-cellulare contenente: 0,3% agarosio Gel
- Cellule Trypsinize MCF10DCIS e diluire ad una concentrazione cellulare di 4 x 10 4 / ml.
- Take 2 ml di agarosio 3% con pipette preriscaldata e trasferire in un tubo da 50 ml sterile.
- Immediatamente aggiungere 8 ml di MCF10DCIS media per il tubo conico e capovolgere delicatamente per miscelare il agarosio con i media. Evitare la formazione di bolle.
- Prendete 2 ml di cellule MCF10DCIS (4 x 10 4 / ml) e trattare con BB-CLA (0 micron (DMSO) o 1 micron).
- In una diluizione 1: 1, mescolare le cellule con l'agarosio 0,6%.
- Prendere 1 ml di miscela di cellule-agarosio e aggiungere delicatamente sullo strato inferiore del 6 pozzetti cultura pin ritardo (2 x 10 4 cellule / ml).
- Posizionare la piastra di coltura da 6 pozzetti orizzontalmente su una superficie piana a 4 ° C per almeno 15 minuti per consentire lo strato superiore si solidifichi.
- Dopo solidifica miscela, posizionare la piastra in un incubatore a 37 ° per una settimana prima di aggiungere il livello di alimentazione.
4. Preparazione dello strato Feeder: 0,3% agarosio Gel
- Forno a microonde il 3% soluzione di agarosio pre-fatto 2-Hydroxyethyl per 15 sec. ruotare delicatamente la soluzione e forno a microonde per altri 15 secondi.
- Equilibrare la bottiglia di soluzione di agarosio in un bagnomaria a 45 ° C.
- Riscaldare i media MCF10DCIS in un bagno d'acqua a 37 ° C.
- Mescolare 1 ml di soluzione di agarosio al 3% con 9 ml di mezzi MCF10DCIS caldo in una provetta da 50 ml e capovolgere delicatamente per miscelare il agarosio con i media. Evitare la formazione di bolle d'aria.
- Trattare il composto con BB-CLA (0 micron (DMSO) o 1 micron).
- Aggiungere delicatamente 1 ml di questa miscela (senza perming bolle) in ciascun pozzetto della piastra di coltura a 6 pozzetti contenenti il fondo e morbidi strati.
- Posizionare la piastra di coltura da 6 pozzetti orizzontalmente su una superficie piana a 4 ° C per almeno 15 minuti per permettere alla miscela di solidificare.
- Dopo che lo strato alimentatore solidifica, posizionare la piastra in un incubatore a 37 °.
- Ripetere questa procedura alimentazione settimanale sovrapponendo 1 ml di soluzione di agarosio / medio / trattamento 0,3% sullo strato alimentatore esistente per ricostituire le cellule con nuovi media fino a quando si osserva la formazione di colonie. Nota: Agar negli strati morbidi e alimentazione è molto morbido e, di conseguenza, i nutrienti aggiunti dallo strato alimentatore prontamente diffondere nello strato di cellule contenenti per raggiungere le cellule.
5. Data Collection
- Dopo 2,5 settimane di crescita cellulare in soft agar, contare il numero di colonie in ogni pozzetto usando un microscopio ottico. Per facilitare la quantificazione, stampare una griglia su un foglio trasparente e fissare la griglia alla6-pozzetti per aiutare a localizzare dove le cellule sono durante il conteggio. Poiché le dimensioni delle colonie (quantificata dal diametro di ogni colonia) varierà, predefinire una dimensione di riferimento colonia per determinare quale colonie saranno segnati. Per esempio, includere dimensioni colonia di 70 micron o maggiore nell'analisi dei dati.
- Conservare i campioni a 4 ° C per impedire ulteriore formazione di colonie e per future conteggio. Sigillare la piastra di coltura 6 pozzetti con Parafilm per evitare che il gel si secchi.
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Representative Results
L'agar morbido dosaggio formazione di colonie può essere utilizzato per una vasta gamma di applicazioni documentano la tumorigenicità delle cellule tumorali. Uno dei principali vantaggi di questa tecnica è che la matrice semisolida favorisce selettivamente la crescita di cellule che possono proliferare in modo ancoraggio-indipendente. Questa caratteristica è esposto principalmente dalle cellule tumorali, ma non dalle cellule normali. Usiamo soprattutto questa tecnica per testare l'efficacia di inibizione della crescita tumorale dalla droga e per verificare l'effetto della sovraespressione o esaurimento dei nostri geni di interesse, tra cui i geni PADI, sulla tumorigenicità delle cellule del cancro al seno. Qui, abbiamo valutato l'effetto di BB-CLA sull'inibizione oncogeno di-PADI2 overexpressing cellule MCF10DCIS (Figura 1 e 2).
I risultati dimostrano che BB-CLA inibisce significativamente la formazione di colonie di cellule derivate MCF10DCIS. Figura 3 mostra che, in presenza di un inibitore PADI, t qui era una riduzione sia formato formazione di colonie e colonie rispetto al controllo DMSO. [Nota:. BB-CLA è stato disciolto in DMSO e quindi, DMSO è stato utilizzato come controllo] La dimensione delle colonie per BB-CLA trattata cellule MCF10DCIS erano prevalentemente nell'intervallo da 20 a 100 micron, mentre la dimensione delle colonie per il DMSO Controllo esibito una maggiore ampiezza di 70 a 150 micron dopo 2,5 settimane di crescita.
Colonies più grandi di 70 micron sono stati contati e analizzati (Figura 4). C'è stata una media di 3.536 colonie nel controllo DMSO mentre solo 1.967 colonie sono stati osservati nel gruppo trattato BB-CLA dopo 2,5 settimane di coltura agar morbido. Questo rappresenta una diminuzione del 44% nella formazione media colonia nella presenza di 1 mM BB-CLA, indicando una significativa inibizione tumorigenica di cellule di carcinoma mammario (cellule MCF10DCIS) dal inibitore PADI.
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Figura 1. Struttura chimica di BB-CLA.
Figura 2. Schema Panoramica del protocollo per il saggio Formazione soft agar Colony. Ciascun pozzetto di piastre di coltura 6 pozzetti è stato rivestito con 0,6% gel (strato inferiore). Una miscela di gel di agarosio 0,3% contenente le cellule MCF10DCIS e sia l'inibitore BB-CLA (1 mM) o DMSO (controllo) è stato poi sovrapposto del gel 0,6%. Una volta alla settimana, il composto gel di agarosio 0,3% (contenente BB-CLA) è stato aggiunto in cima allo strato morbido. Dopo 2 a 4 settimane, formazione di colonie è stato osservato e contato per l'analisi dei dati. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Immagini di Colony Formazione nelle celle MCF10DCIS BB-CLA-trattati. MCF10DCIS cellule sono state coltivate in soft agar in presenza (1 micron BB-CLA) o assenza di BB-CLA (0 pM DMSO). Dopo 2,5 settimane, le colonie sono stati ripresi utilizzando un microscopio invertito per le immagini a basso ingrandimento e microscopio ottico per le immagini ad alto ingrandimento. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Quantificazione dei MCF10DCIS Colony Numero dopo che le cellule BB-CLA trattamento. MCF10DCIS sono state coltivate in soft agar a diverse concentrazioni di BB-CLA (0 micron (DMSO), o 1 microM BB-CLA). Dopo 2,5 settimane singole colonie più grandi thun 70 micron sono stati contati. Gli esperimenti sono stati ripetuti 4 volte (n = 4). La significatività statistica delle differenze conta cellulare totale tra i campioni di controllo e di trattamento è stata determinata mediante test t di Student-campione (* p <0.005).
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Discussion
Il tasso di formazione di colonie in agar morbido varia a seconda del tipo di cellula 9. Pertanto, il numero di cellule per cominciare dovrebbe essere ottimizzato e regolato di conseguenza. Un intervallo di partenza consigliato è tra i 5 x 02-01 OTTOBRE x 10 4 cellule per bene con un 6-pozzetti. Inoltre, le dimensioni delle colonie varia a seconda del tasso di crescita di ogni cella. Pertanto, è necessario un predefinito un cut-off per dimensioni delle colonie di annotare colonie individuali per analisi quantitative a valle. Qui, le colonie più grandi di 70 micron sono stati quantificati per evitare l'inclusione di cellule non proliferanti derivate dal fasciame iniziale.
Per una crescita ottimale, quando si effettua il gel di agarosio 3D, si consiglia di utilizzare lo stesso terreno di coltura cellulare normalmente utilizzato per colture cellulari 2D. Questo perché la modifica di media spesso altera il tasso di crescita delle cellule, e perciò necessitano passaging supplementare per consentire alle cellule di adattarsi al nuovo mezzo. Per esempio, Le cellule MCF10DCIS possono essere coltivate in modo ottimale in RPMI-1640, DMEM, o DMEM media / F12. Tuttavia, quando MCF10DCIS coltura viene cambiato da RPMI-1640 al DMEM / F12, vi è una notevole riduzione del tasso di proliferazione cellulare. Inoltre, si deve prestare attenzione a mantenere le concentrazioni sieriche ad un livello costante, perché, senza siero, formazione di colonie verrà inibita 10. Inoltre, dopo l'agarosio è cotto al microonde, consentire la bottiglia di equilibrare in un bagno d'acqua a 45 ° prima della miscelazione con i media contenente cellule per evitare il surriscaldamento delle celle. Dato che agarosio solidifica rapidamente a temperatura ambiente, si raccomanda anche che tutte le pipette e piastre di coltura 6 pozzetti vengono preriscaldati a 37 ° C incubatore prima di aggiungere la soluzione di agarosio per impedire la solidificazione prematura durante la manipolazione.
Mentre la tecnica di formazione di colonie soft agar è un prezioso strumento per la misurazione tumorigenicità in una serie di linee cellulari tumorali, alcune linee non crescono in agar morbido. Anotsuo potenziale svantaggio del metodo è che le cellule vitali non possono essere recuperati una volta che sono placcati in agar morbido. Inoltre, se un composto ha un periodo più breve biodisponibilità, la fase di alimentazione dovrà essere eseguito più frequentemente (cioè ogni altro giorno) ei campioni dovranno essere raccolti in meno di sette giorni. La soglia per la dimensione delle colonie dovrà anche essere ridotto, pur consentendo di differenze di potenziale tra i campioni da osservare. In questi casi, dovrebbero essere incorporati per ottimizzare i parametri sperimentali per ridurre al minimo i risultati falsi positivi e falsi negativi controlli. Inoltre, questa tecnica può essere lunga e difficile quando prova un gran numero di campioni. Tuttavia, i progressi tecnologici hanno contribuito a superare alcune di queste limitazioni. Il test soft agar convenzionale (come documentato in questo manoscritto) utilizza in genere piastre di coltura 6 pozzetti o piatti della cultura 6 millimetri. Con lettori di piastre automatizzati, tuttavia, multiple campioni possono essere trattati in piastre da 384 pozzetti 11. Per esempio, i ricercatori pre-caricati cellule tumorali con coloranti quali alamarBlue e coloranti tetrazolio e colonie vengono quantificati con lettore di piastre, evitando così la necessità di contare manualmente il numero 11 colonie. Questa funzionalità high-throughput è, quindi, suscettibile di larga scala schermi di droga cancro.
In sintesi, il saggio soft agar è una tecnica di pre-clinico prezioso che può essere utilizzato per valutare la cancerogenicità di una vasta gamma di cellule tumorali (mammella, prostata, ovaie, e altri) per quanto riguarda la loro sensibilità ai farmaci, ormoni, calore, ipossia, e una moltitudine di altre condizioni di trattamento. Il test continua a fornire uno strumento semplice e informativo per i ricercatori di cancro che desiderano comprendere meglio i meccanismi di progressione del cancro e di testare le potenzialità anti-tumorale di nuove terapie oncologiche.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeiss Axiopot | Carl Zeiss Microscopy | 1021859251 | |
| Inverted Microscope | Olympus | CKX41 | |
| DMEM/F-12 | Lonza BioWhittaker | 12-719F | |
| HyClone Donor Equine Serum | Fisher Scientific | SH30074.03 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| 2-Hydroxyethylagarose: Type VII, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | 39346-81-1 |
References
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- Horibata, S., Coonrod, S. A., Cherrington, B. D. Role for peptidylarginine deiminase enzymes in disease and female reproduction. J Reprod Dev. 58 (3), 274-282 (2012).
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