Live-Imaging von Nikotin induzierte Calcium Signaling und Neurotransmitterausschüttung Zusammen Ventral Hippocampus Axone

Zusammenfassung

Wir haben ein gen-chimäres Präparat des ventralen Hippocampus-Accumbens-Schaltkreises in vitro entwickelt, das eine direkte Live-Bildgebung ermöglicht, um präsynaptische Mechanismen der durch nikotinische Acetylcholinrezeptoren (nAChRs) vermittelten synaptischen Übertragung zu analysieren. Dieses Präparat bietet auch einen informativen Ansatz zur Untersuchung der prä- und postsynaptischen Mechanismen der synaptischen Plastizität.

Zusammenfassung

Anhaltende Verstärkung der axonalen Signalübertragung und erhöhte Neurotransmitterfreisetzung durch die Aktivierung präsynaptischer nikotinischer Acetylcholinrezeptoren (nAChRs) ist ein wichtiger Mechanismus für die Neuromodulation durch Acetylcholin (ACh). Die Schwierigkeit des Zugangs zur Untersuchung der Signalmechanismen in intakten Axonen und an Nervenendigungen sowohl in vitro als auch in vivo hat die Fortschritte bei der Untersuchung der präsynaptischen Komponenten der synaptischen Plastizität begrenzt. Hier stellen wir eine gen-chimäre Präparation des ventralen Hippocampus (vHipp)-accumbens (nAcc) Schaltkreises in vitro vor, die eine direkte Live-Bildgebung ermöglicht, um sowohl die prä- als auch die postsynaptischen Komponenten der Übertragung zu analysieren und gleichzeitig das genetische Profil der prä- und postsynaptischen Neuronen selektiv zu variieren. Wir zeigen, dass Projektionen von vHipp-Mikroschnitten als präsynaptischer axonaler Input mehrere, zuverlässige glutamaterge Synapsen mit postsynaptischen Zielen, den dispergierten Neuronen von nAcc, bilden. Die präsynaptische Lokalisation verschiedener Subtypen von nAChRs wird detektiert und die präsynaptische nikotinische Signalübertragung wird durch gleichzeitige elektrophysiologische Aufzeichnung und Live-Zell-Bildgebung überwacht. Dieses Präparat bietet auch einen informativen Ansatz zur Untersuchung der prä- und postsynaptischen Mechanismen der glutamatergen synaptischen Plastizität in vitro.

Einleitung

Cholinergen Modulation Schaltung Erregbarkeit trägt zur grundlegenden Aspekte des Erkennens und verändert cholinergen Modulation ist eine Funktion von neurodegenerativer und neuropsychiatrischen Störungen, einschließlich Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Schizophrenie und Sucht ^1-4. Eine etablierte Mechanismus der cholinergen Erleichterung der synaptischen Übertragung im ZNS ist über eine direkte Aktivierung von nAChR in präsynaptischen Websites lokalisiert. Aktivierung dieser präsynaptischen Rezeptoren führt zur intrazellulären Ca ²⁺ ([Ca ^2+] _i) in präsynaptischen Terminals erhöht - sowohl direkt, aufgrund der rela....

Protokoll

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt (NIH Publications No. 80-23, überarbeitet 2012) und Studien wurden von Institutional Animal Care genehmigt und Verwenden für Forschung Ausschüsse at Stony Brook University (# 1618 und # 1792).

1. vHipp-NACC Synaptic Co-Kulturen

1. Sacrifice Mäuse (postnatalen Tag 0-3, aus Wildtyp (WT) oder α7 nAChR transgene Mauslinie) mit CO _2. Enthaupten jeder Welpe und speichern Sie das Heck in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen für post facto Genotypisierung. Führen Sie folgende Schritte in e....

Ergebnisse

Die eingesetzte Zubereitung umfasst chimäre Gen Kokulturen vHipp-NACC Schaltungen in vitro. Projektionen aus vHipp microslices ausgeht, als präsynaptischen Axon Eingang können synaptische Kontakte mit postsynaptischen Ziele, die verteilt Neuronen aus NACC machen. Nikotin induzierte eine anhaltende (≥ 30 min) Erleichterung der glutamatergen Übertragung von NACC Neuronen durch vHipp innerviert Axone ²¹ und verlängert Calcium-Signal entlang vHipp Axone ⁵ über präsynaptischen α7 nAChR *.

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Diskussion

Das Co-Kulturpräparat beschrieben re-capitulates ventralen Hippocampus-accumbens-Schaltungen in vitro. Diese Zubereitung ermöglicht relativ einfache und sichere Überprüfung der räumlichen und zeitlichen Verläufe von denen die Aktivierung des präsynaptischen nAChRs ELICIT verbesserte glutamaterge Transmission ^{5, 21.}

Co-Kulturen werden als das Wachstum der verschiedenen spezifischen Zelltypen in eine Schüssel, die physiologischen Bedingungen in vitro zur Verfügung .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1. Nährmedien (50 ml)
Neurobasal	GIBCO	10888022	48 ml
B-27 Nahrungsergänzungsmittel	GIBCO	0080085-SA	1 ml
Penicillin-Streptomycin	GIBCO	10908-010	0,5 ml
GlutaMAX Nahrungsergänzungsmittel	GIBCO	35050-061	0,5 ml
Neurotropher Faktor des Gehirns (BDNF)	GIBCO	15140-122	20 ng/ml
2. Waschmedien (HBSS, 100 ml)
HBSS, kein Calcium, kein Magnesium, kein Phenolrot	GIBCO	14175-095	99 ml
HEPES ( 1M)	GIBCO	15630-130	1 ml
3. HEPES gepufferte Kochsalzlösung  (HBS)    pH=7,3
NaCl	Sigma	S9888	ca. 135 mM
KCl	Sigma	P9333	5 mM
MgCl2	Sigma	M8266	1 mM
CaCl2,Sigma		C1016	ca. 2 mM
HEPES	Sigma	H3375	ca. 10 mM
Glukose	Sigma	G0350500	ca. 10 mM
4. HBS Cocktail für Live-Bildgebung pH=7,3
NaCl	Sigma	S9888	ca. 135 mM
KCl	Sigma	P9333	5 mM
MgCl2	Sigma	M8266	1 mM
CaCl2,Sigma		C1016	ca. 2 mM
HEPES	Sigma	H3375	ca. 10 mM
Glukose	Sigma	G0350500	ca. 10 mM
Tetrodotoxin	Tocris	1078	2 µ M
bicuculline	Tocris	131	10 µ M
D-AP-5	Tocris	105	50 µ M
CNQX	Tocris	1045	20 & Mikro M
LY341495	Tocris	1209	10 µ M
5. Frei von Kalzium  HBS    pH=7,3
NaCl	Sigma	S9888	ca. 135 mM
KCl	Sigma	P9333	5 mM
MgCl2	Sigma	M8266	1 mM
HEPES	Sigma	H3375	ca. 10 mM
Glukose	Sigma	G0350500	ca. 10 mM
6. 56 mM Kalium ACSF pH=7,4
NaCl	Sigma	S9888	119 mM
KCl	Sigma	P9333	56 mM
MgSO4,7H	Sigma	M1880	1,3 mM
CaCl2	Sigma	C1016	2,5 mM
NaH2PO4	Sigma	S8282	1 mM
NaHCO3	Sigma	S5761	26,2 mM
Glukose	Sigma	G0350500	ca. 10 mM