Abstract
칼슘은 혈관 조직에서 많은 생리적 과정의 중요한 레귤레이터이다. 대부분의 내피 세포와 평활근 기능이 높은 세포 내 칼슘 ([칼슘 2 +] I) 및 산화 질소 (NO)의 변화에 따라 달라집니다. 위해 두 광자 현미경 염료 [칼슘 2 +] 난, NO 및 다운 스트림 분자가 혈관 수 축제와 혈관 확장제에 대한 응답으로 혈관에 의해 처리됩니다, 우리는 칼슘 라벨을 적용하는 새로운 기술 (또는 라벨링)을 개발하는 방법을 이해하기 절연 혈관 칼슘 처리 (또는 NO 생산)을 측정 하였다. 여기에 설명 된 쥐, 라벨 칼슘 또는 NO 내피 세포 나 평활근 세포 내에서 대동맥을 분리, 이미지 칼슘 과도 (또는 생산) 생리적 다음 두 광자 현미경을 사용하는 방법을 보여줍니다 자세한 단계별 절차 또는 약물 학적 자극. 상기 방법을 사용하는 이점은 다중 겹 : 1)이 동시에 가능하다LY는 내피 세포와 다른 자극에 응답하여 평활근 세포 모두에서 칼슘 과도를 측정; 2) 화상 내피 세포와 그 나라의 설정에서 평활근 세포에 하나 허용; 3)이 방법은 세포 내 칼슘 또는 변경 및 정확한 측정을위한 고해상도 이미지를 생성에 매우 민감; 4) 기재 방법은 활성 산소와 같은 다른 분자의 측정에 적용 할 수있다. 요약하면, 두 개의 광자 레이저 발광 현미경의 적용은 칼슘 과도 및 절연 혈관 내피 세포 및 평활근 세포에서 NO 생산 고품질 정량적 데이터를 제공 및 혈관 기능을 조절 메커니즘에 대한 이해를 촉진하고있다을 모니터링한다.
Introduction
칼슘은 내피 및 평활근 세포, 혈관 등의 세포 내 메신저 근본적인 초이다. 이 혈관 수축 주 자극이고 내피 내의 NO 생성을 통해 그 효과를 포함하여, 혈관 확장술에서 중요한 역할을한다. 인해 영상 기술의 한계, 그것을 그대로 용기 내 칼슘 처리를 거의 관찰 할 수 없었다. 두 광자 이미징 시스템과 새로운 칼슘의 생성 또는 NO 표지 염료의 개발은, 칼슘 역학과 혈관 내의 NO 생성을 이해하기 시작하기에 충분한 깊이 해상도 이미지를 가능하게한다.
이광자 현미경 최근 조직, 기관 때문에 깊이 낮은 배경 형광 및 높은 신호 감도와 조직을 관통하는 뛰어난 능력에도 전체 동물 실험에 적용되어왔다. 1,2- 보조광 두 광자 여기의 좁은 스펙트럼이온 초점 비 descanned 검출기의 사용은 두 개의 광자 공 초점 현미경은 전통적인 현미경 우수 이유이다. 공 초점 현미경에 의한 자동 형광 공 촛점 핀홀에 포커스 아웃 광의 산란에 필요한 조직 깊이에 고품질 이미지를 생성 할 수 없다. 따라서, 우리는 [Ca를 2+] i가 시그널링 측정하는 이광자 현미경을 사용하는 방법 및 높은 해상도와 낮은 신호 - 대 - 잡음비와 그대로 개별 혈관 세포에서 NO 생산을 개발 하였다.
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Protocol
아래에서 설명하는 실험 절차는 위스콘신 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인 및 실험 동물의 관리 및 사용을위한 건강 가이드의 국립 연구소에 따라했다되었다.
쥐 대동맥 1. 분리
- 이소 플루 란 (5 % 유도, 1.5 %, 2.5 유지 보수) 또는 다른 IACUC로 쥐를 마취는 방법을 승인했다.
- 앙와위에서 쥐를 놓습니다. 복부 장기를 노출하기 위하여, 피부와 피하 조직을 통하여 복부 작은 복부 정중선을 절개. 도 1에 도시 된 바와 같이 사용 거즈 패드는 부드럽게 대동맥과 대정맥을 노출 창자 편향.
- 간단히, 결합 조직에서와 대정맥에서 대동맥을 해부 무딘. 신장에 가능한 한 가까운 대동맥을 묶는, 봉합사를 사용하여. 대동맥 2cm과 15 ML 원뿔 TU에 배치 - 1을 해부하다정상적인 생리 소금 솔루션 포함 할 (PSS를, mM의에 : (140)의 NaCl, 1.2의 MgCl 2, 2 염화칼슘 2, 4.5 KCl을, 6 포도당, 10 HEPES) 얼음에.
- 대동맥 단리되면, 승인 IACUC 프로토콜에 따라 동물을 안락사. 모든 비 생존 완료시 절차는 동물의 인간 소멸을 위해 기흉 개흉술을 유도하여 깊게 마취 동물을 안락사. (3)
- 해부 현미경을 사용하여, 집게를 뾰족한 및 microscissors은 대동맥 떨어져 지방과 결합 조직을 해부하다. 대동맥이 깨끗하면, 길이 방향으로 대동맥을 절단하고 나중에 얼음에 PSS에 넣습니다.
2. 염료로드 및 배양
- 피펫 알루미늄 호일로 피복 된 각각의 500 μL를 튜브에, DMSO 기반 솔루션에 공급된다 1mM의 FLUO-4 오전 염료, 7 μL. 시간이 지남에 따라 염료의 특성을 유지하기 위해 -20 ℃에서 냉동실에 보관합니다. 참고 :이 너무 분주lutions은 6 개월 이상 안정해야한다.
- 사용하기 전에 염료 솔루션을 열기 전에 실온으로 따뜻하게 할 수 있습니다. 바로 사용하기 전에 작업 솔루션을 준비합니다. 나중에 사용하기 위해 희석 시약을 보관하지 마십시오.
- 더 칼슘을 포함하지 않는 PSS 450 UL에 DMSO 용액에 용해 기성품 1 mM의 FLUO-4 오전 염료의 7 μl를 추가합니다. 아세 (AM) 에스테르를 분산 도와 칼슘 염료 로딩을 향상시키기 위해 로딩 칵테일 비 기반 DMSO 10 % 플루 믹산 용액 40 μL를 추가한다.
- 1 시간 동안 (2.3에서 설명)로드 칵테일이 포함 된 500 μL 튜브로 해부 대동맥를 놓습니다. 실온에서 회전하는 통에 호일과 장소 모든 튜브를 커버.
- 혈관에서 NO 생성을 모니터링하지 않으려면, DAF-FM 디 아세테이트 염료를 사용합니다. 450 μL의 PSS 40 μL 플루 오닉 산 및 10 mM의 DAF-FM 디 아세테이트 5 μl를 함유하는 용액에서 대동맥 부화. (2.3에서 설명) 칼슘 배양 프로토콜과 유사하게, 배치 대동맥RT에서 30 분 다음이어서 4 ℃에서 30 분 동안 회전 진탕 기에서 호 및 장소에 덮여 NO-염료 용액을 함유하는 500 μL 튜브.
- NO 생산이 측정되지 않을 때,도 4b에 도시 된 바와 같이, 대조군으로 NO 생산을 차단하지 위해, 내피 NO 합성 효소 억제제, L-NAME을 사용하지 않는다. 그 절차는 (실온에서) 배양의 마지막 30 분 동안 (2.5에서 설명) 칵테일 100 나노 미터 L-NAME에 추가 할 수 있습니다.
3. 레이저 스캐닝 두 광자 현미경 프로토콜
- 세포 외 염료를 제거하기 위해 깨끗한 PSS 3 번 - 1 시간 배양 후, 대동맥 2 씻는다.
- 정상 PSS 또는 칼슘 - 무료 버퍼 (실험 프로토콜에 따라 다름)를 포함하는 실리콘 코팅 접시에 대동맥을 전송합니다. 실리콘과 접촉 외막 내려 실리콘 코팅 상 대동맥 핀 (즉, 접시 개구에 노출 된 내피 루멘) μ 형상 핀을 사용. 다르게는, 조각 앵커를 사용그리드 또는 접착제 조직을 해결하기 위해.
참고 : 스트레스와 기계적인 유물, 전송을 줄이고 캘리포니아 2+ - 무료 솔루션을 대동맥를 수정하고 5 기다릴 - 실험을 시작하기 전에 10 분. - 연동 펌프 또는 약물의 자동 또는 수동 응용 프로그램 또는 세포 외 솔루션을 변경하기위한 실리콘 코팅 된 플레이트에 주사기를 연결합니다.
- 수직 두 광자 현미경의 노즈 피스 아래에 접시를 놓고 설치하고 시료 위의 25 × (NA 1.05 및 작동 거리 2mm) 물에 침수 대물 렌즈의 위치. 참고 :이 특정 렌즈를 사용할 수없는 경우는 일반 목적에 비해 극적으로 신호의 해상도를 증가시킬 수 있기 때문에, 특히 두 개의 광자 이미징 제조 목적을 사용합니다.
- 소프트웨어를 사용하여 두 개의 광자 레이저를 활성화 (레이저는 펌프에 설정하기 시작합니다). 튠 820 nm의 레이저 여기.
- 표면 형광을 사용하여 대동맥을 찾아에 대물 초점거친 조정을 사용하여 내피 세포의 표면.
- 여기 레이저가 모드 잠금, 비 descanned 감지기가 결합되고, 예상되는 방출 스펙트럼에 적합한 배출 필터가 설치되는 것을 보장하는, 두 개의 광자 레이저 스캐닝 현미경 모드로 전환. 참고 : 여기에, FV10-MRL / R (495 nm의 540)을 사용 하였다.
- 약 5 %의 레이저 파워를 이용하여 실시간 스캐닝을 시작하고 미세 혈관 내피 세포를 시각화하기 위해 대물 초점.
주 : PSS 정상 배양 때 내피 세포 강한 형광 신호를 나타낼 것이다. 혈관이 칼슘 무료 버퍼에 배양 할 때이 눈에 띄게 약화 될 것이다. 내피 세포는 열린 대동맥의 상부 및 평활근 세포는 단지 내피 세포 (도 2 참조) 아래에서 볼 수있을 것이다. 혈관이나 매끄러운에도, 평활근 세포 및 내피 세포가 모두 존재하는 곳에있을 것이다도 때문이다. </ 리> - 셀에 포커스가되면 현미경 소프트웨어 프로그램은 고속 스캔 모드에서 순차적 이미지 (래스터 스캔, 1.1 초의 프레임 컬렉션 주파수 512 X 512 픽셀의 윈도우)를 수집한다. FLUO-4 오전 형광과 병행하여, 혈관 수축의 변화를 감지하고 더 나은 실험 조건을 시각화하기 위해 빛의 이미지를 전달 수집합니다.
- 기준 신호 이미지를 수집 한 후, 외부 용액에 칼슘 이온 농도를 변경하거나 천천히 연동 펌프 이미징 동안을 이용하여 약리 자극 에이전트를 적용합니다. 로드 된 세포 내 형광 신호 증가를 관찰한다.
참고 : 내피 세포는 흐름의 변화에 따라서는 칼슘 또는 NO 신호의 약리 활성제의 응용 프로그램을하기 전에 낮은 층류 응용 프로그램 및 차량 테스트를 사용하는 것이 좋습니다 반응한다. FLUO-4 (I FLUO-4에 대한 해리 상수 로케이션 혈관 nM의 농도 값에 세포 내 칼슘 재 계산S 345 ㎚), 형광 강도는 기준선 및 이오 노마 이신과 MnCl 2 첨가 한 후 기록 될 수있다. (4)
4. 이미지 처리 및 계산
- 다운로드 및 피지를 이미지 처리 패키지를 설치합니다.
- 피지에서 이미지 파일을 엽니 다. 메시지가 표시되면 파일을 가져 오기하면, 채널 (투과광 및 형광 신호)를 분할합니다. 데이터 분석에만 형광 신호를 사용한다.
- 피지 프로그램 내에서 분석 탭을 클릭하고 도구 옵션을 아래로 스크롤합니다. 도구 옵션에서 투자 수익 (ROI) 관리자를 말한다 탭을 찾아서 클릭; 새 창이 나타납니다.
- 이 후, 분석 탭에서 설정 한 측정을 클릭합니다. 관심의 특정 측정을 선택합니다. 칼슘 과도 측정을 위해 평균 회색 값 옵션을 사용합니다.
- 원형 추적 도구를, 관심 영역 (ROI)을 추적하고 모든 연구에 대한 투자 수익 (ROI) 관리자 화면에서 "추가"를 클릭하기 시작OI. 일단 관심의 모든 세포는 투자 수익 (ROI) 관리자 창에서 "추가"탭에서 다중 측정을 선택, 추적하고있다. 스프레드 시트로 이러한 측정을 모두 직접 측정 값을 저장하거나 복사 및 붙여 넣기하는 중 기억하십시오.
- 열기 * .txt 인 파일이나 Excel 스프레드 시트 피지에서 새 원본 워크 시트에 숫자를 전송합니다. 참고 : 또한, 추가 분석을 위해 시그마 플롯 또는 프리즘과 같은 어떤 프로그램을 사용합니다.
- 원산지 프로그램 내에서 모든 과도 응답의 개요를 관찰 할 줄 + 기호 메뉴 → 플롯을 사용합니다. 응답하지 않는 세포의 선택을 취소합니다.
- 시간 척도 (X 축)에 대한 추적 번호를 다시 계산, 열 → 설정 열 값을 사용하고 (우리의 경우 1.1s에서) 이미지 모음 주파수로 추적 번호 열을 곱합니다.
- 평균 (Y 축) 및 표준 오류 추적을 계산하기 위해 선택한 모든 레코딩을위한 행에 분석 → 통계를 사용합니다. 세포의 현재 그룹이 라인 + 기호 → 플롯에 대한 최종 그래프를 플롯.
- MEA다음으로 N 칼슘 과도 계산이 설명되어 있습니다.
- 원산지 프로그램 내 총 칼슘 릴리스, 다음, 그래프를 클릭 메뉴 분석 → 미적분을 사용 → 통합 할 수 있습니다. 곡선 아래 영역의 총 적분 결과 로그에 나타납니다.
- (X 축이 과도 응답 끝으로 최대 범위 선택) 분석 → 비선형 커브 피팅 → 선택 데이터 세트 : 과도 반응 속도를 들어, 그래프를 클릭 한 다음 메뉴를 사용합니다. 완료 → 지수 감쇄 1 → 기능 선택 → 피팅 시작합니다.
지수 피팅 그래프 창에 표시 및 로그 결과 :합니다. 획득 한 데이터 (값)는 칼슘의 방출 총량을 나타내고, 채널의 동력학은 과도 응답을 매개.
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Representative Results
생리 정확하게 혈관 (혈관 확장 및 혈관 수축) 칼슘의 기여도를 평가하기 위해, 프로토콜은 내피 세포 및 절연 그대로 대동맥 평활근 세포에 모두 칼슘 염료를로드하기 위해 설계되었다. 그림 1에 묘사 된 설정 일반적인 실험은 고립과 이미징 전에 용기의 제조를위한 기본 전략을 보여줍니다. 간략하게, 래트 대동맥의 분리 후, 지방 및 결합 조직의 세정되어야하며, 길이 방향 슬릿. 열린 대동맥이어서 광 락으로 1 시간 동안 RT에서 및 프로토콜에 기재된 바와 같이 배양 전에 준비된 로딩 칵테일을 함유하는 호일 덮인 500 μL를 튜브에 배치한다. 배양 후, 대동맥은 위쪽으로 실리콘과 루멘 가까운 외막과 실리콘 커버 플레이트에 내려 고정, 세척해야하며, 이미징을위한 수직 두 광자 현미경으로 전송.
ONC전자 대동맥이 현미경에 배치되어 있으며, 선박의 초점이, 내피 세포는 강한 형광 방출 (그림 2A)에 의해 쉽게 찾을 수 있어야합니다. 내피 세포는 혈관이 아래로 고정 될 때 주로 내피 세포로 구성되어 혈관의 내강이 위쪽을 향하도록해야하기 때문에 초점에 와서 최초의 객체가 될 것입니다. 내피 세포를 영상화하는 이외에, 평활근 세포 (도 2b)에 위치를 볼 수있을 것이다. 따라서, 내피 세포 및 평활근 세포 모두 동일한 촬상 필드 (도 2C) 내에서 식별 될 수있다. 동일한 이미지 필드 내에서 이미지 모두 혈관 세포 유형하는 능력을 갖는 것은 이들 세포는 공동으로, 또 독립적으로 서로 다른 작용제 및 자극에 반응하는 방법을 더 잘 이해 될 수 있습니다.
이 방법의 유용성을 입증하기 위해, 대동맥 세포 측정 첨가 대응력cetylcholine (ACH), 특히 내피 세포 내 변화를 일으키는 강력한 혈관 확장제는, 결정 하였다. 도 3a에 도시 된 바와 같이 정상 PSS 배양 동안, 내피 세포가 쉽게 알 수있다. ACh에 (도 3b)의 첨가 후, 내피 세포의 형광 증가가 세포 내 칼슘 함량도 증가되는 것을 나타낸다. ROI 영역, 또는 내피 세포로부터 방출 된 형광의 정량은,도 3c에 도시된다. ACh에의 첨가 한 후, 세포 내 칼슘 함량 증가는 빠르게 다음 천천히 다시 기본으로 돌아갑니다. ACh에 대한 응답으로 내피 세포 내 칼슘의 증가는 이전 보고서와 일치한다. 5,6
칼슘의 연구와 유사하게,이 프로토콜은 내피 NO 생산하지의 검출에 적합하다. 그림과 같이이 실험의 경우, 대동맥 내피 세포는 DAF-FM 디 아세테이트 염료로드 된도 4a. 이 방법은 최근에 ACh에 자극에 대한 응답으로 칼슘 의존적 방식으로 NO 생성이 증가한다. (6) 중요한 것은, L-NAME, 내피 NO 합성 효소 억제제로 치료 한 후,이 응답은 (그림 4B) 차단 된 것을 증명하기 위해 사용되었다.
이 기술은 세포 내 칼슘의 측정에 적용 할 수있는 방법의 또 다른 대표적인 예는 칼슘 함유 용액 칼슘 프리 버퍼에 배양 용기에 첨가 하였다 비디오 1에 나타낸다. 대동맥을 처음 (비디오의 시작 부분) 자유 칼슘 완충액 때, 내피 세포는 세포 칼슘의 낮은 수준을 나타내는 형광 약하게된다. 그러나, 통상의 PSS의 첨가 후, 세포가 즉시 증가 [칼슘] I 농도 및 높은 강도를 형광 발광에 의해 반응한다. 이 실험은 세포가 살아 있음을 보여줍니다외부 자극에 반응. 이 실험은 또한 고품질 데이터의 수율이 방법의 가능성을 확인합니다.
그림 1. 대동맥의 분리 및 실험 세트까지. 1) 쥐를 마취 후 복부에 절개를하고, 결합 조직과 대정맥에서 대동맥을 격리 할 것. 2) 대동맥 추출한 지방 및 결합 조직의 용기를 청소하고 종 방향으로 절단하여 용기를 연다. 3) 약간의 락과 실온에서 1 시간 동안 FLUO-4 오전 염료에서 선박을 품어. 4) 배양 후, 대동맥을 씻어 위를 향 루멘, 실리콘 코팅 된 판에 그것을 고정하고, 수직 두 광자 현미경의 무대로 전송할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2 이미징 평활근 및 내피 세포. 칼슘 염료 충분한 로딩 후에, 평활근 세포 및 내피 세포를 모두 화상 할 수있다. () 위쪽, 고립 된 쥐 대동맥 내피 세포의 FLUO 4 형광의 예입니다. 아래는 형광 이미지 (유사 B와 C에 대한) 전송 된 빛을 볼 수있는 병합됩니다. (B)는, 절연 쥐 대동맥 평활근 세포의 형광 FLUO 4의 예이다. 인해 대동맥의 불균일 두께 (C)가, 그것 평활근 및 내피 세포가 모두 존재하는 화상 영역으로하는 것도 가능하다. 스케일 막대가 표시됩니다. 의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림.
ACh에 대한 응답으로 내피 세포에서 칼슘 과도 측정 그림 3. () 대동맥을 처음 준비 및베이스 라인 녹음 정상 PSS 버퍼에 배양 하였다. 아세틸 콜린 (ACH), 세포 내 칼슘 농도의 증가를 나타내는 개선 된 내피 세포 (로아)에 의해 방출 된 형광 신호 첨가 한 다음에 (B). 눈금 막대가 표시됩니다. (C) 이크에 응답하여 내피 세포의 칼슘 과도 원산지 소프트웨어를 사용하여 계산 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
칼슘 Concentratio의 변화에 내피 세포 대응의 비디오 1 예N. FLUO-4 오전 염료의 준비 및 배양 후는 대동맥 무 칼슘 완충액으로 세척하고, 두 개의 광자 현미경의 스테이지에 배치 하였다. 용기 칼슘 프리 버퍼에 배치되면, 내피 세포의 대부분은 약하게 형광이다. 정상 PSS 첨가 한 다음에, 내피 세포는 세포 내 칼슘 농도를 증가시키고, 강한 형광 신호를 방출함으로써 응답.
비디오 isoltated 쥐 대동맥 내피 세포.에는 생산 2. 예 DAF-FM 디 아세테이트 염료의 준비와 배양 한 다음은, 대동맥는 두 광자 현미경의 스테이지에 배치했다. 욕 용액에 이크의 첨가 후, 내피 세포는 세포 내 N을 증가시킴으로써 대응O 생산과 강한 형광 신호를 방출. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
실험 개요. 더 나은 혈관 생리학에 아무 칼슘의 기여를 이해하고, 새로운 방법은 측정하기 위해 개발되었다 [칼슘 2 +] 나는 더 부드러운 근육과 고립 그대로 대동맥의 혈관 내피 세포 내에서. 1) 기계적 분리 및 준비 (효소되지 소화) 선박의 : 함께,이 프로토콜은 이러한 중요한 단계로 구성되어 있습니다. 이는 최적의 생리 녹음을 얻을 수만큼 건강한 조직을 그대로 유지하는 것이 중요하다. 플루로 닉 산 2) 칼슘 라벨 염료의 보육 또는 NO-라벨 염료는 다른 선박 유형, 다른 플루로 닉 산 및 배양 시간을 테스트 할 필요가있다, 그러나 중요하다. 그리드 핀 실리콘 코팅 접시 대동맥 3)는 적당한 고정 이광자 현미경 영상 중에 안정한 모습을 제공한다. 혈관이 수축과 팽창 것 때문에 선박이 prope이 있는지 확인하는 것이 중요하다RLY 발생하는 움직임 아티팩트를 피하기 위해 접시에 고정. 결과 4) 정량. 과도 진폭이 항상 세포의 생리 학적 특성을 비교하는 가장 좋은 매개 변수를하지 않을 수 있습니다. 과도의 통합으로 인해 총 [칼슘 2 +] I 또는 NO 릴리스에 더 나은 변화를 표시 할 수 있습니다.
실험이 정확하게 수행되는 경우, 모니터링 할 수있다 [칼슘] I (또는 NO 농도) 비디오 1,2. 생체 제제의 조합을도 3 및 4에 도시 된 바와 같이 자극에 응답하여 변경 및 두 광자 이미징의 사용은 더 나은 신호의 해상도 및 혈관 조직에서의 세포 내 과정의 정확한 측정을 제공 할 수있다. 여기에,이 기술은 고전적인 비 비율 계량 칼슘과 NO 지표 (FLUO-4 AM과 DAF-FM 디 아세테이트, 각각),에와 함께 적용되었다칼슘 과도와 격리 된 전체 대동맥의 각 세포에서 NO 생성을 측정한다. 우리는이 기술이 메커니즘 조절에 대한 우리의 지식을 전달하는 데 도움이 될 것으로 믿는다 [칼슘 2 +] i와 다른 혈관 세포 유형 내에 수준.
수정 및 문제 해결. 민감한 이오 노 포어와 하나의 평활근 세포에서 칼슘 신호를 측정의 기본 원리는 처음 1985 년에 발표 된 7 레이저 스캐닝 공 초점 현미경 및 격리를 고용 한 칼슘에게 개별 혈관 세포에서 2+ 수준의 이미징에 대한 최근의 대부분의 메소드 또는 배양 준비. 혈관 같은 동적 조직 들면, 칼슘 또는 현미경 기반 기술을 이용하여 생체 내에서 NO 수준을 측정하는 것은 곤란하다.이 여기 주요 제한 순환 동맥 측의 거의 모든 혈관 사이에있는 내부 탄성 박판을 가지고 있다는 endot헬륨 및 평활근 세포의 최 내층. 8은 또한 평활근과 외막 층의 세포 외 물질의 대부분. 엘라스틴 8 콜라겐 및 콜라겐은 높은 강도 및 여기 파장의 광범위한 자동 형광의 주요한 원천 . 공 초점 이미징 동안 증가 된 광 산란과 함께 강한 배경 형광은 낮은 신호 해상도와 칼슘 신호 또는 NO 생산 따라서, 감소 검출을 생산하고 있습니다. 의미있는 측정을 수행하기에 충분한 농도에서 혈관 세포 내로 로딩 형광 프로브의 제한 요소는 긴에서 형광을 방출 아산테 레드 등의 이오 노 포어, 새로운 종류의 생체 외 제조, 이광자 현미경을 사용하고, 도포에 의해 해결 될 수있다 결합 조직 및 섬유의 자기 형광에서 더 적은 간섭이 파장. 그러나,이 방법의 주요한 제한 사항 중 하나는 DIF 있다는촬상 중에 둘 이상의 염료를 결합 ficult. 두 광자 영상화 가능한 염료 대부분 여기 스펙트럼을 동시에 서로 다른 두 이오 노 포어를 측정하는 것이 곤란하게 넓은 다 모드 분포 특성을 갖는다. 그러나, 저잡음 하이브리드 검출기 이오 노 포어가 서로 다른 파장의 광을 방출하는 것으로 가정하여 검출 된 발광 스펙트럼을 좁히는 데 사용될 수있다. 예를 들어,이 기술 된 절차에서 그 발광 스펙트럼이 중첩하기 때문에 NO 생성 및 칼슘 농도의 변화를 모두의 측정이 불가능하다.
혈액의 흐름과 직접 접촉하는 혈관 내피 세포는 유체 전단 응력에 노출 된 혈관 항상성을 조절한다. (9)의 현재 방법은 또한 플로우 - 유도 칼슘 과도 현상 및 내피 세포 생체에서 NO 생산을 모니터링하는 데 적용 할 수있다. 또한,이 방법은 성공적 칼슘에게 2+ 집중하고 연구에 적용 할 수있다신장에서 추출한 작은 저항 동맥의 평활근 세포에서 기 변경됩니다. 이 경우, 작은 절개 저항 동맥 인해 칼슘 과부하 평활근 세포의 손상을 방지하기 위해 CA의 2 + -free 용액을 배양한다. 이 변형 예는 또한 세포 사멸을 감소 대동맥에 적용될 수있다.
관점. 형광 기반 이미징 널리 체외에서 세포 생리학을 연구하는 데 사용되었다; 그러나, 고립 셀 모델은 항상 셀이 그 나라의 환경에있을 때 발생하는 생리 과정 요점을 되풀이하지 않는다. 여기에 설명 된 바와 같이이. 중개 연구로 10 세포주의 적용이 제한되어, 다른 세포 유형과 모든 로컬 생리 과정과 상호 작용이 여전히 발생하는 위치 생체 제제의 용도는 우리에게 새롭게 절연 조직 셀룰러 동작을 모니터링 할 수있는 기회를 부여하고있다 . 유전 지점을 인식의 증가와 함께eering 기술을 사용할 수 있으며 인간의 질병을 요점을 되풀이 모델의 개발, 생체 준비는 병진 연구를위한 유용한 도구가 될 것입니다. 여기에 설명 된 연구를 들어, 달 소금에 민감한 (SS / JrHsdMcwi) 고혈압 쥐 균주를 사용 하였다. SS 쥐 진보적 인 인간 고혈압의 여러 측면을 되풀이되었습니다 소금에 민감한 고혈압의 자연 발생 근친 유전 모델입니다. 이 모델은 광범위하게 사용되고 있으며,이 쥐 모델 소금 민감도와 혈관 기능 장애. 11 ~ 13을 기본 메커니즘에 중요한 통찰력을 제공하고, 연구자들은 ZFNs를 사용하여 (고혈압 등) 복잡한 질병에 키 메커니즘의 기여를 테스트 할 수 있었다 이러한 유전자 편집 자원과 함께 여기에 설명 된 실험 절차를 사용 TALENs 및 CRISPR / CAS 기반의 유전자 편집 기술. 6,14-17, 그것은 소금에 칼슘과 다른 중요한 요소의 기여를 테스트를 시작하는 것이 가능하다 민감한고혈압과 다양한 동물 모델에서 혈관 기능 장애.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
우리는 영상 검사에 대한 도움말 박사 윌리엄 Cashdollar, 위스콘신의 혈액 연구소의 노스 웨스턴 뮤추얼 재단 이미징 센터 감사합니다. 우리는 또한이 원고과 도움이 토론의 중요한 읽기 박사 다리아 Ilatovskaya 감사합니다. 이 연구는 (AS에) 건강 보조금 HL108880의 국립 연구소 및 (AMG에) DP2-OD008396에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DAF-FM | Life Technologies | D-23842 | |
| Fluo-4 AM | Life Technologies | F14217 | 500 µl in DMSO |
| Pluronic F-68 solution | Sigma-Aldrich | P5556 | |
| L-NAME | Tocris | 0665 | |
| Olympus upright microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| MaiTai HP DeepSee-OL | Spectra Physics | Ti:sapphire laser 690nm — 1040nm | |
| Filters | Olympus | FV10-MRL/R | 495 to 540 nm |
| 25× water-immersion objective lens | Olympus | XLPL25XWMP | N.A. 1.05 and working distance 2 mm |
| Slice Anchor grid | Warner Instrument | SHD-27LH | |
| Other basic reagents | Sigma-Aldrich |
References
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