小鼠腹腔巨噬细胞的分离，以贯彻基因表达分析后Toll样受体刺激

Summary

我们在这里描述了一种分离小鼠腹膜巨噬细胞的简单方案。该程序之后进行 RNA 提取，以在 Toll 样受体刺激后进行基因表达分析。

Abstract

在感染和炎症，循环单核细胞离开血流并迁移入组织，在那里它们分化成巨噬细胞。巨噬细胞表达表面Toll样受体（TLR），其识别通过进化保守在宽范围的微生物的分子模式。 TLR的发挥其通常与基因表达的改变相关巨噬细胞活化中发挥中心作用。巨噬细胞是在许多疾病的关键，并已成为用于治疗的有吸引力的目标。在下面的协议中，我们描述了一种方法来分离使用啤酒巯基醋酸盐培养基小鼠腹腔巨噬细胞。后者将提升单核细胞迁移进入腹膜，因此这将提高巨噬细胞的产量提高了10倍。几个研究已经进行了使用骨髓，脾脏或腹膜巨噬细胞。然而，巨噬细胞被证明是在分离更成熟，更稳定在它们的功能性和表型。因此，巨噬细胞小鼠腹腔分离提出了一个重要的细胞群，可以在不同的免疫和代谢的研究服务。一旦分离，巨噬细胞刺激不同TLR配体，因此基因的表达进行评价。

Introduction

网状内皮细胞吞噬系统是由细胞的各种组织和器官如骨髓，血液，肝脏和脾脏。巨噬细胞广泛分布在身体周围，在那里他们尤其参与先天免疫和适应性免疫应答，以控制和明确的感染。除了 ​​其在宿主防御作用，巨噬细胞也发挥在伤口愈合和在维持组织稳态^1,2-重要作用。此外，巨噬细胞不仅是重要的免疫功能，而且还积极参与铁稳态^3。在人体中，铁的约80％存在于血红蛋白的红细胞内，其中，当衰老被巨噬细胞吞噬^4。每日，这些巨噬细胞回收的红细胞来源的铁25毫克，并提供其传输到等离子体^5。此外，感染和炎症期间，促炎症的巨噬细胞隔离血清铁，减少铁availabiliTY病原体，同时在全身和地方各级^6-8。同时，研究表明，巨噬细胞和肝细胞为主名为生产铁调素抗菌肽被认为是铁代谢^9，10主调节器。铁调素主要是增加了炎症刺激，是在慢性炎症^11-13部分负责铁封存在巨噬细胞。在巨噬细胞铁调素的表达不是很好理解，我们研究Toll样受体在本条中的作用（Toll样受体）。该TLR是巨噬细胞主要发现，在它们的活化中发挥中心作用。另外，在肝脏中的LPS诱导的铁调素表达依赖于TLR4 ^13。因此，要执行我们的研究中，我们使用了基于小鼠腹腔巨噬细胞的分离方法。

巨噬细胞系中的巨噬细胞螺柱广泛使用IES;尽管如此延长培养可以挑起基因损失和在这些细胞系中降低免疫功能....

Protocol

所有的程序都按照加拿大议会动物护理指南批准德中心杜RECHERCHE中心医院DE L'蒙特利尔大学的体制动物护理委员会（CRCHUM）之后进行。

1.分离鉴定，培养小鼠腹腔巨噬细胞，并

1. 准备3.8％的啤酒中​​巯基乙酸盐。要做到这一点，暂停38克硫乙醇酸盐培养基1000毫升蒸馏水。带来溶液煮沸以完全溶解培养基。通过在121℃高压灭菌15分钟进行消毒。存储长达3个月在黑暗中，在室温^18。
   注:丢弃如果混浊发展其指示细菌污染。该溶液可以保存长达一年在黑暗中，如果保持无菌。
2. 使用连接到23政针1毫升注射器，注射1毫升3.8％巯基乙酸布鲁尔介质进入腹腔每个亩腔本身并等待3天。使用新的注射器和针头每个鼠标。
3. 通过腹膜内注射戊巴比妥钠（100毫克/千克）麻醉小鼠，并用颈脱位安乐死的小鼠。通过检查呼吸频率确认正确的麻醉。通常快速呼吸表明，鼠标不深度麻醉。
4. 洗每只小鼠用70％乙醇的腹部。使用剪刀，沿着腹膜的底部中线进行横向切割。
5. 使用镊子，拉回来的腹部皮肤暴露腹膜透明皮肤。使用连接到20G针5毫升注射器，注入5毫升冷的DPBS到腹膜各小鼠的空腔。
6. 对腹腔进行轻柔的按摩，然后小心吸液不进行打孔的任何器官。取出针和分配的腹膜液到50ml锥形离心管中。
7. 离心，在400×g离心在冷冻离心机10分钟。细胞必须在整个过....

Results

我们首先特点分离小鼠腹腔巨噬细胞用流式细胞仪。要做到这一点，我们使用（F4 / 80）的抗体特异性识别只由巨噬细胞表达的标志物。这种特征是必需的，以确定分离的巨噬细胞的百分比和区分它们在分离过程得到的细胞之间。如图（ 图1），细胞的百分比表达抗原的F4 / 80被一致地为95％以上。接着，为了研究巨噬细胞中的基因表达，所述分离细胞用几种TLR配体:Pam3CSK4（TLR1 / 2），LPS（TLR4）和FSL1（TLR6 / 2）。随后，铁调素（HAMP），我们感兴趣的基因，的表达水平通过RT-PCR测定。所示（ 图2），TLR1 / 2，TLR4和TLR6 / 2配体均能够刺激的hepcidin的mRNA在小鼠巨噬细胞^19。总之，这些结果表明，该协议成功的有用LY隔离小鼠腹腔巨噬细胞和精确地进行调查的基因表达的分子调控。

图1.表征.......

Discussion

巨噬细胞是生存的关键，并提供了一​​个诱人的目标来操纵宿主免疫学的目标。 Toll样受体和其他识别分子的发现进行了巨噬细胞免疫学争论的中心。巨噬细胞对多种刺激，包括细胞因子，损伤相关分子模式分子^{（DAMPS）20}和与病原体（的^PAMP）21组相关联的分子响应。这些不同的刺激响应代表的巨噬细胞的活化过程中，与通常与突然改变有关的基因表达^22。

在非炎症条件下，多数的巨噬细胞的存在于在体内的战略位置。它们可以在所有组织和如在血液循环单核细胞中找到。因此，巨噬细胞是存在于最容易受到位点微生物的侵袭。

宿主防御被描述为一个i-nflammatory响应于消除与传统巨噬细胞活化相关的细胞内病原体。巨噬细胞的经典激活由微生物产物诱导的诸如在Th1型细胞因子环境脂多糖这将导致促炎性M1巨噬细胞中的极化。炎症导致的组织损伤的持久性和必要的主机的生存抗炎机制的发展。因此，Th2细胞因子允许再引入抗炎M2巨噬细胞极化的抑制和调节M1响应，并且也促进组织修复。在本文中描述的协议，巯基.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL / 6小鼠	Charles River Laboratories，Inc.（美国马萨诸塞州威尔明顿）	475
巯代乙酸盐	Sigma-Aldrich，（密苏里州圣路易斯）	19032-500G
70%乙醇
10%戊巴比妥钠（用于小鼠麻醉（80 mg / kg，ip））
杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水 （DPBS），置于冰上，用于收获巨噬细胞	WISENT INC Canada （QC）	311-425-CL
RPMI 培养基 1640（补充青霉素、链霉素、L-谷氨酰胺和 10% 胎牛血清）。	WISENT INC Canada （QC）	350-000-CL
1 和 5 ml 注射器	BD 美国（新泽西州）
6 孔板	康宁公司（美国纽约）	MCT-150-C
细菌脂蛋白 Pam3CSK4 （0.5 mg/ml）	InvivoGen（美国圣地亚哥）	TLRL-pm25
聚离子氨酸–聚胞酸（Poly（I：C））（10 mg/ml）	InvivoGen（美国圣地亚哥）	TLRL-PIC
LPS 055：B5（100 ng / ml）	InvivoGen（美国圣地亚哥）	L2880
沙门氏菌的纯化鞭毛蛋白（100 ng / ml）	InvivoGen（美国圣地亚哥）	TLR-FLIC-10
蛋白合成FSL1（100 ng / ml）	InvivoGen（美国圣地亚哥）	TLR-FSL
源自 HIV-1 长末端重复 ssRNA40 的 ssRNA （1 μg/ml）	InvivoGen（美国圣地亚哥）	TLR-LRNA-40
B 型 CpG 寡核苷酸ODN1826 （1 μM）	InvivoGen（美国圣地亚哥）	11B16-MM
TRIzol	Invitrogen（加拿大安大略省伯灵顿）	15596-026
20 G 和 23 G 针	BD 美国（新泽西州）
剪刀
镊
50 ml 锥形管置于冰上	Sarstedt（美国马萨诸塞州牛顿）	62.547.205
红细胞裂解缓冲液	Sigma-Aldrich，（密苏里州圣路易斯）	R7757-100ML
冷冻离心
血细胞计数器
F4/80 抗体	BIO-RAD（CA，USA）
CD16/CD32 抗体	Pharmingen，{Mississauga，ON，CA）	553141
流式细胞仪	库尔特 Epics Elite 计数器，库尔特，（海厄利亚，佛罗里达州，美国）
1.5 ml Eppendorf 管	Axygen Scietific（加利福尼亚州，美国）	3516
氯仿	费舍尔科学（安大略省，加拿大）	UN1888
异丙醇	JT Baker（宾夕法尼亚州，美国）	70566
75% 乙醇（在 DEPC 处理过的水中）	商用酒精（QC，加拿大）	17394
0.01% 焦碳酸二乙酯 （DEPC） 处理过的水（静置过夜并高压灭菌）	Sigma-Aldrich，（密苏里州圣路易斯）	216.542.8Omniscript
RT-PCR 系统	Qiagen，（加拿大安大略省密西沙加）	205113
Rotor Gene 3000	Montreal Biotech，（加拿大魁北克省柯克兰）
QuantiTect SYBR Green I PCR 试剂盒	Qiagen（加拿大安大略省密西沙加）	204141