我们介绍了在小鼠疫苗接种模型中，利用纳米颗粒免疫后，通过整体动物成像和基于流式细胞术的技术来监测抗原特异性CD8+ T细胞扩增的方法。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
传统的疫苗佐剂（如铝盐）诱导的 CD8+ T 细胞反应较弱。为应对疫苗研发中的这一主要挑战，研究人员已设计出多种纳米颗粒系统，通过模拟病原体的特性，以改善抗原向引流淋巴结的递送，并增强抗原呈递细胞对抗原的摄取，从而开发出更有利于诱导抗原特异性 CD8+ T 细胞反应的新型疫苗制剂。本文中，我们描述了一种被称为“病原体模拟”纳米颗粒系统的合成方法，即层间交联多层囊泡（ICMVs），该系统可作为有效的疫苗载体，用于共递送亚单位抗原和免疫刺激剂，并有效激发强烈的细胞毒性 CD8+ T 淋巴细胞（CTL）反应。我们介绍了利用动态光散射和泽塔电位分析仪对疫苗纳米颗粒的流体动力学尺寸和表面电荷进行表征的方法，并提供了一种基于共聚焦显微镜的实验流程，用于分析纳米颗粒介导的抗原向引流淋巴结的递送情况。此外，我们展示了一种新的活体生物发光成像技术，该技术通过将表达荧光素酶的抗原特异性 CD8+ T 细胞过继转移至受体小鼠，随后进行纳米颗粒疫苗接种，从而实现对 CTL 扩增和迁移模式的无创、实时监测。我们还描述了四聚体染色及外周血单个核细胞的流式细胞术分析方法，用于对接受纳米颗粒疫苗接种的小鼠体内内源性 T 细胞反应进行长期定量评估。
引言
传统的疫苗研发主要采用试错法的经验性方法。然而，随着近年来大量生物材料的发展以及免疫激活分子决定因素的发现，现在已有可能基于病原体提供的生物物理和生化信号，理性设计疫苗制剂1,2。特别是，多种颗粒型药物递送平台已被研究作为疫苗载体，因其可同时负载亚单位抗原和免疫刺激剂，保护疫苗组分免于降解，并增强其向淋巴结（LNs）内抗原呈递细胞（APCs）的共递送，从而最大化免疫刺激与激活效果3-5。在本报告中，我们描述了一种“模拟病原体”的纳米颗粒系统——层间交联多层囊泡（ICMVs）的合成方法。该系统此前已被证明是一种高效的疫苗平台，可在全身和黏膜组织区室中诱导强烈的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和体液免疫应答6-9。特别是，与使用传统佐剂（例如，铝盐和Montanide）相比，ICMV疫苗接种显著提高了针对疟疾抗原的血清IgG水平7，并在小鼠模型中对肿瘤细胞和病毒感染挑战诱导出强效的CTL应答9。在此，以ICMVs作为模型疫苗纳米颗粒系统，我们介绍了疫苗纳米制剂的表征方法，包括粒径与zeta电位测定，以及利用冷冻组织切片的共聚焦成像技术追踪颗粒向引流淋巴结（dLNs）的转运过程7。此外，我们展示了一种基于整体动物成像的方法，用于分析在过继转移表达荧光素酶的抗原特异性CD8+ T细胞后，小鼠体内CTL应答的扩增情况9,10。最后，我们描述了通过四聚体染色外周血单个核细胞（P....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本方案中描述的所有实验均经密歇根大学动物使用与护理委员会（UCUCA）批准，并依照既定的政策与指南进行。
1. 共载蛋白抗原和佐剂分子的ICMV合成与表征
- 以1:1的摩尔比混合1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱（DOPC）和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[4-(p-马来酰亚胺基苯基)丁酰胺]（MPB）溶于氯仿中，保持每批总脂质含量为1.26 µmol（即， 500 µg DOPC 和 630 µg MPB 置于一个 20 ml 玻璃小瓶（直径 = 28 mm，高度 = 61 mm）中。
- 添加脂溶性药物，例如单磷酰脂质A（MPLA）或脂溶性染料（例如， DiD）加入脂质溶液中，使其达到所需浓度。用高纯氮气吹扫以彻底去除有机溶剂，并将样品置于真空环境中过夜。
- 通过加入含有水溶性药物的200 µl 10 mM bis-tris丙烷（BTP，pH 7.0）缓冲液水合脂质膜例如， 蛋白质抗原）。在室温下每10分钟涡旋振荡10秒，持续1小时。
- 将玻璃小瓶中的内容物转移至1.5 ml微量离心管中，将样品置于冰水浴中，使用125 W/20 kHz探头式超声破碎仪，在40%强度下持续超声处理5分钟。
- 向每批样品中加入 4 µl 的 150 ....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
ICMV 的合成步骤如图16所示。简而言之，在亲水性药物存在下，对含有任何亲脂性药物或荧光染料的脂质膜进行水化。加入二价阳离子（如 Ca2+），促使带负电荷的脂质体融合形成多层囊泡。加入二硫醇交联剂（如 DTT），使相邻脂质层上的马来酰亚胺功能化脂质“交联固定”，最后通过与巯基化 PEG 结构的反应淬灭残留的外部马来酰亚胺基团。每批样品可取少量直接用于质量控制检测，使用动态光散射（DLS）和zeta电位分析系统测定粒径、多分散系数和zeta电位。所得颗粒相对均一，包载卵清蛋白（OVA）的颗粒平均粒径为 130 ± 20 nm，多分散系数为 0.22 ± 0.02，zeta电位为 -54 ± 3 mV（图1B 和 1C）。以颗粒干重计，典型产率约为 50%6。
利用上述方案，可将荧光标记的蛋白抗原和荧光脂溶性染料共同装载到ICMVs中，从而实现抗原和纳米颗粒在体内的递送过程可视化。in vivo。为比较可溶性抗原与ICMVs中抗原递送.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本文提供的实验方案描述了一种新型脂质基纳米颗粒系统（称为ICMVs）的合成与表征，并阐述了验证基于纳米颗粒的疫苗制剂诱导抗原特异性CD8+ T细胞反应有效性的过程。ICMV的合成完全在水相条件下完成，相较于其他常用的聚合物纳米颗粒系统（例如，聚乳酸-羟基乙酸共聚物颗粒），这是一个显著优势，因为后者通常需要使用有机溶剂进行制备，往往导致蛋白质抗原抗原性的丧失29,30。此外，ICMVs具有高度稳定性，并能够包封疏水性和亲水性分子6，从而可实现抗原与佐剂共递送至抗原呈递细胞（APCs）内的同一细胞内区室31,32。本文以ICMVs作为模型疫苗纳米颗粒，概述了以下实验步骤：（1）纳米颗粒的合成与表征；（2）纳米颗粒向引流淋巴结（dLNs）迁移的验证；以及利用（3）非侵入性生物发光成像技术和（4）外周血单个核细胞（PBMCs）的肽-MHC四聚体染色法检测抗原特异性CD8+ T细胞反应的诱导情况。
确保纳米颗粒在不同批次间的合成具有一致性至关重要，尤其是粒径和表面电荷，因为这些因素会显著影响纳米颗粒在体内的淋.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
Perkin Elmer 提供了本文发表期间产生的出版费用。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院资助项目1K22AI097291-01以及美国国立卫生研究院转化科学促进中心资助奖项UL1TR000433支持。我们还感谢麻省理工学院的Darrell Irvine教授和弗雷德·哈钦森癌症研究中心的Matthias Stephan教授在疫苗纳米颗粒及OT-I/Luc转基因小鼠的初期工作中所做出的贡献。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1. 共载蛋白抗原与佐剂分子的ICMV合成与表征 | |||
| 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[4-(p-马来酰亚胺苯基)丁酰胺]（钠盐）（MPB） | Avanti Polar Lipids, INC. | 870012 | |
| 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DOPC） | Avanti Polar Lipids, INC. | 850375 | |
| 单磷酸脂质A（合成）（PHAD™）（MPLA） | Avanti Polar Lipids, INC. | 699800 | |
| 20 ml 玻璃小瓶 | Wheaton | 0334125D | |
| Symphny 真空干燥箱 | VWR | 414004-580 | |
| 卵清蛋白（OVA） | Worthington | 3054 | |
| 双-Tris丙烷（BTP） | Fisher | BP2943 | |
| Q125 超声波破碎仪（125 W/20 kHz） | Qsonica | Q125-110 | |
| 二硫苏糖醇（DTT） | Fisher | BP172 | |
| 2 kDa 巯基化聚乙二醇（PEG-SH） | Laysan Bio | MPEG-SH-2000-1g | |
| Malvern ZetaSizer Nano ZSP | Malvern | ||
| ZetaSizer 比色皿 | Malvern | DTS1070 | |
| 2. 利用共聚焦显微镜检测荧光标记ICMV的淋巴结引流 | |||
| 1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青-4-氯苯磺酸盐（DID） | Life Technologies | D-7757 | |
| Alexa Fluor 555-琥珀酰亚胺酯（AF555-NHS） | Life Technologies | A37571 | |
| Tissue-Tek OCT冷冻包埋介质 | VWR | 25608-930 | |
| 组织冷冻模具 | VWR | 25608-922 | |
| 3. 通过整体动物成像监测纳米颗粒疫苗接种后抗原特异性、表达荧光素酶的CD8+ T细胞扩增 | |||
| C57BL/6小鼠 | Jackson | 000664 | |
| 白化C57BL/6小鼠 | Jackson | 000058 | |
| OT-1 C57BL/6小鼠 | Jackson | 003831 | |
| 70 μm 尼龙滤网 | BD | 352350 | |
| EasySep™ 小鼠CD8+ T细胞分离试剂盒 | StemCell | 19853 | |
| IVIS® 整体动物成像系统 | Perkin Elmer | ||
| 4. 外周血单个核细胞（PBMCs）的肽-MHC四聚体染色用于抗原特异性CD8+ T细胞的流式细胞分析 | |||
| K2EDTA管 | BD | 365974 | |
| ACK裂解缓冲液 | Life Technologies | A10492-01 | |
| 抗CD16/32 Fc阻断剂 | Ebioscience | 14-0161-86 | |
| H-2Kb OVA四聚体 | MBL | TS-5001-1C | |
| 抗CD8-APC | BD | 553031 | |
| 抗CD44-FITC | BD | 553133 | |
| 抗CD62L-PECy7 | Ebioscience | 25-0621-82 | |
| 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI） | SIGMA | D8417-10MG | |
| CyAn流式细胞仪 | Beckman Coulter | ||
| FlowJo软件 | FlowJo |
参考文献
- Irvine, D. J., Swartz, M. A., Szeto, G. L. Engineering synthetic vaccines using cues from natural immunity. Nature materials. 12, 978-990 (2013).
- Moon, J. J., Huang, B., Irvine, D. J. Engineering nano- and microparticles to tune immunity. Advanced materials. 24....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
