La sintesi di anticorpi monoclonali umani è il primo passo negli studi volti a svelare i meccanismi fisiopatologici delle risposte immunitarie mediate da auto-anticorpi. Abbiamo sviluppato un protocollo per generare anticorpi monoclonali ricombinanti di immunoglobuline G (IgG) umane da cellule B selezionate per sangue, tra cui l'isolamento delle cellule B, il clonaggio di anticorpi e la sintesi in vitro.
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Articolo metodologico
Generazione di ricombinante umano IgG anticorpi monoclonali da immortalizzate cellule ordinati B
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Trovare nuovi metodi per generare anticorpi monoclonali umani è un campo di ricerca attivo che è importante sia per le scienze di base che per quelle applicate, compreso lo sviluppo di immunoterapie. Tuttavia, le tecniche per identificare e produrre tali anticorpi tendono ad essere difficili e talvolta la coppia di anticorpi a catena pesante e leggera è dissociata. Qui, descriviamo un protocollo relativamente semplice e diretto per produrre anticorpi monoclonali ricombinanti umani da cellule mononucleate del sangue periferico umano utilizzando l'immortalizzazione con il virus di Epstein-Barr (EBV) e l'attivazione del recettore Toll-like 9. Con un'adeguata colorazione, le cellule B che producono anticorpi possono essere isolate per la successiva immortalizzazione ed espansione clonale. I trascritti anticorpali prodotti dai cloni di cellule B immortalizzate possono essere amplificati mediante PCR, sequenziati come corrispondenti coppie di catene pesanti e leggere e clonati in vettori di espressione di immunoglobuline. Gli anticorpi ottenuti con questa tecnica possono essere strumenti potenti per studiare le risposte immunitarie umane rilevanti, inclusa l'autoimmunità, e creare le basi per nuove terapie.
Introduzione
L'obiettivo di questo articolo è quello di descrivere in dettaglio una metodologia per generare e caratterizzare gli anticorpi monoclonali IgG umane ottenute da cellule umane mononucleate del sangue periferico (PBMC).
L'interesse per lo studio anticorpi umani si è sviluppata in diversi campi di ricerca. In particolare, molti gruppi di ricerca sono interessati alla patologia causata da autoanticorpi 1-3. Abbiamo clonato e caratterizzato patogeni auto-anticorpi 1. Lo studio di auto-anticorpi può aiutare a identificare i loro obiettivi e per lo sviluppo di strategie terapeutiche, ad esempio, l'uso d....
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Protocollo
Il consenso informato è stato ottenuto dai partecipanti allo studio. Lo studio è stato approvato dal comitato etico istituzionale.
1. Isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC)
- Centrifugare 25 ml di sangue eparinizzato dei partecipanti a 900 xg per 15 min, non appena possibile dopo l'estrazione del sangue. Se c'è meno sangue, ridimensionare i reagenti di conseguenza. Eseguire tutti i passi successivi in un cappuccio.
- Trasferire il siero in una provetta pulita. Può essere utilizzato nelle fasi successive per il congelamento PBMC o in caso di pazienti autoimmuni, per testare auto-anticorpi....
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Risultati
Il gating ordinamento dopo colorazione cellule CD22 positive e IgG è mostrato in Figura 1 In questa immagine la zona delle cellule doppio positive -. È selezionata per ordinare tutte queste cellule in un tubo separato - cellule B che producono anticorpi IgG. Nell'analisi, circa l'1% dei PBMC totali corrispondono a questa doppia popolazione positiva. Il numero di cellule filtrate ottenute dipenderà dal numero di cellule ottenute nella sezione 1.
I diversi risultati do.......
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Discussione
In questo manoscritto, tutti i passaggi per la generazione di anticorpi IgG da PBMC umane sono presentati in dettaglio. Questo protocollo comprende alcuni vantaggi rispetto alle tecniche precedentemente pubblicati. Uno dei vantaggi è che gli anticorpi prodotti mantiene le catene pesanti e leggere corrispondenti alla coppia originale nel clone cellulare B. L'identificazione di anticorpi IgG può essere fatto in qualsiasi tipo di donatore umano, e non vi è alcuna necessità di esacerbazione della risposta immunitaria gr.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Contratto di ricerca Miguel Servet (ISCIII CD14 / 00032) a (GN-G.). Fellowship dalla Organizzazione olandese per la ricerca scientifica "Graduate School of Translational Neuroscience Programma" (022005019) a (CH).
Le sovvenzioni da parte Prinses Beatrix Fonds (Progetto WAR08-12) e dell'Association Française contre les Myopathies a (PM-M.); nonché da un Veni Fellowship dell'Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (916.10.148) una borsa di studio della Fondazione cervello dei Paesi Bassi (FS2008 (1) -28) e il Prinses Beatrix Fonds (Progetto WAR08-12) (a ML ).
Ringraziamo Jozien Jaspers per il ....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Histopaque-1077 | Soluzione Sigma-Aldrich | 10771 | contenente polisaccarosio e diatrizoato di sodio |
| FACSAria II cell sorter | BD Bioscienze | ||
| 96 piastre per micro pozzetti con fondo a U | Costar | 3799 | |
| Advanced Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medio | Gibco, Life Technologies | 12633-020 | |
| surnatante contenente EBV al 30% v/v della linea cellulare B95-8. | ATCC | CRL-1612 | 3,4 x 108 copie/ml |
| CpG2006 | Celle Invivogen | ODN 7909 | |
| Wi38 | Sigma-Aldrich | 90020107 | |
| Interleuchina-2 | Roche | ||
| piastre ELISA | Greiner Bio-One, Microlon | 655092 | |
| AffiniPure F(ab')2 Frammento di capra Anti-Human IgG, Fcγ Frammento specifico (non coniugato) | Jackson ImmunoResearch | 109-006-008 | |
| 4% latte in polvere scremato (Blotting Grade Blocker) | Biorad | 170-6404 | |
| IgG umane | Sigma | I 2511 | IgG UMANE purificate Immunoglobulina, 5,6 mg/ml |
| F(ab)2 IgG antiumane Fcγ [coniugato con perossidasi (PO)] | Jackson ImmunoResearch | 109-036-008 | |
| Lettore ELISA (Perkin Elmer 2030) | Perkin Elmer | 2030-0050 | |
| AffiniPuro IgM anti-umano di coniglio coniugato con perossidasi, Fc5µ | Jackson ImmunoResearch | 309-035-095 | |
| Sistema di sintesi diretta del cDNA delle cellule SuperScript III | Invitrogen | 18080-200 | |
| Applied Biosystems (ABI) GeneAm PCR System 2700 | Applied Biosystems | ||
| Kit di isolamento dell'RNA ad alta purezza | Kit | Roche 11828665001 | |
| Promega | A3500 | ||
| Ricombinante Taq DNA Polimerasi | TAKARA | R001A | |
| Primer (2 μ l) | Sigma | ||
| Agarosio Ultrapuro | Invitrogen | 16500-500 | |
| 100 bp ladder | Invitrogen | 15628-019 | |
| Quantità Uno 4.5.2 (Gel Doc 2000) | Biorad | 170-8100 | |
| QIAquick PCR kit di purificazione | QIAGEN | 28106 | |
| BigDye Terminator v3.1 kit di sequenziamento del ciclo | Applied Biosystems | 4337455 | |
| piastra di reazione da 0,1 ml (MicroAMP Optical 96-well) | Applied Biosystems | 4346906 | |
| Analizzatore genetico ABI300 | Applied Biosystems | 4346906 | |
| DH5&alfa; cellule competenti (E. coli) | Invitrogen | 18263-012 | |
| pFUSEss-CHIg-hG1 (4.493 bp) | Invivogen | pfusess-hchg1 | |
| pFUSEss-CHIg-hG4 (4.484 bp) | Invivogen | pfusess-hchg4 | |
| pFUSE2ss-CLIg-hk (3.875 bp) | Invivogen | pfuse2ss-hclk | |
| pFUSE2ss-CLIg-hl2 (3.883 bp) | Invivogen | pfuse2ss-hcll2 | |
| Invitrogen | 15544-034 | ||
| LB integrato con Zeocin (Fast-Media Zeo Agar) | Invivogen | fas-zn-s | |
| Terrific Broth (TB) integrato con Zeocin (Fast-Media Zeo TB) | Invivogen | fas-zn-l | |
| DNA | Omega Bio Technology | D6942-02 | |
| Nanodrop (spettrofotometro ND1000) | Terreno | ||
| LB integrato con Blasticidina (Fast-Media Blast Agar) | Invivogen | fas-bl-s | |
| Terrific Broth (TB) integrato con Blasticidina (Fast-Media Blast TB) | Invivogen | fas-bl-l | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | 20.000 U/ml, in 10x NEBuffer EcoRI |
| NheI | New England Biolabs | R0131S | 10.000 U/ml, in 10x NEBuffer 2.1 |
| 2-Log Scala DNA | New England Biolabs | N3200S | 0.1-10.0 kb, 1.000 μ g/ml |
| XmaI | New England Biolabs | R0180S | 10.000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer |
| BsiWI | New England Biolabs | R0553S | 10.000 U/ml, in 10x NEBuffer 3.1 |
| AvrII | New England Biolabs | R0174S | 5.000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer |
| FastAP Fosfatasi Alcalina Termosensibile | Thermo Scientific | EF0651 | 1 U/µ l, in 10x FastAP Buffer |
| DH5α cellule competenti | Invitrogen | 18263-012 | |
| PE Topo Anti-Human IgG | BD Pharmingen | 555787 | |
| anti-CD22, PerCP-Cy5.5, Clone: HIB22 | Fisher scientific | BDB563942 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | |
| BigDye Terminator v3.1 | Applied Biosystems | 4337455 |
Riferimenti
- Vrolix, K., et al. Clonal heterogeneity of thymic B cells from early-onset myasthenia gravis patients with antibodies against the acetylcholine receptor. J Autoimmun. 52, 101-112 (2014).
- Yamashita, M., Katakura, Y., Shirahata, S.
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Ristampe e permessi
