Eisenchlorid-induzierte Thrombose Mausmodell für Halsschlagader und Mesentery Vessel
Summary
The FeCl3 induced thrombosis model in mice is described herein. A method to monitor thrombus growth by intravital microscopy observation on a mesenteric vessel and by blood flow measurement in the carotid artery is presented.
Abstract
Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric chloride injury is now a well-established technique to rapidly and accurately induce the formation of thrombi in exposed veins or artery of small and large diameter. This model has played a key role in the study of the pathophysiology of thrombosis, in the discovery and validation of novel antithrombotic drugs and in the understanding of the mechanism of action of these new agents. Here, the implementation of this technique on a mesenteric vessel and carotid artery in mice is presented. The method describes how to label circulating leukocytes and platelets with a fluorescent dye and to observe, by intravital microscopy on the exposed mesentery, their accumulation at the injured vessel wall which leads to the formation of a thrombus. On the carotid artery, the occlusion caused by the clot formation is measured by monitoring the blood flow with a Doppler probe.
Introduction
Die Untersuchung der Mechanismen der Entstehung von Thrombosen und der Bewertung der Wirksamkeit der anti-thrombotischen Arzneimitteln zu erfordert etablierten experimentellen Tiermodellen. Großtiermodellen waren die ersten, verwendet werden, da sie große Schiffe mehr ähnlich wie beim Menschen als Nagetiere 1. Jedoch hohe Kosten, die größeren Einrichtungen erforderlich, und die Schwierigkeiten bei der Manipulation von ihnen genetisch sind große Nachteile auf ihre Verwendung und große Tiere werden nun bis zum späten präklinischen Studien beschränkt, sobald vorläufige Tests an Nagetieren haben aussagekräftige Ergebnisse 2 angegeben. Mit breiten Verfügbarkeit von transgenen und Knockout-Stämme und ihre geringe Größe, die die Menge des antithrombotischen Arzneimitteln zur in vivo Tests erforderlich minimiert werden Mäuse hauptsächlich für Thrombose Forschung eingesetzt. Daher wurden mehrere Modelle von thrombotischen Störungen bei Mäusen 3 entwickelt.
Viele etablierte Thrombose Modelle stören die intimeine Schicht der Gefässwand, gefolgt von der Belichtung der Unter endothelial extrazelluläre Matrix auf den Blutfluss Induktion der Bildung von Blutgerinnseln 4. Thromben können durch eine Exposition von Kollagen, die Blutplättchen-Aktivierung und / oder aus der Exposition der Gewebefaktor, der die Gerinnungskaskade aktiviert, löst 5 führen. Verschiedene Techniken werden dann verwendet, um die anfängliche Gefäßverletzung zu erreichen. Pierangeli et al. Entwickelten eine mechanische Zerstörung Modell mit einem Mikrochirurgie-Tool auf die Oberschenkelvene 6. Kikushi et al. Beschrieben ist ein Modell, das in der Verabreichung einer photoreaktiven Verbindung (Rose Bengal), die in der Lipiddoppelschicht von Endothelzellen und anschließend die spezifische Erregung der Gefäßwand von Interesse mit grünem Licht (540 nm) 7 akkumuliert besteht. Die Verletzung kann auch durch einen kurzen Impuls hoher Intensität Laserbeleuchtung 8 induziert werden. Eine andere Technik zum einen von der Halsschlagader von Ratten etabliertbesteht in der topischen Anwendung von Eisenchlorid (FeCl 3) 9. In diesem Fall werden die Behälter Denudation Ergebnisse aus freien Radikalen durch FeCl 3 erzeugt werden, die Lipidperoxidation und die Zerstörung von Endothelzellen 10 verursacht. Die Verletzung induziert die Expression von mehreren Adhäsionsmoleküle Auslösung Thrombozytenadhäsion und -aggregation sowie Leukozyten Rekrutierung. Es wurde gezeigt, daß Leukozyten, insbesondere Neutrophilen, spielen eine entscheidende Rolle bei der Aktivierung der Blutgerinnungskaskade, die zur Thrombose 11. Dieses Verfahren ist gut geeignet, um die Koagulationskaskade zu reproduzieren; Ermittler müssen bedenken, dass, in diesem Mausmodell, Thrombose ist in der Regel in gesunden Gefäßen induziert wohin Thrombose beim Menschen ist vor allem in erkrankten zB auftreten zu halten. atherosklerotischen Gefäßen.
Da dieses Modell ist sehr einfach zu implementieren und ist auch wirksam in Mäusen, ist es das meist genutzte Thrombose Modusl für kleine Tier in vivo-Studien. Darüber hinaus bietet dieses Verfahren die Möglichkeit, die Bildung von Thromben in einer Vielzahl von Gefäßen herbeizuführen. Zielgefäße können Arterien oder Venen mit großem Durchmesser (Carotis, Oberschenkel, Hohlvene), oder mit kleinem Durchmesser (Gekröse, cremaster) 12-14 sein. In jüngerer Zeit wurde auch am proximalen mittleren Hirnarterie verwendet, um ein Modell der Hub 15 zu entwickeln. Die Thrombosebildung kann direkt durch Intravitalmikroskopie nach Fluoreszenz-Markierung der Blutplättchen und Leukozyten beobachtet oder durch Messung der Abnahme des Blutflusses mit einer Temperatursonde oder einer Dopplersonde 12,16,17 überwacht werden. Mehrere Parameter, wie Okklusionszeit Thrombusbildung Zeit oder Thrombus Größe kann dann untersucht werden. Die physiologischen Unterschiede zwischen den untersuchten Schiffen zu erheblichen Veränderungen in der erhaltenen Thromben. Daher Ermittler der Regel wählen die Zielgefäß nach den Parametern sie measu wollenre und / oder die Krankheit Einstellung sie zu untersuchen möchten. Typischerweise ist das Modell auf die Halsschlagader für die Forschung an Atherothrombose Zusammenhang mit Herzinfarkt oder Schlaganfall in der Erwägung, Studien über die Hohlvene sind für die Erforschung von tiefer Venenthrombose relevanter mehr relevant. Die Zugänglichkeit der verschiedenen Gefäßen bestimmt auch die verwendet werden, um das Wachstum zu messen Thrombus Verfahren. Zum Beispiel sind die mesenterialen Gefäße leicht zugänglich macht dieses Modell auch für intravitalmikroskopischen Beobachtung und der Untersuchung der Dynamik von Thrombusbildung geeignet. Die Halsschlagader ist weniger zugänglich, aber größere ermöglicht Blutflussmessungen und bieten ein hervorragendes Modell, um okklusiven Thrombose zu studieren.
Das Eisenchlorid induzierten Thrombosemodell hat enorme Fortschritte im Verständnis dieser Krankheit zur Verfügung gestellt. Es wurde in vielen Studien, die die Rolle der von Willebrand-Faktor bei Thrombosebildung 18,19 verwendet. In Kombination mit genetischen modifizierung Techniken hat sich die Identifizierung der vielen spezifischen Gens in thrombotischer Erkrankungen beteiligt erlaubt. Lamrani et al. haben beispielsweise gezeigt, daß eine Knock-in-der JAK2 V617F Gen mit einer Beschleunigungs Bildung instabiler Gerinnsel 20 verbunden. Zhang et al. Haben die physiologischen Auswirkungen der P2Y12- Plättchenrezeptor untersucht und gezeigt, dass nur transgene Mäuse, welche spezifisch diesen Rezeptor der Blutplättchen zeigten eine schnelle und stabile Thrombusbildung in Mesenterialarterie mit FeCl 3 21 verletzt. Die wichtige Rolle von Gewebetyp-Plasminogen-Aktivator (tPA) und Urokinase-Plasminogen-Aktivator (uPA) der Fibrinabbauprodukte Verfahren ist auch bei diesem Verfahren 22 untersucht worden. Weiterhin stellt dieses Modell auch eine einfache und genaue Methode zur Prüfung der fibrinolytischen Kapazitäten vieler neuer Medikamente in vivo. Zum Beispiel haben Wang et al. Dieses Modell für th verwendete präklinischen Validierung eines neuen rekombinanten Plasminogenaktivator gegen aktivierte Plättchen 23 ausgerichtet. Diese Methode ermöglichte auch die Validierung von therapeutischen Proteinen aus dem Speichel von Zecken, Vampirfledermäuse und Mücken oder aus dem Gift von Schlangen mit spezifischen Identifizierung des Ziel 24-27 isoliert. Diese Beispiele zeigen die Vielseitigkeit des Ferrichlorid-Modell. In diesem Artikel konzentrieren wir uns auf zwei Methoden und Studieneisenchlorid induzierte Thrombose auf zwei verschiedenen Behältertyps; mesenterialen Gefäß und Halsschlagader.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Eisenchlorid induzierte Thrombose-Modell ist eine hervorragende Forschungswerkzeug. Wie in dieser Studie gezeigt, ist es sehr einfach zu implementieren und in Kombination mit Intravitalmikroskopie oder Doppler-Durchflussmesser verwendet wird, eine gute Echtzeit-Überwachung der Thrombusbildung liefert sie. Einstellen der Belichtungszeit und der Konzentration von FeCl 3, sondern bietet auch die Möglichkeit, entweder nicht-okklusiv oder okklusive Thromben erzeugen.
Jedoch hat d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten sich an den technischen Support von Joy Yao und Dr. Karen Alt sowie Mittel aus dem NHMRC und NHF anzuerkennen.
Materials
| Whatman chromatography paper | GE Healthcare | 3030917 | |
| Iron (III) chloride 40 % (w/v) | VWR | 24212.298 | |
| Rhodamine 6G | Sigma | R4127 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX81 | |
| Digital black-and-white camera | Olympus | XM10 | |
| Doppler flowmeter | Transonic | TS420 | |
| Nano-doppler flow probe | Transonic | 0.5 PBS | |
| Ketamine | Hospira | 0409-2051-05 | |
| Xylazine (Rampun) | Bayer | 75313 | |
| Petri dish | Sarstedt | 82.1472 | |
| Insulin syringe (29 G) | BD Ultra-Fine | 326103 | |
| Cotton tipped applicators | BSN medical | 211827A | |
| Dynek dysilk sutures | Dynek Pty Ltd | CS30100 | |
| Dulbecco's phosphate buffer saline (PBS) | Gibco life technologies | 21600-069 | |
| Heating pad | Kirchner | T60 |
References
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