Introduction
Die Untersuchung der Mechanismen der Entstehung von Thrombosen und der Bewertung der Wirksamkeit der anti-thrombotischen Arzneimitteln zu erfordert etablierten experimentellen Tiermodellen. Großtiermodellen waren die ersten, verwendet werden, da sie große Schiffe mehr ähnlich wie beim Menschen als Nagetiere 1. Jedoch hohe Kosten, die größeren Einrichtungen erforderlich, und die Schwierigkeiten bei der Manipulation von ihnen genetisch sind große Nachteile auf ihre Verwendung und große Tiere werden nun bis zum späten präklinischen Studien beschränkt, sobald vorläufige Tests an Nagetieren haben aussagekräftige Ergebnisse 2 angegeben. Mit breiten Verfügbarkeit von transgenen und Knockout-Stämme und ihre geringe Größe, die die Menge des antithrombotischen Arzneimitteln zur in vivo Tests erforderlich minimiert werden Mäuse hauptsächlich für Thrombose Forschung eingesetzt. Daher wurden mehrere Modelle von thrombotischen Störungen bei Mäusen 3 entwickelt.
Viele etablierte Thrombose Modelle stören die intimeine Schicht der Gefässwand, gefolgt von der Belichtung der Unter endothelial extrazelluläre Matrix auf den Blutfluss Induktion der Bildung von Blutgerinnseln 4. Thromben können durch eine Exposition von Kollagen, die Blutplättchen-Aktivierung und / oder aus der Exposition der Gewebefaktor, der die Gerinnungskaskade aktiviert, löst 5 führen. Verschiedene Techniken werden dann verwendet, um die anfängliche Gefäßverletzung zu erreichen. Pierangeli et al. Entwickelten eine mechanische Zerstörung Modell mit einem Mikrochirurgie-Tool auf die Oberschenkelvene 6. Kikushi et al. Beschrieben ist ein Modell, das in der Verabreichung einer photoreaktiven Verbindung (Rose Bengal), die in der Lipiddoppelschicht von Endothelzellen und anschließend die spezifische Erregung der Gefäßwand von Interesse mit grünem Licht (540 nm) 7 akkumuliert besteht. Die Verletzung kann auch durch einen kurzen Impuls hoher Intensität Laserbeleuchtung 8 induziert werden. Eine andere Technik zum einen von der Halsschlagader von Ratten etabliertbesteht in der topischen Anwendung von Eisenchlorid (FeCl 3) 9. In diesem Fall werden die Behälter Denudation Ergebnisse aus freien Radikalen durch FeCl 3 erzeugt werden, die Lipidperoxidation und die Zerstörung von Endothelzellen 10 verursacht. Die Verletzung induziert die Expression von mehreren Adhäsionsmoleküle Auslösung Thrombozytenadhäsion und -aggregation sowie Leukozyten Rekrutierung. Es wurde gezeigt, daß Leukozyten, insbesondere Neutrophilen, spielen eine entscheidende Rolle bei der Aktivierung der Blutgerinnungskaskade, die zur Thrombose 11. Dieses Verfahren ist gut geeignet, um die Koagulationskaskade zu reproduzieren; Ermittler müssen bedenken, dass, in diesem Mausmodell, Thrombose ist in der Regel in gesunden Gefäßen induziert wohin Thrombose beim Menschen ist vor allem in erkrankten zB auftreten zu halten. atherosklerotischen Gefäßen.
Da dieses Modell ist sehr einfach zu implementieren und ist auch wirksam in Mäusen, ist es das meist genutzte Thrombose Modusl für kleine Tier in vivo-Studien. Darüber hinaus bietet dieses Verfahren die Möglichkeit, die Bildung von Thromben in einer Vielzahl von Gefäßen herbeizuführen. Zielgefäße können Arterien oder Venen mit großem Durchmesser (Carotis, Oberschenkel, Hohlvene), oder mit kleinem Durchmesser (Gekröse, cremaster) 12-14 sein. In jüngerer Zeit wurde auch am proximalen mittleren Hirnarterie verwendet, um ein Modell der Hub 15 zu entwickeln. Die Thrombosebildung kann direkt durch Intravitalmikroskopie nach Fluoreszenz-Markierung der Blutplättchen und Leukozyten beobachtet oder durch Messung der Abnahme des Blutflusses mit einer Temperatursonde oder einer Dopplersonde 12,16,17 überwacht werden. Mehrere Parameter, wie Okklusionszeit Thrombusbildung Zeit oder Thrombus Größe kann dann untersucht werden. Die physiologischen Unterschiede zwischen den untersuchten Schiffen zu erheblichen Veränderungen in der erhaltenen Thromben. Daher Ermittler der Regel wählen die Zielgefäß nach den Parametern sie measu wollenre und / oder die Krankheit Einstellung sie zu untersuchen möchten. Typischerweise ist das Modell auf die Halsschlagader für die Forschung an Atherothrombose Zusammenhang mit Herzinfarkt oder Schlaganfall in der Erwägung, Studien über die Hohlvene sind für die Erforschung von tiefer Venenthrombose relevanter mehr relevant. Die Zugänglichkeit der verschiedenen Gefäßen bestimmt auch die verwendet werden, um das Wachstum zu messen Thrombus Verfahren. Zum Beispiel sind die mesenterialen Gefäße leicht zugänglich macht dieses Modell auch für intravitalmikroskopischen Beobachtung und der Untersuchung der Dynamik von Thrombusbildung geeignet. Die Halsschlagader ist weniger zugänglich, aber größere ermöglicht Blutflussmessungen und bieten ein hervorragendes Modell, um okklusiven Thrombose zu studieren.
Das Eisenchlorid induzierten Thrombosemodell hat enorme Fortschritte im Verständnis dieser Krankheit zur Verfügung gestellt. Es wurde in vielen Studien, die die Rolle der von Willebrand-Faktor bei Thrombosebildung 18,19 verwendet. In Kombination mit genetischen modifizierung Techniken hat sich die Identifizierung der vielen spezifischen Gens in thrombotischer Erkrankungen beteiligt erlaubt. Lamrani et al. haben beispielsweise gezeigt, daß eine Knock-in-der JAK2 V617F Gen mit einer Beschleunigungs Bildung instabiler Gerinnsel 20 verbunden. Zhang et al. Haben die physiologischen Auswirkungen der P2Y12- Plättchenrezeptor untersucht und gezeigt, dass nur transgene Mäuse, welche spezifisch diesen Rezeptor der Blutplättchen zeigten eine schnelle und stabile Thrombusbildung in Mesenterialarterie mit FeCl 3 21 verletzt. Die wichtige Rolle von Gewebetyp-Plasminogen-Aktivator (tPA) und Urokinase-Plasminogen-Aktivator (uPA) der Fibrinabbauprodukte Verfahren ist auch bei diesem Verfahren 22 untersucht worden. Weiterhin stellt dieses Modell auch eine einfache und genaue Methode zur Prüfung der fibrinolytischen Kapazitäten vieler neuer Medikamente in vivo. Zum Beispiel haben Wang et al. Dieses Modell für th verwendete präklinischen Validierung eines neuen rekombinanten Plasminogenaktivator gegen aktivierte Plättchen 23 ausgerichtet. Diese Methode ermöglichte auch die Validierung von therapeutischen Proteinen aus dem Speichel von Zecken, Vampirfledermäuse und Mücken oder aus dem Gift von Schlangen mit spezifischen Identifizierung des Ziel 24-27 isoliert. Diese Beispiele zeigen die Vielseitigkeit des Ferrichlorid-Modell. In diesem Artikel konzentrieren wir uns auf zwei Methoden und Studieneisenchlorid induzierte Thrombose auf zwei verschiedenen Behältertyps; mesenterialen Gefäß und Halsschlagader.
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Protocol
Alle Experimente mit Tieren wurden von der Alfred Medical Research and Education Precinct Tierethikkommission (E / 1534/2015 / B) freigegeben. Alle chirurgischen Manipulationen wurden unter Vollnarkose durchgeführt und die Tiere nicht Schmerzen können jederzeit auftreten. Alle beschriebenen Versuche sind keine Wiederherstellung.
1. Vorbereitung
- Geschnitten dünne Bänder aus Filterpapier (1 mm x 2 mm).
- Frisch herzustellen 2 Eisenchloridlösungen von 4% (w / v) bis 6% (w / v) in entionisiertem Wasser verdünnt. Vorbereitung Rhodamin 6G Lösung 0,3% in PBS, durch 0,22 um filtriert.
- Schneiden Sie ein kleines Stück (5 mm x 1 cm) von der weißen Plastikspritzen Wrapper.
2. Mesentery Arteriole Thrombusbildung durch Intravitalmikroskopie beobachtet
- Wiegen 10-12 Wochen alten männlichen C57BL / 6-Wildtyp-Maus und betäuben entsprechend mit einem Gemisch aus Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg), obwohl intraperitoneale Injektion. Überwachung der Narkosetiefe durch Reaktion auf Spitze, Schwanz und / oder Haut Prise, Reaktivität von Hornhaut und der Augenlid Prise, und Abwesenheit von Whisker-Bewegung. Falls erforderlich, Injizieren eine zweite Dosis von Ketamin (50 mg / kg) auf die Anästhesie des Tieres zu halten. Bewerben vet Salbe auf die Augen bis zur Trockenheit während der Narkose zu verhindern. Platzieren Sie die Maus in eine kleine Petrischale auf einem Heizkissen auf 37 ° C eingestellt platziert.
Hinweis: Auch wenn IP Injektion können in Schmerzen für die Tiere zur Folge haben, wird die Dauer dieser Beschwerden minimal (weniger als 3 sec) sein. Schmerzen und Beschwerden mit Injektionen verbunden sind, werden durch den Einsatz von erfahrenen und kompetenten Personal und entsprechenden Nadel (25 G) minimiert werden. Nach all den Verfahren, einschläfern alle Tiere mit einer Überdosis von Ketamin und Xylazin durch Genickbruch folgte. - Führen Sie eine Bauchmittelschnitt von ca. 3 cm in der Haut und schneiden Sie vorsichtig das Bauchfell.
- Positionieren Sie die Maus auf der Seite des Tieresri Schüssel, sanft exteriorisieren seinen Darm und sorgfältig verbreitete das Mesenterium mit 2 Wattestäbchen in ein geeignetes Gefäß an die Oberfläche der Petrischale zu bringen. Richtig zu trocknen mit einem zarten Wischer.
HINWEIS: Um die Bewegung der Mesenterialgefäße zu begrenzen, kann Papaverin verwendet, um Darm-Peristaltik hemmen. - Weichen Sie den Schwanz der Maus in warmem Wasser, um die Gefäße erweitern und injizieren 30 ul Rhodamin 6G (0,3%) in die Schwanzvene der Maus mit einer 29 G Spritze von Leukozyten und Blutplättchen zu kennzeichnen.
- Legen Sie die Petrischale unter einem inversen Mikroskop und konzentrieren sich auf die gewählte Arteriole mit der Hellfeldkanal.
- Tränken Sie ein Band aus Filterpapier mit 6% (w / v) Eisen (III) -chlorid und wenden Sie das Filterpapier auf der Arteriole mit zwei Zangen; die erste, die das Filterpapier, das zweite, um sanft drücken Sie ihn auf den Bereich von Interesse zu halten. Thrombusbildung zu beobachten in den ersten 10 sec nach der Abscheidung von dem Filterpapier.
HINWEIS: Es ist durchaus commauf, um die Mikrogefäß umgeben und die Genauigkeit der Abscheidung des Filterpapiers und der Druck sanft verletzen ist daher wichtig, dieses Problem zu begrenzen. - Beobachten Thrombusbildung durch Fluoreszenzmikroskopie (TRITC Kanal: Peakanregungs 557 nm Peakemission 576 nm), durch das Filterpapier. Beachten Sie die zirkulierenden Leukozyten und Blutplättchen, die das Rhodamin 6G und deren Aggregation in den Thrombus genommen ist daher leicht zu identifizieren.
- Nehmen Sie das Filterpapier nach 1 min der Einwirkung von Eisen (III) -chlorid und weiter, um die Bildung des Thrombus zu überwachen. Das Gefäß mit PBS waschen.
- Beobachten und notieren Sie die dynamische Bildung des Thrombus mit der Kennzeichnung von Thrombozyten und Leukozyten mit dem Rhodamin 6G hervorgehoben. Erfassen Sie die Bilder und messen Sie die Größe des Thrombus. Die hier präsentierten Bilder wurden mit einem invertierten Intravitalmikroskop erhalten, obwohl eine objektive 4X, in der TRITC Fluoreszenzkanal.
- Fach alle Verfahren, das Tier einschläfern mit einer Überdosis von Ketamin und Xylazin durch Genickbruch folgte.
3. Halsschlagader Thrombusbildung von Blutströmungsmessung Veranlagte
- Wiege eine 10-12 Wochen alte männliche C57BL / 6-Maus und betäuben entsprechend mit einem Gemisch aus Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg), obwohl die intraperitoneale Injektion. Bewerben vet Salbe auf die Augen bis zur Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
- Befestigen Sie die Maus unter einem Operationsmikroskop mit Klebeband an den Beinen, auf einem Heizkissen auf 37 ° C eingestellt.
- Machen Sie ein kleines Kissen aus einem Wischer und kleben Sie sie unter dem Kopf der Maus, um den Kopf ein wenig zu erhöhen. Verwenden Sie eine Fadenschlinge mit einer Zange, um die Schnauze nach unten ziehen (verwenden Sie die oberen Zähne). Dadurch wird der Bereich der Halsschlagader zum einfachen Zugriff ermöglichen.
- Führen Sie einen kleinen 5 mm tiefen Einschnitt der Haut direkt unterhalb des Kiefers, bis zum Brustbein.
- Präparieren Sie die fascia und Isolierung eines Fragments von der linken oder der rechten Arteria carotis communis oberhalb der Bifurkation.
- Vorsichtig einführen Pinzette in-zwischen der Arterie und der Nerv, sie zu trennen. Den Nerv läuft in der Nähe der Arterie stören nicht und berühren Sie zu viel von der Halsschlagader, wie es kann Schäden am Schiff verursacht. Isolieren eines Abschnitts von mindestens 5 mm von der Arterie.
- Trocknet den Bereich der Arterie richtig mit Wischern zu verhindern, dass eine Flüssigkeit mit der FeCl 3 stört.
- Stecken Sie den kleinen weißen Plastikteil unter dem isolierten Teil der A. carotis so der FeCl 3 nicht in das umliegende Gewebe zu tränken. Zu diesem Zweck, verwenden Sie eine zweite Zange, um das Stück zum ersten dann langsam den Kunststoff Papier unter der Arterie zu bringen gleiten.
- Tränken Sie ein Stück Filterpapier mit 4% (w / v) bzw. 6% (w / v) Eisenchlorid und legen Sie sie alle um die Arterie.
- Nach 3 min Belichtung, nehmen Sie das Filterpapier gründlich mit PBS und trocknen Sie den Bereich with Wischer.
- Setzen Sie den Doppler-Sonde um den Behälter an der verletzten Bereich und starten Sie die Aufnahme der Änderungen in Fluss. Im gesunden carotis von erwachsenen Mäusen ist die Strömung in der Regel etwa 1 ml / min. Achtung! Kontakt der Sonde mit Eisenchlorid wird die Sonde beschädigen so jeglichen Kontakt zu vermeiden. Die hier vorgestellten Daten wurden mit einem Transonic Systems Inc. Durchflussmesser, TS420 perivaskuläre Modul mit einer Nano-Doppler-Strömungssonde 0,5 PBS ausgestattet erhalten.
HINWEIS: Die Konzentration von Eisenchlorid kann die Kinetik der Thrombusbildung, was zu unterschiedlichen Verschlusszeiten ändern. Somit kann eine Belichtung mit 6% (w / v) Ferrichlorid ergibt einen schnelleren Okklusion als Einwirkung von 4% (w / v) Eisen-III-Chlorid. - Nach all den Verfahren, einschläfern alle Tiere mit einer Überdosis von Ketamin und Xylazin durch Genickbruch folgte und vorsichtig reinigen Sie den Doppler-Sonde.
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Representative Results
Die Leuchtstoffintravitalmikroskopie Beobachtung des Mesenterium wird die Ansammlung von Rhodamin 6G zeigen markierte Thrombozyten und Leukozyten entlang der Gefäßwand durch FeCl 3 verletzt. Die fortschreitende Bildung eines Teil Thrombusbildung wird in einem 200 & mgr; m Mesenterium Gefäß (Abbildung 1) überwacht. Ein Thrombus langsam auftaucht und eindeutig identifizierbar ist nach der ersten Minute der Exposition gegenüber FeCl 3 (Abbildung 1, t = 60 s). 40 s nach dem Entfernen des Filterpapiers mit FeCl 3 getränkt, die Thrombose schreitet rasch fort und wird schließlich an der Wand des gesamten betrachteten Behälterabschnitt vorhanden ist (Figur 1, t = 100 sec).
Abb. 1: Thrombus Wachstum von Fluorescent Intravitalmikroskopie auf einem Mesentery Vessel beobachteten Bilder wurden bei 15 sec aufgenommen, 60sec und 100 sec nach der Abscheidung des Filterpapiers mit 6% (w / v) FeCl & sub3; -Lösung eingeweicht. Das Filterpapier wurde nach 60 Sekunden der Belichtung entfernt. Leukozyten und Blutplättchen durch die Voreinspritzung von Rhodamin 6G markiertem (0,5% w / v). Rote Pfeile zeigen Thrombozyten / Leukozyten Aggregate. Maßstabsleiste 200 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Eine intra carotis Thrombus wird durch die Anwendung eines Filterpapiers in FeCl 3 -Lösung um einen isolierten Arteria carotis getränkt und die Veränderungen im Blutfluss stromabwärts von der Verletzung mit einer Doppler-Sonde (Figur 2) aufgenommen induziert. Eine Gesamt konstanten Blutfluss um 1,1 ml / min in den nicht-verletzten Arteria carotis gemessen. Nach 3 min Exposition des Schiffes mit einem Filterpapier in 4% eingeweicht (w / v) FeCl 3 -Lösung, o eine okklusive Thrombusmit einer Okklusion Zeit von 13 min und 30 s nach dem Beginn der Belichtungs btained. Nach 3 min Belichtung mit einem Filterpapier in 6% eingeweicht (w / v) FeCl 3 ist ein okklusiver Thrombus mit einer Okklusion Zeit von 9 min und 30 s nach dem Beginn der Belichtung erhalten.
Abbildung 2. Repräsentative Aufzeichnungen des Blutflusses durch die Halsschlagader nach FeCl 3 Verletzungen. Der Blutfluss wurde mit einem Doppler-Fluss-Sonde an der Halsschlagader nur stromabwärts von dem Filterpapier mit 4% (w / v) oder 6% (gemessen getränkt platziert w / v) FeCl 3. Das Filterpapier wurde nach 3 min der Belichtung entfernt. Als eine Kontrolle des Blutflusses durch Messen der gesunden Karotisarterie erhalten.
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Discussion
Das Eisenchlorid induzierte Thrombose-Modell ist eine hervorragende Forschungswerkzeug. Wie in dieser Studie gezeigt, ist es sehr einfach zu implementieren und in Kombination mit Intravitalmikroskopie oder Doppler-Durchflussmesser verwendet wird, eine gute Echtzeit-Überwachung der Thrombusbildung liefert sie. Einstellen der Belichtungszeit und der Konzentration von FeCl 3, sondern bietet auch die Möglichkeit, entweder nicht-okklusiv oder okklusive Thromben erzeugen.
Jedoch hat dieses Verfahren auch einige Einschränkungen. In der Halsschlagader, ist der Hauptnachteil, daß, obwohl die Okklusion Zeit effektiv geändert werden, bleibt die Reproduzierbarkeit des Modells zu schwach, um genau zu steuern Thrombus Größe Wachstumsrate 10. Mehrere Gruppen haben auf einer Standardisierung des Modells 28,29 arbeitete. Owens et al. schlug vor, dass zuverlässige und reproduzierbare Okklusion Zeit kann mit der Praxis und durch die Reduzierung alle Variationsfaktoren wie Alter von erhaltendie Mäuse, der genetische Hintergrund der Mäuse, die verwendete Anästhesie, die Technik für das Eisenchlorid Exposition und die Konzentration der Eisenchloridlösung 28. Die Dopplersonde selbst hat auch einige Einschränkungen mit einem gewissen Grad an Hintergrundsignal vorhanden, das die Bestimmung des Verschlusses beeinträchtigen kann. Der Blutfluss kann auch durch die Bildung instabiler Thromben verändert werden.
Auf der mesenterischen Behälter, können die Reproduzierbarkeit der Größe des Gefäßes, die mehr als die Halsschlagadern und dem Vorhandensein von Fett, das das Ausmaß der Verletzung können verringert variiert berührt. Es wurde berichtet, dass das erhaltene Thromben unterscheiden sich nach der Größe der Gefßwand Läsion zurückhalten kann Endothel Abwurf oder auch auf die glatten Muskelzellen der Media-Schicht 30. Die Laserbestrahlung Modell stellt eine gute Alternative der Eisenchlorid-Modell, die eine bessere Reproduzierbarkeit bietet 8. Es ist jedoch auf kleine Gefäße, die transparent genug, um das Eindringen des Lasers ermöglichen, sind begrenzt. Es sollte auch bemerkt werden, dass in diesem Modell, Endothelzellen werden nach der Eisenchlorid zerdrückt und es ist daher nicht geeignet für Untersuchungen über die Rolle von Endothelzellen. Jedoch ist es möglich, die Eisenchlorid durch Calciumionophor ersetzen, um eine schwächere Verletzung, auf die Aktivierung des Endothels 31 beschränkt zu erhalten.
Eine weitere Einschränkung dieses Modells ist, dass es nicht geeignet ist, um langfristige Entwicklung der Krankheit zu untersuchen. Um diese Anforderung zu erfüllen, haben Boulaftali et al. Rückenhautkammern, die die Überwachung des gleichen Thrombus über mehrere Wochen 32 ermöglichen entwickelt. Diese Technik ist besonders gut geeignet, um die Wirkung von Thrombolytika nach Thrombus Reife zu untersuchen. In dieser Studie wurde das Gerinnsel Alterung gefunden, um die lytische Wirkung einer rekombinanten Form tissu beeinträchtigene-Plasminogen-Aktivator, der derzeit der Goldstandard der Thrombolytika für den menschlichen Gebrauch.
Trotz einiger Nachteile, die in Betracht gezogen werden muss, ist die FeCl 3 Modell relevant für die Untersuchung der menschlichen Thrombose. Die Zusammensetzung des erhaltenen Thromben wurde am histologischen Schnitt und der Anwesenheit von Blutplättchen, Fibrin und rote Blutzellen wurden in der intra carotis Thromben 33 identifiziert wurden analysiert. Da außerdem atherothrombotic Störung angenommen wird, durch die Oxidation von Lipoproteinen eingeleitet werden, Induzierung der Gefäßverletzung obwohl ein Oxido-Reduktions-Reaktion der FeCl 3 Modell ist eher die Pathophysiologie der Krankheit beim Menschen als eine mechanische, photochemische oder Laser imitieren induzierte Schädigung 34.
Der Thrombus gebildet wenn Eisenchlorid wurde ebenfalls beschrieben empfindlich sowohl Antikoagulans und Anti-Thrombozyten-Arzneimittel ist. Heparin und Clopidogrel zum Beispiel wurden repüt den Okklusionszeit von Thromben in der Halsschlagader 29 ausgebildet erstrecken. Die Verabreichung einer rekombinanten Form von Hirudin hat die Thrombusbildung Zeit am Mesenterium Mikrovaskulatur 17 erheblich verlängert. Daher stellt die Eisenchlorid-Modell eignet sich Erkenntnisse Thrombose und ist ein sehr geeignetes Instrument für die präklinische Validierung neuer thrombolytischer, Antikoagulans und Thrombozytenaggregationshemmer.
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Acknowledgments
Die Autoren möchten sich an den technischen Support von Joy Yao und Dr. Karen Alt sowie Mittel aus dem NHMRC und NHF anzuerkennen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Whatman chromatography paper | GE Healthcare | 3030917 | |
| Iron (III) chloride 40% (w/v) | VWR | 24212.298 | |
| Rhodamine 6G | Sigma | R4127 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX81 | |
| Digital black-and-white camera | Olympus | XM10 | |
| Doppler flowmeter | Transonic | TS420 | |
| Nano-doppler flow probe | Transonic | 0.5 PBS | |
| Ketamine | Hospira | 0409-2051-05 | |
| Xylazine (Rampun) | Bayer | 75313 | |
| Petri dish | Sarstedt | 82.1472 | |
| Insulin syringe (29 G) | BD Ultra-Fine | 326103 | |
| Cotton tipped applicators | BSN medical | 211827A | |
| Dynek dysilk sutures | Dynek Pty Ltd | CS30100 | |
| Dulbecco's phosphate buffer saline (PBS) | Gibco life technologies | 21600-069 | |
| Heating pad | Kirchner | T60 |
References
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