方法論記事

新たに単離した糸球体の足細胞における単一チャネル分析とカルシウムイメージング

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DOI:

10.3791/52850

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2015年6月27日

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, Medical College of Wisconsin

責任著者： Alexander Staruschenko <staruschenko@mcw.edu>

この記事について

サマリー

足細胞の細胞内カルシウムレベルの変化は、糸球体の濾過機能を制御する最も重要な手段の一つです。ここでは、新たに単離された糸球体の足細胞におけるカルシウムの取り扱いと単一イオンチャネル活性をリアルタイムで検出できるハイスループットアプローチについて説明します。

要約

Podocytes(腎糸球体上皮細胞)は、糸球体透過性を調節し、糸球体構造を維持することが知られています。足細胞の損傷がタンパク尿と足の突起の衰退につながるため、さまざまな腎疾患の病因におけるこれらの細胞の重要な役割が確立されています。以前に報告されたように、さまざまな内因性物質が足細胞の細胞内Ca2+濃度に劇的な過負荷を引き起こし、おそらくアルブミン尿を引き起こす可能性があり、これはカルシウム伝導性イオンチャネルを介して起こる可能性があります。したがって、正常状態とさまざまな病理学的状態の両方で、足細胞のカルシウムの取り扱いを研究することが重要であるように思われました。しかし、利用可能な実験的アプローチは、培養細胞とトランスフェクション細胞にやや限定されたままです。それらはそのような研究のための優れた基本モデルを表していますが、本質的には糸球体の本来の環境から抽出されます。ここでは、新たに分離された全糸球体の一部として足細胞を研究する方法論について説明します。この調製物は、まだ毛細血管に付着している足細胞の機能的電位を保持しています。したがって、足細胞は糸球体ろ過装置の主要部分を保存する環境に留まります。本稿では、1)レシオメトリック共焦点蛍光顕微鏡によるカルシウム濃度変化のリアルタイム検出、および2)新たに単離された糸球体の足細胞における単一イオンチャネル活性の記録を可能にする2つの実験的アプローチについて詳しく説明します。これらの方法論は、糸球体の天然環境の利点を利用して、研究者がさまざまな薬剤の適用に応じた細胞内カルシウムの取り扱いの急激な変化を解決し、細胞内のカルシウムの基礎濃度を測定し(たとえば、疾患の進行を評価するため)、および単一イオンチャネルのレベルでカルシウムコンダクタンスを評価および操作することを可能にします。

概要

腎臓は、様々な物質のための恒常性バランスを維持し、総血圧を決定するようにして血液量を調節します。ハイパーまたは低血圧に至るまでに腎臓濾過、再吸収や分泌リードの障害または付随する病理学的状態は、最終的に腎臓移植を必要とする末期腎疾患を終了します。毛細血管内皮、基底膜および上皮細胞の単電池層- -スリットダイアフラムの完全性と機能1の維持に重要な役割を果たし足細胞、腎フィルタリング部（糸球体）は、3つの層からなります。選択透過性糸球体フィルタにおける機能不全は、蛋白尿などの巨大分子の尿損失の原因となります。種々の薬剤は、糸球体濾過障壁の完全性を決定し、それらの足細胞足突起の構造に影響を及ぼし得ます。

足細胞は、逮捕されるの維持に関与していますeruli濾過機能。これは、足細胞による不適切なカルシウム処理は、細胞損傷につながり、腎2,3の様々な形の進行に重要な役割を果たしていることが確立されています。したがって、細胞内カルシウム濃度の変化の直接測定を可能にするモデルの開発は、足細胞の機能の研究のための手段になります。単離された糸球体は、以前アルブミン反射係数の測定4および全細胞電気生理学的パッチクランプ測定5,6の積分携帯電流の評価を変更するなど、多くの研究で使用しました。本論文では、研究者は、薬剤の用途に応じて、細胞内カルシウム濃度の変化を測定し、細胞内カルシウムの基礎レベルを推定し、個々のカルシウムチャネルの活性を評価することを可能にするプロトコルを記述します。 Ratometricカルシウム濃度の測定値とパッチクランプelectrophysiologyはそれぞれ、足細胞及びチャネル内の活性細胞内カルシウム濃度の変化を決定するために使用しました。

プロトコル

動物の使用と福祉制度動物実験委員会（IACUC）によってレビューされ、承認されたプロトコル以下の実験動物の管理と使用に関するNI​​Hガイドに付着する必要があります。

1.腎臓フラッシュ

  1. （ただし、異なる年齢や性別の他の株を適切に変更して使用することができ、スプラーグドーリー株である示唆）8から12週齢の雄ラットを使用してください。
  2. IACUCプロトコルによって許可された手順に従って、動物を麻酔。麻酔深度を監視し、動物を検査します。手術の詳細な説明は、1.3で実行される- 1.8 Ilatovskaya らに記載されています7。
  3. 適切な麻酔の後、（長さ3インチまで）、腹部の正中切開を行い、温度制御手術台の上に動物を置き、大静脈と大動脈を発見。
  4. 腹腔と腸間膜動脈と腹部周りに結紮糸を挿入これらの上記の大動脈。連結しないでください。
  5. 腎動脈下の腹部大動脈を分析し、その周りに2合字を配置したが、合字の上に大動脈をクランプし、下糸を結ぶその後、​​連結していない鈍いです。
  6. クランプ以下（PBSを充填したシリンジポンプに取り付けられた）ポリエチレンPE50チューブを大動脈カテーテルを挿入し、第二の結紮糸でカテーテルを固定します。 、クランプを取り外し、ポンプをオンにし、腹腔動脈と大動脈および腸間膜を連結。すぐに圧力を緩和するために、腎静脈に切開します。
  7. /分6ミリリットルの速度で、2または3分間予備冷却PBSで大動脈を注入。
  8. 灌流、消費税を停止し、7腎臓をデカプセル化し、PBS溶液中に氷の上に置きます。 IACUCによって承認されたプロトコルに従って、動物を安楽死させます。

ラット糸球体の2の単離

  1. RPMI 1640中の5％BSAの新鮮な溶液30mlを準備します。
  2. カミソリの刃やはさみを使用して、両方の腎臓の皮質を単離し、その後、均一になるまでミンチ。この手順は、以前に記載されている7。
  3. スパチュラを用いて（5％BSA / RPMI溶液に予備浸漬）100メッシュのステンレス鋼篩を通して、前のステップの間に細分化した組織を押してください。フロースルー及び重力によって収集し、フロースルーを140メッシュのふるいを通過することを可能にします。
  4. 、フロースルー予め浸漬200メッシュの篩を用いて、140メッシュのふるいから収集をフィルタろ液を捨て、そして10でふるいの上部を洗っ - で沈降糸球体を収集するために準備されたBSA / RPMI溶液15mlふるいです。
  5. 最大20分間、チューブの底に糸球体の堆積物を15mlチューブに氷の上で糸球体を含むBSA / RPMI液を入れてみましょう。チューブの底に糸球体の濃縮が明らかに見られます。チューブ内の約2ミリリットルを残し、余分な溶液を除去します。

3.シングルチャネルパッチクランプエルectrophysiology

  1. MW7万でそれらをコーティングすることにより、5×5ミリメートルのカバーガラスチップを準備 - 15万ポリʟリジン、および乾燥させてください。カバーガラスあたりの水に0.01％の滅菌濾過した溶液を約30μLを使用してください。
  2. RTへの実験的なソリューションをウォームアップし、パッチクランプ室とピペットを埋めます。 TRPCチャネルの監視の場合、mMの中で、浴溶液を使用します。126のNaCl、1のCaCl 2、10 HEPES、2のMgCl 2、10グルコース、pHが7.4;ピペット：126のNaCl、1.5のCaCl 2、10 HEPES、10グルコース; pHは7.4。
    1. 阻害すること（10mMのTEA、チャンネル） - 100μMのCaを遮断するニフルム酸またはDIDS（2+活性化Clで：推奨される（内因性チャネルの活性をブロックするためにピペット溶液に阻害剤を追加し、研究に関連されていません大コンダクタンスの Ca 2+ -依存性K +チャネル ）、10 nmのイベリオトキシン（のCa 2+活性化K +チャネルを遮断するために）、10μMのニカルジピン（N型Caをブロックします直接パッチクランプ実験前2+チャネル））。
  3. 静かに糸球体を含む溶液を混合し、次いでポリʟリジンコートカバーガラスチップに約50μLを適用します。糸球体は、約5分間添付してみましょう。
  4. 浴溶液で予め充填されたパッチクランプ室に糸球体のガラスチップを移動します。付着していない糸球体の除去を確実にするために1分間、3ml /分の速度で室を灌流。
  5. セル接続モード7で、従来のパッチクランプ実験を行います。ガラスピペットを用いて（7から10MΩピペット抵抗）に、単離された糸球体の足細胞表面上に取り付けられたピペットは、 図2に示されている（穏やかな吸引を適用することにより、ピペットと足細胞膜との間に高抵抗シールを形成左）。
  6. セル付測定のために、8極ベッセルフィルタにより300 Hzの電流を低域通過。
  7. U6時間 - SEは最大4のパッチクランプ実験で糸球体を単離しました。氷の上で在庫糸球体の割合を保ちます。

足細胞の細胞内カルシウム濃度の4レシオメトリック共焦点蛍光測定

  1. コニカルチューブ0.5mlの（2.5で説明した）糸球体画分の500μLを置き、カルシウム色素のFuraレッド、AMとのFluo-4、AMを追加します。 2 mMのと（DMSOに溶解し、-20℃で保存）のFuraレッド、AMとのFluo-4、AM、それぞれの1 mMストック濃度を使用し、糸球体画分の500μlの各色素の2.5μLを使用します。直ちに染料の添加後、アルミニウムホイルでチューブを覆います。
  2. RTで1時間に少なくとも20分までのための回転シェーカー上に置いチューブ。
    注：薬理学的薬剤は、この工程の間に加えることができます。
  3. 、カバーガラスを準備するポリʟリジンでそれらをカバーし、70℃に加熱されたプレートのセットを使用して乾燥を可能にします。
  4. カルシウム色素のロードはのcompletたらeは、ポリʟリジンコートカバースリップの解決策を含む糸球体の100μLを適用し、それらを約5分間、表面に固執しましょう​​。撮影室に糸球体付きカバースリップをマウントし、（（さ）mmで含む：145のNaCl、4.5のKCl、2のMgCl 2、10 HEPES、pHは7.35）浴溶液で灌流除去するために3ミリリットル/分の速度で付着していない糸球体、残りの染料。
  5. 488 nmの励起波長および発光フィルタ（それぞれのFluo-4及びフラ赤25分の525と25分の650ナノメートル）の共焦点レーザー走査顕微鏡を設定します。所望の周波数と解像度にイメージングソフトウェアを設定します。
  6. 明視野で糸球体を検索し、その後、蛍光シグナルの検出をオンにします。信号の飽和を回避するために、各色素のためのレーザーの強さを調整します。直接ガラスに取り付けられている足細胞で焦点面を選択します。これは、薬物に応じて糸球体の収縮による影響を最小限に抑えますアプリケーション。希望の糸球体はよくガラスに接続されていることをダブルチェックしてください。
  7. 、選択の焦点面を撮像開始（高速のCa 2+過渡変化を可視化するために4秒に設定された周波数で512×512の画像を取る。高解像度画像のための60X / NA 1.4または類似の対物レンズを使用して）、関心のある薬物を適用および応答を記録します。
    1. （糸球体の表面に足細胞のイメージングを確保するため、可能な限りガラスの表面に近い）は、所望の焦点面を選択します。 FLUO4とFuraRedチャネル上の蛍光の強度を確認し、糸球体は明らかに明視野で見ていることを確認してください。
    2. 撮影を開始します。いずれかの薬剤の適用前に、レコードベースライン蛍光の少なくとも1分信号が安定していることを確認するために、（そこには突然のスパイクがされていないか、信号のフェージング）。
    3. マイクロピペットの助けを借りて、所望の薬を適用します。注意して、薬剤がよく拡散し、glomerに到達することができました確認してくださいウルス。必要に応じて静かに浴溶液を混合し、選択された焦点面を監視し、それがために薬物適用の焦点の外に移動しなかったことを確認してください。
    4. FLUO4とFuraRed信号用の蛍光強度の変化を記録します。記録信号がプラトーレベルに達するか、ピークに達し、その後ベースラインに戻るまで待機することにより、十分な長さであることを確認してください。必要に応じて任意の他の薬剤の溶液の変更や追加を行います。
    5. 記録を停止し、ソフトウェアのネイティブ形式でファイルを保存します。

カルシウム測定5.画像解析

  1. ネイティブND2形式で画像をインポートすることができNDユーティリティのプラグインを搭載したImageJのオープンソフトウェアで画像解析を実行します。
  2. イメージシーケンスをインポートします。チャンネルを分割し、hyperstackのグレースケールモードを使用するようにしてください。
  3. OへのImageJソフトウェアで分析→ツール→ROIマネージャパスに従ってくださいペンROIマネージャウィンドウ。 ROI Managerの楕円形選択ツール、「追加（T）」関数を使用して、興味のあるいくつかの領域（足細胞）を選択します。最後のROIとしては、バックグラウンドでエリアを選択します。 （保存→詳細）選択したROIを保存します。
  4. 分析のために選択されたチャンネルを含むウィンドウを強調表示します。 、ROI Managerでマルチ測定機能→詳細を使用して飛び出すの対話で「1行あたりのスライス」のボックスに印を付け、[OK]をクリックします。結果は結果ウィンドウで設定可能な形式で表示されます。→設定測定メニューオプションの結果に入り、「グレー値の平均」と各ROIのための画素強度値を計算選択し、で表示されます各ROIのための別々の列に結果ウィンドウ。
  5. 好適なデータ解析ソフトウェアに各チャネルの測定されたROIの輝度値（のFluo-4とのFuraレッド）をコピーします。各DATからのバックグラウンド強度値を減算しますポイント。
  6. 各時点でのFuraレッドチャネルへのFluo-4の強度の比を計算します。各ROIのためのCa 2+トランジェントのプロット散布/ラインポイント時間の変更。選択された糸球体の平均/ SE値を計算します。
    注：時間列は4.5で選択した撮影頻度に応じて設定する必要があります。

フルオ4蛍光シグナルを使用した6細胞内カルシウム濃度の計算

  1. 糸球体のサンプルを取り、4.7のステップに実験プロトコルを実行します。バックグラウンド蛍光を記録した後に浴溶液に、レコード蛍光強度の増加（10μMであるべき浴室中の最終濃度）イオノマイシンを加えます。強度が最大に達し、崩壊が始まると、蛍光8をクエンチする（最終濃度が5 mMのでなければならない）のMnCl 2を追加します。
  2. 6.1で得られたデータを分析します。従っのFluo-4 ROI信号強度値が得られるコピー好適な解析ソフトウェアによって5.1から5.5に記載されているプロトコルに。
  3. 式を使用して、ROIに対応する足細胞で（NMで）細胞内カルシウム濃度を計算します。
    figure-protocol-1
    K dはフルオ4（345 nM）をするための一定の予め決め解離であり、Fは、あなたが（ベースライン）のためのカルシウム濃度を計算している時点での強度であり、F min及びF maxはでの強度値であり、 （イオノマイシン適用後）と（のMnCl 2を有する）蛍光の消光後の最大カルシウム負荷の点、それぞれ（ 図3参照 ）。

結果

ここでは、足細胞内カルシウム濃度の急激な変化を測定するという問題に取り組んだ。 図1は、新しくの足細胞での高解像度ライブ蛍光共焦点イメージングおよび単一のイオンチャネル活性の記録を行うために設計された実験プロトコルの概略図を示します分離されたげっ歯類糸球体。ラットを麻酔した後に簡単に説明すると、腎臓は血液のそれらをクリアするためにPBSでフラッシュする必要があります。その後、腎臓を摘出し、デカプセル化し、糸球体は、差動ふるいにより腎皮質から分離されているされています。試料の一部がパッチクランプ分析のために採取することができ、残りは蛍光カルシウム色素のFluo-4、AMおよびフラレッドを装填することができ、共焦点レシオメトリックカルシウムイメージングを行うために、AM。

単一のイオンチャネル活性の電気生理学的測定は、糸球体を単離した後すぐに行うことができます。イオン茶の活動nnels両方の細胞付着したパッチクランプ法のホールセル構成で測定することができます。示されたアプローチの実現可能性を実証するには、単一のTRPCのようなカルシウムイオン伝導チャネル活性（ 図2）の記録です。さらに、それは、細胞透過性または受容体結合単一イオンチャネルのレベルの有足細胞におけるカルシウム流入に対する効果を試験するために薬物を適用することが可能です。

単一のイオンチャネル活性の評価を可能にする手法は、足細胞の機能を特徴づけることができる種々のデータを生成します。しかし、それは非常に細胞全体のレベルでのカルシウム濃度の変化を測定することによって補うことができます。そのような研究を行うために、新たに単離された糸球体は、ハイスループット共焦点イメージングのための蛍光色素を負荷しました。高い光学分解能では一度に複数の足細胞におけるカルシウム濃度をモニターすることが可能である。 図3は 、時間を示します足細胞内カルシウム濃度の変化を評価するために設計された典型的な実験のためのコースです。足細胞内の基底カルシウム濃度のFluo-4蛍光を評価しました。 1分（F）のための基礎信号強度を記録した後、イオノマイシンを塗布した後のMnCl 2によりクエンチしたピーク蛍光（Fの最大値 ） に到達させる（F minは留意されたいです）。 6.3の式によれば、実験の各時点でのFluo-4シグナルの強度は、セル内のカルシウムイオンの実際の濃度に換算することができます。グラフから分かるように、バックグラウンド（約400任意単位）での蛍光を意味する健康な非アポトーシス細胞の細胞内カルシウム濃度の正常範囲内にある140nmで、につながります。

記載されたアプローチの重要性と有用性は、急性カルシウムtransieを測定することができ、他のアプリケーションによって正当化されます種々の薬剤に応答した足細胞でNTS。 図4（a）は 10μmでATPを添加する前と後に（4.5で説明）2 mMのカルシウム含有溶液中でのFluo-4とフラレッドで染色したラット糸球体の代表的な画像を示しています。緑の劇的な増加に注意してください（のFluo-4 AM）（矢印でマークされた）足細胞の蛍光、およびフラ赤の蛍光の低下（赤擬似カラー）。 FuraRedがダウンしたのに対し、細胞内のカルシウム濃度は、4強度が上がるのFluo増加するFLUO4とFuraRedは、逆の方法IEの励起波長488nmでのカルシウム濃度の上昇を反映しています。それが原因でFuraRedの蛍光​​体の二重励起の性質が可能です。励起波長に依存して、蛍光の対応する増加または減少したカルシウム結合（波長420nm）、またはカルシウムを含まない（488 nm）の蛍光団のように振る舞うことができます。したがって、単独のレシオメトリックイメージングモードでFuraRedの使用は、しかし、requir可能です420 nmおよび488 nmの - 2つの励起波長ES。これは、（1つの励起波長を使用することと比較して）の少なくとも2倍で撮影頻度を減少させます。研究者が撮影の速いペースを維持したい場合は、画像の解像度が低下する必要があります。これらのフルオロフォアは、同じ488nmのレーザーによって励起され、発光スペクトルの良好な区別を提供することができるしかし、フルオ4及びFuraRedは、撮影頻度の解像度または減少を失うことなく、比例モードで一緒に使用することができます。 図4（a）に矢印でマークされたROIのまとめ典型的な過渡が図4Bに示されています。グラフは、明らかに、数分以内に崩壊する10μMのATPの添加後FLUO4 / FuraRed強度比の急激な増加を示しています。画像ごとに4秒を採取し、従って、この技術は、細胞内のカルシウム濃度の急速な変化を観察することを可能にします。

figure-results-1
実験プロトコルの1模式図を図 。動物が適切に麻酔や手術のために準備された後、腎臓は血液を除去するためにPBSでフラッシュされます。その後、腎臓を摘出し、デカプセル化し、糸球体は、差動ふるいにより腎皮質から分離されているされています。ここでは、サンプルの一部をパッチクランプ分析のために採取され、残りは蛍光カルシウム色素でロードされ、共焦点レシオメトリックカルシウムイメージングが行われる。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

figure-results-2
podoでTRPCカルシウムチャネルの活性を示す、図2の代表的な記録新たに単離したラット糸球体の球。左側のパネルには、セル接続構成における電気生理学的記録中の糸球体の表面に足細胞本体に取り付けられ、パッチクランプピペットを示しています。カプセル糸球体の部分は、画像の右下隅に見ることができます。 -40 mVの保持電位でラットの糸球体の足細胞で作られた細胞結合型パッチからのTRPC様チャネル活性の代表的な電流トレースは、右側に示されています。 cおよびoはiがそれぞれ、閉鎖および開放チャンネルのレベルを示す。この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

figure-results-3
図3.代表的な実験は、細胞内カルシウム濃度を評価するために設計されました足細胞は、糸球体のフルオ-4、AM、蛍光強度は、ベースラインおよびイオノマイシンとのMnCl 2を添加した後に記録されているがロードされ、細胞内カルシウム濃度を測定します。グラフは、色素、最低蛍光強度（Fの分 ）に結果を消光とのMnCl 2、（のFluo-4蛍光、Fの最大の最大値を生成する）イオノマイシンに応答して蛍光信号の変化を示しています。各時点での蛍光強度（左横）は6.3で式に従ってナノモル中の実際のカルシウム濃度（右横）に変換することができます。 F、F maxとF 分を算出したときの時点で足細胞を示す画像とインセットに注意してください。ここに示したグラフは、円（ROI）でマークされた足細胞の蛍光強度を反映しています。画像は4秒毎に採取しました。NK ">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

figure-results-4
ATPに応答した足細胞内カルシウム過渡応答の図4.測定 。 （A）の前に、10μMATPを添加した後、2mMのカルシウム含有溶液中のFluo-4（緑疑似カラー）とのFuraレッド（赤擬似）で染色した野生型ラット糸球体を示す代表的な画像。薬物の適用前より低い強度緑色の蛍光は留意すべきです。 （B）が10μmATPを適用することによって足細胞で誘発細胞内カルシウムトランジェントの例を要約。目からのカルシウムデポとカルシウム流入の刺激や枯渇を占める薬剤、添加後のFluo-4 /フラ赤蛍光強度比の強力かつ高速な増加に注意してください。E細胞外で、細胞内カルシウム濃度の上昇をもたらします。エラーバーは、同じ糸球体の11足細胞のために計算手段の標準誤差を表す。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

ディスカッション

ここで説明する手法は、げっ歯類の糸球体の足細胞によるカルシウム処理の分析を可能にします。この技術は、パッチクランプ単一チャンネル電気生理学、蛍光レシオメトリック共焦点イメージングの適用を可能にします。しかしながら、両方のアプローチは、それ自体で、別々に使用することができます。提案されたプロトコルは、1）腎フラッシュなど、いくつかの比較的単純なステップを、持っています。 2）差動ふるい分けによって糸球体の単離; 3）パッチクランプ電気生理学的実験を実施する、または細胞内カルシウムの変化のレシオメトリック共焦点イメージングのための蛍光カルシウム標識色素と糸球体のインキュベーション。

糸球体、Gloyに基づいて修正されたプロトコルを単離するためにら 5を用いました。差動ふるいの現在の技術の主な利点は、ボーマン嚢を剥奪糸球体を生成するため、洗練された、時間のかかる工程を必要としないことですマニュアルデカプセルの。単離された画分中の糸球体の大部分は、しかし、研究者は、あまりにも、カプセルの糸球体があることに注意する必要があり、カプセル化が解除されます。カプセルは足細胞に到達する薬を妨げるように、それは、ボーマン嚢の剥離糸球体を撮像していることを確認することが重要です。図2に見られるようにカプセル糸球体が滑らかで、丸型現れるのに対し、カプセル化が解除糸球体は、明確な毛細血管と足細胞体と粗い表面を有しています。また、FLUO4とFuraRedロード糸球体はカプセル化解除のものに比べて少ない強い蛍光シグナルを発するカプセル化。

得られたラット糸球体の割合は、（近位尿細管の痕跡を含む）95％純粋であり、必要に応じて容易にウェスタンブロッティングまたは他の分子生物学的用途に使用することができます。これは、一部として、無傷の足のプロセスと機能を保持し、この準備で足細胞が毛細血管に接続されていることを非常に重要ですネイティブの糸球体濾過装置機械の。足細胞によるカルシウム処理のメカニズムは、糖尿病や高血圧9-12のような疾患における腎合併症の発症と予防に不可欠な調節の役割を提供しています。足細胞は、急性損傷が足細胞の形態や構造を変化させ、蛋白尿2,3,13-15を引き起こす可能性があるという事実によって証明されるように、透過性障壁に大きく貢献します。したがって、簡単にこの製剤にスクリーニングすることができる薬剤、これらの細胞におけるカルシウム流入の応答を観察するために非常に重要です。これは、研究者は、通常、タンパク尿および糸球体損傷をもたらすれ、病理学的状態、例えば、高血圧症や糖尿病で足細胞をプロービングした場合には、糸球体の収率は健康な動物のそれより低い純度であるかもしれないことを理解すべきです。これは常にの損失を回避するために、分離プロセスの各段階での糸球体画分を監視することをお勧めします組織。いくつかのケースでは、高齢者や若すぎる動物からの多額の病気の糸球体や糸球体は大きく/小さくメッシュふるいの選択を含む、単離プロセスの個々の調整が必要になる場合があります。

我々は、足細胞16内のカルシウムTRPCチャネルの阻害は、非ステロイド抗炎症薬の有効性を決定するために、最初にこのアプローチを適用しています。これらの研究7,16-22後、我々は足細胞の機能を制御するいくつかの重要なメカニズムを確立するために記載された技術を用います。例えば、我々は、ラットの足細胞にP2（プリン）受容体のプロフィールを記載し、マウスの糸球体におけるアンジオテンシンIIによるカルシウム流入の規制を定義しました。以降の原稿20で説明したように、プロトコルは、ラットではなく、マウスのような他の種に限らず同様の研究を実行するように適合させることができます。二つの蛍光を用いたレシオメトリックカルシウム蛍光イメージング（色素 - のFluo-4及びフラ赤）は、データの追加の信頼性を確保し、必要なカルシウムイメージングは​​、足細胞内の他の物質の変化を監視するために、他の蛍光色素と組み合わせることができる場合。例えば、我々は、DAF-FM色素の助けを借りて、一酸化窒素を測定するためにこのアプローチを使用しています。パッチクランプ電気生理学は、カルシウムイメージングと組み合わせて単独で使用するか、または（設定許可）することができます。別にカルシウムチャネルから、この技術は他のイオンチャネルの活性を記録することができます。最近博士ドライヤーのグループ23によって示されているようにさらに、トランスフェクションおよびsiRNAの使用は、さらに多くの適用領域を拡大することができます。

従来の落射蛍光顕微鏡法ではなく、より少ない手頃な共焦点イメージングをここで用いることができます。しかし、研究者は、広視野蛍光顕微鏡の実効感度は、一般的にピンボケ光によって制限されることに注意してください。この（共焦点イマジンとの比較においてg）は、単一のROI（足細胞）またはその足突起の高解像度画像を生成することができないなどの制約が生じます。それは糸球体の表面と深部組織を区別することは困難であるとして、また、広視野顕微鏡は、足細胞の同定を複雑にしています。今のように、共焦点イメージングのための様々な蛍光体の商業的利用可能性ははるかに良いと急速に拡大しています。あるいは、落射蛍光研究は簡単に同時細胞内Ca 2+および単一チャネル活性の記録を提供することができる電気生理学的セットアップと組み合わせることができます。フィルタホイール分光器とNDフィルターの設定と糸球体足細胞のFURA2-AM負荷が広く使用されているが、常に質の高分解能イメージングには適していないです。

また、単離された、機能的な糸球体は、生理学的刺激に応答してその体積を変化させることができることに留意すべきです。実行中に、研究者はこのことを認識する必要があり慎重に実験、フォーカスの損失を回避し、意図しない収縮または弛緩をテストするために、新規薬剤の選択時に制御実験を行うために、共焦点研究中に焦点面を選択します。

この技術は、げっ歯類の背景の様々な、薬理学的治療または他の操作後に単一のイオンチャネルおよび個々の細胞レベルでのカルシウム流入の変化を監視するためのユニークな機会を提供しています。修正されたプロトコルは間違いなく非常に貴重な情報を提供する腎生検から得られた組織に適用することができるように、この技術はまた、ヒト腎疾患の研究に使用することができます。さらに、カルシウム濃度の測定は、深い正常および病的状態における足細胞内カルシウムハンドリングの調節に機構的洞察以上を提供し得る、リアルタイムで電気生理学的パッチクランプ実験と対にすることができます。

開示事項

著者らは、開示することは何もありません。

謝辞

著者らは、顕微鏡実験で優れた技術支援のためにグレン·スローカム（ウィスコンシン医科大学）とコリーンA.ラビン（ニコンインスツルメンツ社）を感謝したいと思います。グレゴリー·ブラスは、原稿の重要な校正のために認められています。この研究は、（DVIに）米国腎臓学会から（ASに）1-15-BS-172を付与し、ベン·J·リップス研究員国立衛生研究所の助成金HL108880と米国糖尿病協会によってサポートされていました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Fluo4 AMLife TechnologiesF14217500 µl in DMSO
FuraRed AMLife TechnologiesF-3020
Poly-ʟ-lysineSigma-AldrichP4707
Pluronic acidSigma-AldrichF-68溶液
IonomycinSigma-AldrichI3909-1ML
チューブローテーターMiltenyi Biotec GmbH130-090-753ドイツ
ニコン共焦点顕微鏡（倒立）NikonNikon A1Rレーザー励起 488 nm。放出フィルター 500-550 nm および 570-620 nm
対物レンズNikonPlan Apo 60x/NA 1.4 Oil
カバーガラスThermo Scientific6661B52
高真空グリースDow Corningシリコンコンパウンド
ソフトウェアNikonNikon NIS-Elements
記録/灌流チャンバーWarner InstrumentsRC-26
パッチクランプアンプリファイアMolecular DevicesMultiClamp 700B
データ収集システムMolecular DevicesDigidata 1440AAxon Digidata® System
ローパスフィルターWarner InstrumentsLPF-88ポールベッセル
ホウケイ酸ガラスキャピラリーWorld Precision Instruments1B150F-4
マイクロピペットプラーSutter Instrument CoP-97火炎/ブラウン型マイクロピペットプラー
マイクロフォージNarishigeMF-830日本
電動マイクロマニピュレーターSutter Instrument CoMP-225
倒立顕微鏡NikonEclipse Ti
微振動隔離台TMCファラデーケージ搭載
マルチチャンネルバルブ灌流システムAutoMake ScientificValve Bank II
記録/灌流チャンバーWarner InstrumentsRC-26
ソフトウェアMolecular DevicespClamp 10.2
ニカルジピンSigma-AldrichN7510
イベリオトキシンSigmaI5904-5UG
ニフルム酸Sigma-AldrichN0630
DIDSSigma-AldrichD3514-25MG
TEA chlorideTocrisT2265
RPMI 1640Life Technologies11835030抗生物質なし
BSASigma-AldrichA832730% アルブミン溶液
温度制御手術台MCW coreげっ歯類用
ステンレス製ふるい：#100 (150 μm), 140 (106 μm)
Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO200Fisher Sci50-871-316
Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO270Fisher Sci50-871-318
Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO400Fisher Sci50-871-320
メッシュ 200Sigma-Aldrichs4145CD-1用スクリーン
双眼顕微鏡NikonEclipse TS100
双眼顕微鏡NikonSMZ745
シリンジポンプ式灌流システムHarvard Apparatus
ポリエチレンチューブSigma-AldrichPE50
イソフルラン麻酔器figure-materials-1 VetEquip, Inc.911103
その他の基本試薬Sigma-Aldrich

参考文献

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