Summary
Las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) representan una fuente de tejidos específicos del paciente para aplicaciones clínicas y de investigación básica. A continuación, presentamos un protocolo detallado para reprogramar células humanas mononucleares de sangre periférica (PBMNCs) obtenidos a partir de buffy abrigos congelados en CMPI-virales gratis utilizando no integración de plásmidos episomales.
Abstract
Las células somáticas pueden ser reprogramadas en células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) forzando la expresión de cuatro factores de transcripción (octubre-4, Sox-2, Klf-4, y c-Myc), por lo general expresado por las células madre embrionarias humanas (hESCs) . Debido a su similitud con hESCs, iPSCs se han convertido en una herramienta importante para el potencial de la medicina regenerativa específica del paciente, evitando problemas éticos asociados con hESCs. Con el fin de obtener células adecuadas para la aplicación clínica, CMPI-transgén libre necesitan ser generados para evitar la reactivación del transgén, expresión de genes alterados y la diferenciación equivocada. Por otra parte, un método de reprogramación altamente eficiente y de bajo costo es necesario derivar iPSCs suficientes para fines terapéuticos. Ante esta necesidad, un enfoque eficiente no integrar plásmido episomal es la opción preferible para IPSC derivación. Actualmente, el tipo de célula más común usado para los propósitos de reprogramación son fibroblastos, el aislamiento de los cuales requiere biopsia de tejido, una iprocedimiento quirúrgico nvasive para el paciente. Por lo tanto, la sangre periférica humana representa el tejido más accesible y menos invasivo para la generación de IPSC.
En este estudio, un protocolo rentable y viral gratis con no-integración de plásmidos episomales se reporta para la generación de células iPS a partir de células mononucleares de sangre periférica humanas (PBMNCs) obtenidos a partir de buffy abrigos congelados después de toda la centrifugación de sangre y sin densidad de separación en gradiente.
Introduction
En 2006, el grupo de Shinya Yamanaka 1 demostró por primera vez que las células somáticas de ratones y seres humanos adultos se pueden convertir en un estado pluripotente por la expresión ectópica de cuatro factores de reprogramación (octubre-4, Sox-2, Klf-4, y c-Myc), generando las llamadas células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) 2. CMPI-paciente específico se parecen mucho a las células madre embrionarias humanas (hESCs) en términos de la morfología, la proliferación y la capacidad de diferenciarse en los tipos de células de tres germinales (mesodermo, endodermo y ectodermo), mientras que carece de los problemas éticos asociados a la utilización de hESCs y derivación posible rechazo inmune 3. Por lo tanto, iPSCs aparece como una de las fuentes más importantes de las células específicas del paciente para la investigación básica, la detección de drogas, el modelado de la enfermedad, la evaluación de la toxicidad y efectos de medicina regenerativa 4.
Varios enfoques se han utilizado para la generación de IPSC: vectores de integración virales(5 retrovirus, lentivirus 6), virales no-integración de vectores (adenovirus 7), Sendai virus 8, transposones BAC 9, vectores episomales 10, 11 proteínas o ARN entrega 12. Aunque el uso de métodos mediada por virus puede conducir a la reprogramación de alta eficiencia, los vectores virales se integran en el genoma de células huésped y por lo tanto potencial mutagénesis de inserción al azar, alteración permanente de la expresión génica, y la reactivación de transgenes silenciados durante la diferenciación no se puede excluir 13.
Para hacer iPSCs más seguro para la medicina regenerativa, se han hecho esfuerzos para derivar iPSCs sin la integración de ADN exógeno en genomas celulares. Aunque se han desarrollado vectores virales y transposones sujetos a impuestos especiales, todavía no está claro si las secuencias del vector cortos, que inevitablemente permanecen en las células transducidas después de la escisión, y transposasa expresión, podrían inducir alteración en la celdaular funcionan 13. A pesar de su alta eficiencia de reprogramación, virus Sendai representa un enfoque caro y llegar a través de las preocupaciones de licencia con la empresa que desarrolló este sistema tiene el potencial de limitar su aplicación en estudios de traducción. Además, la necesidad de la introducción directa de proteínas y ARN requiere la entrega múltiplo de la reprogramación de moléculas con las limitaciones técnicas inherentes esto conlleva la introducción, y la eficiencia general de reprogramación es muy baja 14. De nota, métodos virales libres y no integrador rentables basados en el uso de plásmidos episomales se han reportado con éxito para la reprogramación de fibroblastos de la piel 15. En concreto, en el presente trabajo hemos decidido utilizar plásmidos episomales-integración libre de comerciales disponibles, como se informó anteriormente 10,15.
Hasta la fecha, los fibroblastos de la piel representan el tipo de célula donante más popular 5. Sin embargo, otras fuentes de células han sido éxitosfully reprogramado en iPSCs incluyendo queratinocitos 16, células madre mesenquimales de médula ósea 17, las células del estroma adiposo 18, folículos pilosos 19, y las células de la pulpa dental 20. El aislamiento de estas células requiere procedimientos quirúrgicos, y se necesitan varias semanas para la expansión de células in vitro con el fin de establecer un cultivo celular primario.
En este sentido, la selección de iniciar tipo de célula es crítica y es igualmente importante ser capaz de producir células iPS a partir de tejidos de fácil acceso y menos invasivas como la sangre. Tanto las células mononucleares de sangre de cordón (CBMNCs) 21,22 y células mononucleares de sangre periférica (PBMNCs) 14,22-24 representan fuentes adecuadas de células para la derivación de células iPS.
Aunque la eficiencia de adulto PBMNC reprogramación es 20-50 veces menor que la de CBMNCs 22, siguen siendo el tipo de célula más conveniente para el propósito de muestreo. EnDe hecho, el muestreo PBMNC tiene la ventaja de ser mínimamente invasiva, y además, estas células no requieren extensa expansión in vitro antes de los experimentos de reprogramación. Hasta la fecha, diferentes protocolos han informado de que PBMNCs después de la separación en gradiente de densidad pueden ser congeladas y descongeladas días a varios meses después de la congelación y se expandieron para pocos días antes de la reprogramación en iPSCs 22,23. Sin embargo, en lo que somos conscientes no hay informes han descrito reprogramación de PBMNCs de buffy abrigos congelados. Es importante destacar que, buffy abrigos congelados recogidos sin separación en gradiente de densidad representan las muestras de sangre más comunes almacenados en bancos de datos genéticos a gran escala a partir de los estudios de población, lo que representa una piscina de fácil acceso de material para la producción de IPSC que evita además la recogida de muestras.
Aquí nos presenta por primera vez la generación de CMPI-virales libres de capas leucocitarias congelados humanos, sobre la base de un protocolo previamente descrito 22. EnAdemás, CMPI se generaron a partir PBMNCs congelados obtenidos después de la separación en gradiente de densidad, como un protocolo de control para los resultados PBMNC gradiente de densidad no purificada.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Células mononucleares de sangre periférica (PBMNCs) fueron aisladas de muestras de sangre periférica humana de donantes sanos después de firmado el consentimiento y la aprobación del Comité Ético de la provincia del Tirol del Sur informado. Los experimentos se llevaron a cabo de conformidad con los principios expresados en la Declaración de Helsinki. Todos los datos fueron recogidos y analizados de forma anónima.
1. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMNCs)
- PBMNCs obtuvieron a partir de capas leucocitarias después de la centrifugación de la sangre entera, sin separación en gradiente de densidad.
- Suma 8 ml de sangre periférica venosa en un citrato de sodio tamponada tubo de plástico, y se almacena a temperatura ambiente (25 ° C). Proceso de sangre dentro de las 12 horas después de la recolección.
- Centrifugar el tubo a 2000 xg durante 15 min a 4 ° C en un rotor basculante, la desconexión de los frenos de centrífuga.
- Recoger la capa leucocitaria nublado (la capa entre la fase de plasma superior y la inferiorfase que contiene la mayoría de los eritrocitos), que contiene la fracción enriquecida PBMNC (500 l) en un tubo criovial.
- Resuspender 500 l de capa con 500 l de medio de congelación 2x que contiene 90% de FBS y 20% de DMSO, anteado el fin de obtener un volumen total de 1 ml con una concentración de DMSO 10%.
- Congele el frasco en un recipiente de congelación a velocidad controlada a -80 ° C. Las células de las tiendas en nitrógeno líquido durante períodos más largos.
- PBMNCs obtuvieron después de la separación en gradiente de densidad
- Recoger 12 ml de sangre periférica venosa en un citrato de sodio tamponada tubo de plástico, y se almacena a temperatura ambiente. Proceso de sangre dentro de las 12 horas después de la recolección.
- Diluir la sangre con PBS estéril hasta un volumen final de 35 ml.
- Con cuidado y lentamente, capa de 35 ml de sangre diluida en 15 ml de solución polysucrose (utilizado para la separación en gradiente de densidad) (p = 1,077) en un tubo cónico de 50 ml (relación 3: 1).
- Centrifugar el tubo a 800 xg durante 30 min a TA enun rotor basculante, la desconexión de los frenos de centrífuga.
- Aspirar la fase amarilla que contiene el plasma superior y descartarlo. Con cuidado, transferir la capa de interfase de color blanco opaco que contiene PBMNCs a un nuevo tubo cónico de 50 ml.
- Llevar volumen total a 30 ml con PBS estéril y centrifugar a 300 xg durante 10 min a TA.
- Descartar el sobrenadante y resuspender las células con 30 ml de PBS. Contar el número de células viables, basados en la exclusión de azul de tripano 25.
- PBMNCs Centrifugar a 300 xg durante 10 minutos a temperatura ambiente, aspirar el sobrenadante y se descartan.
- Resuspender el sedimento celular en una cantidad apropiada de medio de congelación que contiene 90% de FBS y 10% de DMSO, con el fin de obtener una concentración de 5 x 10 6 células / ml.
- Alícuota 1 ml por vial (aproximadamente 5 x 10 6 células / ml) y congelar el vial en una velocidad controlada congelación recipiente en - 80 ° C. Las células de las tiendas en nitrógeno líquido durante períodos más largos.
2. Descongelación y Chapado de PBMNCs (día 0)
- PBMNCs obtuvieron a partir de capas leucocitarias después de la centrifugación de la sangre entera, sin separación en gradiente de densidad.
- Para iniciar el protocolo usando PBMNCs de capas leucocitarias congelados, descongelar 1 vial de células en un baño de agua a 37 ° C y diluir la capa leucocitaria con PBS estéril hasta un volumen final de 2 ml.
- Transferir la capa leucocitaria diluida en un tubo cónico de 50 ml, añadir 10 ml de tampón de lisis celular rojo y se incuba durante 10 min a TA.
- Para preparar 500 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos, añadir 0,5 g de bicarbonato de potasio, 4,145 g de cloruro de amonio, 100 l de solución de EDTA 0,5 M a 500 ml de agua ultrapura, pH 7.2 a 7.4.
- Llevar volumen total a 50 ml con PBS estéril y centrifugar a 300 xg durante 10 min a TA.
- Descartar el sobrenadante y lavar el sedimento con 50 ml de PBS estéril, centrifugar la capa leucocitaria a 300 xg durante 10 min a TA.
- Resuspender las células en1 ml de medio PBMNC, como se ha descrito previamente 22, integrado por IMDM y de Ham F-12 (relación 1: 1), concentrado de lípidos 1% de la insulina-transferrina-selenio-etanolamina (ITS-X), el 1% de química definida (CDL), 1% penicilina / estreptomicina, 0,005% de ácido L-ascórbico, 0,5% de albúmina de suero bovino (BSA), 1-Tioglicerol (concentración final 200 mM), Stem Cell Factor SCF (100 ng / ml), interleucina -3 IL-3 (10 ng / ml), eritropoyetina EPO (2 U / ml), similar a la insulina factor de crecimiento IGF-1 (40 ng / ml), dexametasona (1 M) y holo-transferrina (100 g / ml ).
- Transferencia de ellos en un pocillo de una placa de 12 pocillos con superficie tratada de cultivo de tejidos estándar, sin recubrimiento, a una densidad de 2 x 10 6 células / ml. Se incuban las células a 37 ° C, 5% de CO 2 en un incubador humidificado durante 48 horas, hasta que el paso medio cambiante (ver Sección 3).
- PBMNCs obtuvieron después de la separación en gradiente de densidad
- Para iniciar el protocolo utilizando PBMNCs congelados despuésla separación en gradiente de densidad, deshielo 1 vial de células en un baño de agua a 37 ° C, la transferencia de las células en 5 ml de medio PBMNC. Centrifugar a 300 xg durante 10 min a TA.
- Resuspender las células en 1 ml de medio de PBMNC y transferirlos a un pocillo de una placa de 12 pocillos, a una densidad de 2 x 10 6 células / ml. Se incuban las células a 37 ° C, 5% de CO 2 en un incubador humidificado durante 48 horas, hasta que el paso medio cambiante (ver Sección 3).
3. Cultura y Expansión de PBMNCs (DIA 2-13)
- Recoger PBMNCs en cultivo en suspensión, usando una pipeta con una punta de 1 ml, en un tubo cónico de 15 ml y centrifugar a 300 xg durante 10 min a TA.
- Descartar el sobrenadante y resuspender las células en 1 ml de medio de PBMNC fresco.
- Transferencia de las células en 1 pocillo de una placa de 12 pocillos con superficie tratada de cultivo de tejidos estándar, sin revestimiento, y se incuba ellos en 37 ° C, 5% de CO2 en un incubador humidificado.
4. La transfección de PBMNCs con episomal plásmidos (DIA 14)
Nota: Realizar el aislamiento de los cuatro plásmidos episomales-intergation libre comerciales, que lleva los genes de pluripotencia utilizando un kit comercial para la purificación del plásmido y evaluar la calidad de los plásmidos purificados utilizando un análisis en gel de agarosa, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Recoger PBMNCs en tubo cónico de 15 ml y contar el número de células viables (sobre la base de la exclusión de azul de tripano) 25.
- Centrifugar 2 x 10 6 células a 300 xg durante 10 min a TA.
- Resuspender 2 x 10 6 células en la mezcla de transfección que contiene 100 l de tampón de resuspensión T y 1 g de cada ADN plásmido (un plásmido que lleva OCT3 / 4 y shRNA contra p53, un plásmido SOX2 transporte y KLF4, unoplásmido que lleva la L-MYC y Lin28, y una plásmido que lleva EGFP, para comprobar la eficacia de transfección).
- Aspirar la mezcla de transfección que contiene las células en una punta 100 l e insertar la pipeta con la muestra verticalmente en el tubo, llenado con 3 ml de Buffer electrolítico E2, colocado en la estación de pipeta de la máquina de la electroporación, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Las células de manera eficiente electroporar utilizando el siguiente programa: 1650 V, 10 ms, 3 pulsos.
- Resuspender las células electroporadas (2 x 10 6 células) en 2 ml de medio de PBMNC pre-calentado, la adición de 0,25 mM butirato de sodio (NaB) y contar el número de células viables después de protocolo de electroporación (sobre la base de la exclusión de azul de tripano) 25.
- Transferencia de las células en un pocillo de una placa de 6 pocillos sin recubrimiento, roca suavemente la placa e incubar las células a 37 ° C, 5% de CO2 en un incubador humidificado.
- El día después de la electroporación, Count el número de células positivas para GFP bajo microscopía de fluorescencia 8-10 campos aleatorios, con el fin de evaluar la eficiencia de transfección.
- Mantener las células transfectadas y sin división por 3 días, hasta que ellos chapado en MEFs (véase la sección 6).
- Reemplazar 2 ml de medio fresco PBMNCs, además de 0,25 mM NaB cada dos días.
5. Preparar Platos con alimentador células para el Co-cultura (DIA 16)
- Escudo los pocillos de una placa de 6 pocillos con 1 ml de matriz de membrana basal de 15 min a 37 ° C y la placa de fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) a una densidad de 2 x 10 5 células / pocillo con 2 ml de 10% de FBS contenía DMEM (medio MEF) un día antes de los pases PBMNCs electroporación en células alimentadoras MEF.
6. PBMNCs Chapado transfectadas Onto MEFs (DIA 17-19)
- Recoger PBMNCs en cultivo en suspensión, usando una pipeta con 1 ml punta, en 15 ml de tubo cónico de centrífuga y transfectadas PBMNCs a 300 xg durante 10 mina TA.
- Desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 2 ml de medio PBMNC fresca, más 0,25 mM NAB.
- Placa de las células sobre recubierta-MEF 6 placa de pocillos e incubar las células a 37 ° C, 5% de CO2 en un incubador humidificado.
- Después de dos días, aspirar el medio y reemplazarlo con 2 ml de medio IPSC compuesto por nocaut DMEM (KO-DMEM), el 20% de reemplazo KO-Suero (KOSR), 1 mM NEAAs, 1% penicilina / estreptomicina, 20 mM de L- La glutamina, 0,1 mM β-mercaptoetanol, 10 FGF ng / ml (bFGF básico) y 0,25 mM NaB.
- Reemplace 2 ml de medio fresco cada día IPSC y comprobar las células diariamente.
Nota: A eso de las 22 a 25 días, las primeras colonias de células iPS deben ser visibles.
7. picking y expansión de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) Clones (DIA 30-35)
Nota: A unos 30 a 35 días después de la transfección, las colonias IPSC deben estar listos para la cosecha y replating. La eficiencia de reprogramación debe ser estiacoplado como el porcentaje de número de colonias IPSC / número total de células electroporadas, como se informó anteriormente 26.
- El día antes de pases colonias IPSC, preparar el alimentador MEF en una placa de 12 pocillos (1,25 x 10 5 células / pocillo).
- Aspirar el medio MEF y cambiar con 1 ml de medio de IPSC con 10 ng / ml de bFGF y 10 M Y-27632. Diseccionar manualmente con una aguja de una colonia en cada momento bajo el microscopio de disección en el picking del capó con el fin de obtener una rejilla, recoger terrones más pequeños mediante pipeteo y transferirlos individualmente cada uno en un pocillo de placa de 12 pocillos recubierta con MEFs.
- Passage y ampliar cada placa de 12 pocillos a una placa de 6 pocillos en una proporción de 1: 2, entonces cada placa de 6 pocillos en una proporción 1: 4 para su posterior propagación. Diseccionar y ampliar iPSCs manualmente durante los primeros 2-3 pasajes (como se describe a fondo en el paso 7.2), a continuación, utilizar un procedimiento de disociación enzimática (empezar desde el paso 7.4).
- Para un protocolo de enzima de disociación, limpio coloni IPSCes por aspiración partes diferenciadas, bajo el microscopio de disección en la cosecha del capó.
- Incubar iPSCs con 1 ml de colagenasa IV (1 mg / ml) durante 10 min a 37 ° C.
- Aspirar la solución de enzima, enjuagar las células con 1 ml de DMEM-KO y recoger las colonias en un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar a 100 xg durante 2 min a TA.
- Aspirar el sobrenadante, resuspender las colonias en 2 ml de medio de IPSC con 10 ng / ml de bFGF y 10 M Y-27632 y la placa de ellos en la placa de 6 pocillos recubiertos de MEF (relación 1: 4).
8. Caracterización de iPSCs (Entre 5-15 Passages)
- Fosfatasa alcalina tinción
- Cultura las colonias IPSC para 3-5 días en medio IPSC con 10 ng ml bFGF /.
- Para iniciar un protocolo de tinción de la fosfatasa alcalina, enjuagar iPSCs una vez con PBS y luego fijarlas con 1 ml de PFA al 4% durante 20 min a RT.
- Lavar las células tres veces con PBS, para eliminar PFA residual.
- Células Stain fijo que utilizanun kit de tinción de fosfatasa alcalina comercial de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- La inmunofluorescencia
- Cultura las colonias IPSC para 3-5 días en medio IPSC con 10 ng ml bFGF /.
- Para iniciar un ensayo de inmunofluorescencia, lavar iPSCs una vez con PBS y luego fijar con 1 ml de PFA al 4% durante 20 min a RT.
- Lavar las células tres veces con PBS, para eliminar PFA residual.
- Tratar iPSCs fijos con 1 ml de permeabilización / solución de bloqueo que contiene 4% de suero de cabra, 0,1% de BSA, 0,1% de Triton X-100 y 0,05% de azida sódica (NaN 3) para 1 hr a RT.
- Aspirar la solución de bloqueo e incubar las células fijadas con anticuerpos primarios en 3% de BSA y 0,05% de NaN3 solución S / N a 4 ° C (compruebe la tabla de materiales para la lista de anticuerpo primario y el factor de dilución de anticuerpo sugerido).
- El día siguiente, lavar iPSCs tres veces con PBS, a continuación, se incuban las células con Alexa Fluor 488 de cabra anti-ratón y Alexa FlUOR 555 anticuerpos de cabra anti-conejo, diluido 1: 1000 en BSA al 3% y 0,05% NaN solución 3, durante 1 hora a 37 ° C.
- Tinción de los núcleos con DAPI (1μg / ml) durante 10 min a TA en la oscuridad, seguido por lavado tres vez con PBS.
- La diferenciación de las células iPS en cuerpos embrioides (EBS)
- Cultura las colonias IPSC para 5-6 días en medio IPSC con 10 ng ml bFGF /.
- Eliminar partes diferenciadas de colonias IPSC aspirando, bajo el microscopio de disección en la cosecha del capó.
- Incubar iPSCs con 1 ml de colagenasa IV (1 mg / ml) durante 10 min a 37 ° C.
- Aspirar la solución de enzima, enjuagar las células con 1 ml de DMEM-KO y recoger las colonias en un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar a 100 xg durante 2 min a TA.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender las colonias en 2 ml de medio de suero EB compuesto de KO-DMEM, 20% define fetal bovino (FBS), 1 mM NEAAs, 1% penicilina / estreptomicina, 20 mM de L-glutamina, 0,1 mM46; mercaptoetanol.
- Placa colonias IPSC en la suspensión durante 6 días en fijación placas de 6 pocillos ultra-bajas, con el fin de permitir la formación de cuerpos embrioides esferoidales tridimensionales (EBS). Cambie 2 ml de medio EB fresca cada dos días.
- El día 7, recoger EBs y placa ellos en 0,1% de gelatina recubierto placas de 6 pocillos en 2 ml de medio de EB y mantener EBS en la diferenciación por 20 días.
- Cambie 2 ml de medio EB fresca cada dos días.
- QRT-PCR para el Análisis de la Expresión Génica
- Cultura las colonias IPSC para 5-6 días en medio IPSC con 10 ng ml bFGF /.
- Extraer el ARN total de PBMNCs, iPSCs o EBs utilizando 1 ml de reactivo comercial, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Evaluar la concentración de ARN y la pureza por métodos adecuados, como el uso de un espectrofotómetro (ARN de alta calidad con A 260 / A 280 y A 260 / A 230 ratios de> 1,8) 27.
- ComprobarLa integridad del ARN utilizando un kit comercial según el protocolo (ARN de alta calidad RQI> 9,5) del fabricante 28.
- Realizar una reacción de transcripción inversa en 1 g de ARN total usando un kit comercial de la transcriptasa inversa de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Preparar las mezclas que contienen qPCR 5 ng de cDNA plantilla, 7,5 l de SYBR Green Supermix, 2 l de 5 M primers (adelante: 1 l e inversa: 1 l) y 6 l de RNasa / agua libre de DNasa para cada reacción 29.
- Realice la qRT-PCR utilizando el siguiente programa: una etapa de desnaturalización inicial a 95 ° C durante 10 min, seguido por 40 ciclos divididos en un paso de desnaturalización a 95 ° C durante 15 seg y la etapa de recocido y extensión del cebador a 60 ° C durante 45 sec 29.
- Normalizar la expresión de otros genes usando GAPDH como gen de mantenimiento 28 (ver los cebadores listados en la Tabla 1).
- qPCRpara transgénica Exclusión
- Extraer ADN de PBMNCs o iPSCs utilizando 1 ml de tampón de lisis que contenía Tris 50 mM, EDTA 100 mM, NaCl 100 mM, 1% dodecilsulfato de sodio (SDS) y 20 mg / ml de proteinasa K.
- Añadir un volumen igual (1 ml) de 100% de isopropanol, se mezcla por inversión tres veces con el fin de permitir la precipitación de ADN y se centrifuga a 10.000 xg durante 5 min a TA.
- Descartar el sobrenadante, lavar el sedimento de ADN con 1 ml de etanol al 70% y se centrifuga a 10.000 xg durante 5 min a TA. Aspirar y desechar el sobrenadante y resuspender en RNasa / agua libre de DNasa.
- Evaluar la concentración de ADN y la pureza por métodos adecuados, como el uso de un espectrofotómetro (ARN de alta calidad con A 260 / A 280 y A 260 / A 230 ratios de> 1,8) 27.
- Preparar las mezclas que contienen qPCR 5 ng de ADN molde, 7,5 l de SYBR Green Supermix, 2 l de 5 M primers (adelante: 1 l e inversa: 1 l) y 6 &# 181; l de RNasa / agua libre de DNasa para cada reacción 29.
- Normalizar la expresión del plásmido episomal específica gen EBNA-1 utilizando FBX-15 como limpieza de genes 29 (ver los primers que figuran en la Tabla 1).
- Análisis Cariotipo
- Cultura las colonias IPSC para 5-6 días sobre la placa recubierta matriz de membrana basal-alimentador libre con un medio de mantenimiento comercial definido alimentador libre para CMPI, siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Para iniciar el protocolo de análisis de cariotipo, separar colonias IPSC con 1 ml de solución de desprendimiento de las células durante 5 min a 37 ° C, hasta obtener la disociación de una sola célula.
- Recoger las células y centrifugar a 400 xg durante 5 min a TA.
- Resuspender iPSCs en 2 ml de un medio desarrollado específicamente para el cultivo de células para técnicas de diagnóstico prenatal. IPSCs Plate unicelulares Onto matriz recubierto platos de cristal de la membrana basal y se incuba en un 37 ° C, 5% de CO 2 </ Sub> incubadora.
- Después de 2-4 días, añadir 10 l / ml de colchicina directamente a los cultivos y se incuba durante 3 horas a 37 ° C, 5% de CO2 en un incubador humidificado.
- Aspirar el medio y se incuba iPSCs en 1 ml de una solución hipotónica (0,6% de citrato de sodio y cloruro de potasio 0,13%) durante 10 min a RT.
- Enjuagar las células con 1 ml de solución de ácido acético al 5% y fijar iPSCs con solución de metanol / ácido acético (relación 3: 1) en una máquina con temperatura y humedad controlada (28 ° C, 42% HR).
- Sumerja y mancha fijo células con solución quinacrina durante 15-20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad (para obtener Q-bandas) 30.
- Adquirir metafases de células bajo un microscopio de fluorescencia a un aumento de 100X 29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En este estudio un protocolo simple y eficaz para la generación de CMPI-virales libre por reprogramación de PBMNCs aislados a partir de capas leucocitarias congelados después de la centrifugación de sangre total y la comparación con la reprogramación de PBMNCs obtenidos después de la separación en gradiente de densidad se informó. La Figura 1A muestra una representación esquemática de el protocolo detallado. Después de la descongelación, las PBMNCs aisladas, que muestran una típica forma redondeada, se expanden en medio de cultivo específico para sangre 14 días (Figura 1B) y luego transfectadas con plásmidos episomales. Después de 10 a 15 días después de la transfección, las pequeñas colonias brillantes redondeados con márgenes definidos y madre embrionarias morfología de las células, como empiezan a aparecer (Figura 1C). Aproximadamente 20 a 30 días después de la transfección, las colonias IPSC vuelven muy compacta, con bordes afilados, aumentan su tamaño y están listos para la cosecha y la expansión (Figura 1D). Después de las etapas primera pases (2-3 pasajes),colonias IPSC mantienen su estado indiferenciado y muestran una típica morfología de las células madre embrionarias humanas. Durante los primeros pasajes, picking manual es una forma de expansión más eficiente en comparación con la enzima de disociación con el fin de seleccionar totalmente indiferenciada, compacto y apretada colonias (Figuras 2A). Mayor ampliación de las colonias de IPSC muestra células individuales dentro de las colonias y la alta relación de núcleo a citoplasma se observa más fácilmente (Figura 2B). Después de la recolección mecánica inicial, los clones seleccionados IPSC se expanden con la disociación enzimática utilizando colagenasa IV. Después de 10-15 pasajes de expansión in vitro, análisis citogenético se lleva a cabo en colonias de IPSC. Acerca de 20 metafases de al menos dos cultivos independientes, a aproximadamente 300-400 nivel de banda, se analizan y todas las muestras muestran una karyogram normal (Figura 2C). Esta observación sugiere que iPSCs son genéticamente estables.
En popaer expansión in vitro (5-10 pasajes), CMPI se caracterizan por la expresión de marcadores stemness y su potencial de pluripotencia. Las Figuras 3A, B muestran que iPSCs son positivas para la tinción de fosfatasa alcalina. El uso de QRT-PCR análisis, hemos verificado que iPSCs expresan genes endógenos pluripotentes (SOX-2, Oct3 / 4, NANOG) en niveles significativamente más altos que PBMNCs de partida, mientras que los niveles de expresión de endógeno C-myc y KLF-4 son similares antes y después de IPSC reprogramación (Figura 3C). Después de sólo 5 pases en cultivo, la expresión de transgenes exógenos episomales no puede ser detectada en CMPI, indicando así la activación exitosa de genes endógenos pluripotentes. PBMNCs 5 días después de la transfección, con un fuerte nivel de expresión del transgén, evaluados por cebadores específicos para episomales EBNA-1, se utilizan como control positivo. PBMNCs que nunca se exponen a los plásmidos que llevan los genes de pluripotencia 4 exógenas, se utilizan como control negativo (Fifigura 3D). Por último, el análisis de inmunofluorescencia revela que iPSCs expresan marcadores de pluripotencia, tales como OCT3 / 4, SOX-2, SSEA-4, TRA-1-60, y TRA-1-81 (Figura 4).
CMPI se diferencian en cuerpos embrioides (EBS) utilizando un protocolo de diferenciación espontánea, como se muestra en la Figura 5A, con el fin de evaluar su potencial de pluripotencia en vitro. QRT-PCR experimentos revelan que iPSCs son capaces de diferenciarse en células de las tres capas germinales; de hecho, EBS obtuvo después de 20 días de exhibición diferenciación significativa sobre regulación de marcadores de linaje representante del endodermo (SOX-7, AFP), el mesodermo (CD31, ACTA-2, CDH-5, RUNX-1) y el ectodermo (KTR- 14, TH, GABRR-2) (Figura 5B). Análisis de microscopía confocal muestra que una sola célula disociado racimos golpeando expresan marcadores cardiomiocitos típicos como troponina I (Tn-I) y α-actinina, organizada en un patrón sarcoméricas clara (Figura6A). Además, el análisis de inmunofluorescencia de EBs muestra una tinción positiva para la clase específica de neurona marcador de β-tubulina III (TuJ1), así como para la hidroxilasa tirosina dopaminérgica neuronal marcador (TH) (Figura 6B).
Figura 1. Protocolo para la generación de células iPS a partir de sangre periférica y cambios morfológicos celulares humanos durante el protocolo. (A) Diagrama del protocolo utilizado para generar iPSCs obtenidos a partir de PBMNCs congelados después de DGS y PBMNCs aislarse a partir de capas leucocitarias congelados, usando una sola transfección de no-integración de plásmidos episomales. (B) Imágenes representativas de la proliferación PBMNCs obtenidos de DGS y buffy abrigos después de la descongelación y expansión en cultivo durante 14 días, antes de ser transfectadas. Barra de escala 100 micras. (C) Ejemplos de colonias IPSC una semana después de que las células son plado en MEFs. Barra de escala 500 micras. (D) Imágenes representativas de las colonias de IPSC en 30-35 días después de volver a chapado en un alimentador de capa MEF. Barra de escala 500 micras. iPSCs = células madre pluripotentes inducidas; DGS = densidad de separación en gradiente; PBMNCs = células mononucleares de sangre periférica; MEFs = fibroblastos embrionarios de ratón; Factores de crecimiento; GFs = bFGF = factor de crecimiento de fibroblastos básico; NAB = butirato sódico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Morfología y análisis de cariotipo. (A) Imágenes representativas de colonias IPSC después de 2-3 pasos pases manuales. Barra de escala 500 micras. (B) la ampliación más grande de las colonias de IPSC. Barra de escala 200 micras. (C) Representanteskaryograms normales ntative de iPSCs después de 10 a 15 pasos de la expansión in vitro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. IPSC caracterización: actividad de la fosfatasa alcalina, re-expresión de los genes endógenos de pluripotencia CMPI y evaluación de silenciamiento del transgén (A) y (B) Imágenes representativas que muestran la tinción positiva para fosfatasa alcalina.. Barra de escala 500 micras. (C) El gráfico de barras que muestra la re-expresión de los genes endógenos de pluripotencia (C-MYC, KLF-4, Sox-2, OCT3 / 4 y NANOG) en ambos iPSCs obtenidos de DGS y buffy abrigos, utilizando el análisis de QRT-PCR ( n = 4, prueba t de Student: * p <0.05, § p <0,005 vs correspondientes PBMNCs). (D) QRT-PCR con cebadores episómicos específica (EBNA-1) (en relación con el control de cebadores FBOX15) no muestra genoma integración de vectores episomales. (N = 4, prueba t de Student: * p <0,001 vs PBMNCs correspondiente 5-días transfección). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. El análisis de inmunofluorescencia de células madre embrionarias marcadores de pluripotencia. Tinción de inmunofluorescencia Representante muestra la expresión significativa de proteínas de pluripotencia SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, Oct3 / 4 y Sox-2. Los núcleos se counterstained con DAPI. Barra de escala 200 micras para IPSC DGS (A) y la capa IPSC Buffy (B). Barra de escala 100 m para la capa IPSC Buffy (A), IPSC DGS (B strong>) y (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Protocolo para la diferenciación de las células iPS y expresión de tres genes de capas germinales en EBS obtuvo de iPSCs. (A) Representación esquemática del protocolo de inducción de la diferenciación espontánea de células iPS a partir PBMNCs después abrigos DGS y Buffy en EBS. Experimentos (B) QRT-PCR que muestra la expresión de todos los genes de tres capas germinales: endodermo (SOX-7, AFP), el mesodermo (CD31, ACTA-2, CDH-5, RUNX-1), y el ectodermo (KRT-14, TH, GABRR-2) en EBS después de 20 días de diferenciación (n = 4, la t de Student-test: * p <0,05 vs correspondiente iPSCs contraparte). EBS = cuerpos embrionarios./52885/52885fig5large.jpg "Target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. Análisis de microscopía confocal de proteínas cardiacas y neuronales en EBS en el día 20 de diferenciación obtenida de PBMNCs después de DGS y abrigos-derivados buffy iPSCs. (A) Imágenes representativas (proyección máxima de pila imagen confocal) para las proteínas sarcoméricas cardíacos α-actinina y la troponina I (Tn-I) en una sola célula disociada áreas latiendo (barra de escala 10 micras) y (B) para la clase específica de neurona marcador de β-tubulina III (TuJ1) y la hidroxilasa de tirosina dopaminérgica neuronal marcador (TH) (escala bar 20 micras). Los núcleos se counterstained con DAPI. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande deesta figura.
| Cartilla | Secuencia | ||
| C-MYC fw | 5'-AGAAATGTCCTGAGCAATCACC-3 ' | ||
| C-MYC rev | 5'-AAGGTTGTGAGGTTGCATTTGA-3 ' | ||
| KLF-4 fw | 5'-ATAGCCTAAATGATGGTGCTTGG-3 ' | ||
| KLF-4 rev | 5'AACTTTGGCTTCCTTGTTTGG-3 ' | ||
| SOX-2 fw | 5'GGGAAATGGGAGGGGTGCAAAAGAGG-3 ' | ||
| SOX-2 rev | 5'-3 TTGCGTGAGTGTGGATGGGATTGGTG | ||
| OCT3 / 4 fw | 5'GACAGGGGGAGGGGAGGAGCTAGG-3 ' | ||
| OCT3 / 4 rev | 5'CTTCCCTCCAACCAGTTGCCCCAAAC-3 ' | ||
| NANOG fw | 5'-TGCAAGAACTCTCCAACATCCT-3 ' | ||
| Rev NANOG | 5 &# 8242; -ATTGCTATTCTTCGGCCAGTT-3 ' | ||
| SOX-7 fw | 5'-TGAACGCCTTCATGGTTTG-3 ' | ||
| SOX-7 rev | 5'-AGCGCCTTCCACGACTTT-3 ' | ||
| AFP fw | 5'-GTGCCAAGCTCAGGGTGTAG -3 ' | ||
| AFP rev | 5'-CAGCCTCAAGTTGTTCCTCTG-3 ' | ||
| CD31 fw | 5'-ATGCCGTGGAAAGCAGATAC-3 ' | ||
| Rev CD31 | 5'-CTGTTCTTCTCGGAACATGGA-3 ' | ||
| ACTA-2 fw | 5'-GTGATCACCATCGGAAATGAA-3 ' | ||
| ACTA-2 rev | 5'-TCATGATGCTGTTGTAGGTGGT-3 ' | ||
| CDH-5 fw | 5'-GAGCATCCAGGCAGTGGTAG-3 ' | ||
| CDH-5 rev | 5'-CAGGAAGATGAGCAGGGTGA-3 ' | ||
| RUNX-1 fw | CCCTAGGGGATGTTCCAGAT-3 ' | RUNX-1 rev | TGAAGCTTTTCCCTCTTCCA-3 ' |
| KRT-14 fw | 5'-CACCTCTCCTCCTCCCAGTT-3 ' | ||
| KRT-14 rev | 5'-ATGACCTTGGTGCGGATTT-3 ' | ||
| TH fw | 5'-TGTACTGGTTCACGGTGGAGT-3 ' | ||
| Rev TH | 5'-TCTCAGGCTCCTCAGACAGG-3 ' | ||
| GABBR-2 fw | 5'-CTGTGCCTGCCAGAGTTTCA-3 ' | ||
| GABBR-2 rev | 5'-ACGGCCTTGACGTAGGAGA-3 ' | ||
| EBNA-1 fw | 5'-ATCAGGGCCAAGACATAGAGATG-3 ' | ||
| EBNA-1 rev | 5'-GCCAATGCAACTTGGACGTT-3 ' | ||
| FBX-15 fw | 5'-GCCAGGAGGTCTTCGCTGTA-3 ' | ||
| FBX-15 fw | 5'-AATGCACGGCTAGGGTCAAA-3 ' | ||
| Fw GAPDH | 5'-CCACCCATGGCAAATTCC-3 ' | ||
| Rev GAPDH | 5'-TCGCTCCTGGAAGATGGTG-3 ' |
Tabla 1: Lista de cebadores QRT-PCR Primer secuencias utilizadas para la evaluación de la expresión de genes pluripotencia endógeno, el silenciamiento del transgén y la expresión de los tres marcadores de capa germinal..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En el pasado, la única forma de obtener células madre pluripotentes humanos con una mutación genética particular era reclutar a los padres sometidos a diagnóstico genético pre-implantación y generar células madre embrionarias a partir de sus blastocistos descartado 31,32. Utilizando un enfoque de reprogramación, los investigadores ahora pueden generar células iPS de pacientes portadores de prácticamente cualquier genotipo. La posibilidad de empezar de una línea celular específica del paciente y una fuente de fácil acceso es muy importante, ya que permite una investigación de la fisiopatología de los trastornos y la posterior identificación de nuevos enfoques terapéuticos.
En el presente estudio, hemos combinado un enfoque plásmido 15 con un método que ya se aplican para producir iPSCs de PBMNCs previamente congelados después de la separación por gradiente de densidad 22 y iPSCs libres de virus generadas con éxito de PBMNCs capa leucocitaria congelados. El uso de capas leucocitarias en lugar de gradiente de densidad separadas PBMNCs todosujos nos permite reducir costos, tiempo de trabajo y los pasos manuales para los operadores durante el procesamiento de la muestra. La puesta a punto de un protocolo de bajo costo utilizando PBMNCs de buffy abrigos congelados es esencial para los estudios con elevado número de participantes y de colecciones de muestras en los estudios multicéntricos. Es importante destacar que la capacidad de producir iPSCs de capas leucocitarias congeladas permite el acceso a numerosas muestras biológicas congelados ya almacenados en los bancos de sangre, utilizando un método sencillo, el tiempo rentable y no tan consumir para la recogida de muestras.
Este método de inducción puede ser útil para la derivación de integración-libre iPSCs específicos del paciente, donde las colonias se caracterizan por la ausencia de transgén episomal después de sólo unos pocos pasajes (≥5 pasajes), en ambos materiales de partida. Sorprendentemente, se observó que todas las colonias IPSC seleccionados obtuvieron a partir de los dos tipos de pantalla a partir de material de pluripotencia características comparables y la preservación de similitudes celulares y moleculares de hESCs, índicating una exitosa derivación IPSC y reproducibilidad consistente del protocolo.
CMPI Además, hemos generado con éxito de más de 10 fibroblastos de piel humana y 3 líneas de células estromales mesenquimales cardíacos (tanto de donantes sanos y pacientes con enfermedades del músculo cardíaco y esquelético) usando este método (datos no presentados), lo que sugiere que el protocolo descrito puede ser utilizado para la reprogramación exitosa de diferentes tipos de células. Sin embargo, la elección de la sangre como material de partida es ventajoso en comparación con los fibroblastos, especialmente cuando se considera que la expansión extensiva de fibroblastos in vitro puede afectar a la eficiencia de reprogramación, basada en el número y la proliferación de fibroblastos pasaje tasa de 33,34. Nuestro protocolo también permite la generación de CMPI-transgenes libre de buffy abrigos congelados después de un tiempo de cultivo mínimo, lo que reduce en alrededor de 3-4 semanas, el tiempo necesario para la obtención de células iPS en comparación con otras fuentes, tales como fifibroblastos. Además, estudios recientes revelaron que iPSCs derivados de células de sangre muestran una firma epigenética que se asemeja más estrechamente hESCs que los obtenidos a partir de células madre mesenquimales (MSC) / fibroblastos 14,35.
A pesar de la generación exitosa de iPSCs de buffy abrigos congelados, algunas limitaciones deben tenerse en cuenta en este protocolo. Antes de la reprogramación de la inducción, la amplificación de PBMNCs de buffy abrigos congelados podría representar un paso crítico del protocolo. La calidad del material de partida puede influir fuertemente en la selección y el aislamiento de PBMNCs, con el fin de alcanzar el número de células suficientes para el procedimiento de reprogramación (al menos 2 x 10 6 células para electroporación). Esto se debe principalmente a la variabilidad biológica intrínseca de las muestras, sino también a problemas técnicos. De hecho, la amplificación de PBMNCs de capas leucocitarias congelados es menos eficiente en comparación con PBMNCs obtenidos a partir de la separación en gradiente de densidad, debido a un fuerte dependencia de la variabilidad del operador manual. Con el fin de mejorar la reproducibilidad y la eficiencia de amplificación PBMNC de buffy abrigos congelados sin separación en gradiente de densidad, el uso de sistemas automatizados se recomienda recoger fracciones capa leucocitaria. Aunque es más difícil expandir un número suficiente de PBMNCs de capas leucocitarias que PBMNCs después de separación en gradiente de densidad, la eficiencia de reprogramación (alrededor de 0,001 hasta 0,0005%) de los dos materiales de partida es comparable, de acuerdo con la eficiencia de reprogramación sangre informó anteriormente 14, 23. Dado que la eficiencia de la reprogramación es baja para los propósitos de medicina regenerativa, el uso de la mejora de EBNA1 / OriP (de virus de Epstein-Barr, EBV) vectores episomales puede aumentar el número de colonias IPSC para el desarrollo de la terapia de células futuro 22,36. Además, una capa de alimentación MEF para la generación y el mantenimiento IPSC se utiliza en el protocolo. Para obtener iPSCs clínica de grado, una cultura de alimentación libre podría ser una altemétodo rnative para estudios posteriores.
En conclusión, este protocolo representa un método válido para generar iPSCs de una fuente celular paciente fácilmente accesible con la gran ventaja de utilizar un sistema no integrador que potencialmente puede ser utilizado para la derivación de CMPI clínica grado, no sólo para el modelado de la enfermedad pero también para un futuro la medicina personalizada.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Citrate buffered Venosafe Plastic Tube | Terumo | VF-054SBCS07 | |
| Ammodium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Potassium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 60339 | |
| EDTA disodium powder | Sigma-Aldrich | E5134 | 0.5 M solution |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare Life Sciences | 17-5442-02 | Polysucrose solution for density gradient centrifugation |
| Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) | Gibco | 21056-023 | No phenol red |
| Ham's F-12 | Mediatech | 10-080-CV | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS -X) | Gibco | 51500-056 | 1X (Stock: 100X) |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Gibco | 11905031 | 1X (Stock: 100X) |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | Final Concentration at 200 µM |
| Recombinant Human Stem Cell Factor (SCF) | PeproTech | 300-07 | 100 ng/ml (Stock:100 µg/ml) |
| Recombinant Human Interleukin-3 (IL-3) | PeproTech | 200-03 | 10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml) |
| Recombinant Human Insulin-like Growth Factor (IGF-1) | PeproTech | 100-11 | 40 ng/ml (Stock: 40 µg/ml) |
| Recombinant Human Erythropoietin (EPO) | R&D Systems | 287-TC-500 | 2 U/ml (Stock: 50 U/ml) |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915 | 1 μM (Stock: 1 mM) |
| Human Holo-Transferrin | R&D Systems | 2914-HT | 100 μg/ml (Stock: 20 mg/ml) |
| Amniomax II | Gibco | 11269016 | Medium for cytogenetic analysis |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 5850 | Medium for iPSC feeder-free culture |
| Knockout DMEM | Gibco | 10829-018 | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030-024 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140-050 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | 0.1 mM (Stock: 50 mM) |
| Sodium Butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | 0.25 mM (Stock: 0.5 M) |
| Recombinant Human FGF basic, 145 aa | R&D Systems | 4114-TC | 10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml) |
| Y-27632 dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503 | 10 µM (Stock: 10 mM) |
| Fetal Defined Bovine Serum | Hyclone | SH 30070.03 | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Merck-Millipore | ES-006-B | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced | BD Biosciences | 354230 | |
| Collagenase, Type IV | Gibco | 17104-019 | 1 mg/ml (Stock: 10 mg/ml) |
| Accutase | PAA Laboratories GmbH | L11-007 | Cell detachment solution |
| Mouse Embryonic Fibroblast (CF1) | Global Stem | GSC-6201G | 1*106 cells/6 well plate |
| Plasmid pCXLE-hOCT3/4-shp53-F | Addgene | 27077 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Plasmid pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Plasmid pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Plasmid pCXLE-EGFP | Addgene | 27082 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Alkaline Phosphatase Staining Kit | Stemgent | 00-0009 | |
| Anti-Stage-Specific Embryonic Antigen-4 (SSEA-4) Antibody | Merck-Millipore | MAB4304 | 1/250 |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Merck-Millipore | MAB4360 | 1/250 |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Merck-Millipore | MAB4381 | 1/250 |
| Anti-Oct-3/4 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-9081 | 1/500 |
| Anti-Nanog Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-33759 | 1/500 |
| Anti-Troponin I Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-15368 | 1/500 |
| Anti-α-Actinin (Sarcomeric) Antibody | Sigma-Aldrich | A7732 | 1/250 |
| Neuronal Class III ß-Tubulin (TUJ1) Antibody | Covance Research Products Inc | MMS-435P-100 | 1/500 |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody | Calbiochem | 657012 | 1/200 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse | Molecular Probes | A-11029 | 1/1000 |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Rabbit | Molecular Probes | A-21429 | 1/1000 |
| Ultra-Low Attachment Cell Culture 6-well plate | Corning | 3471 | |
| Trizol Reagent | Ambion | 15596-018 | reagent for RNA extraction |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11754050 | Reverse transcriptase kit |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5124 | |
| CFX96 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 185-5195 | |
| Experion Automated Electrophoresis System | Bio-Rad | 700-7000 | Instrument to check RNA integrity |
| Experion RNA Highsense Analysis kit | Bio-Rad | 7007105 | Reagent kit to check RNA integrity |
| Dissecting microscope (SteREO Discovery V12 ) | Zeiss | 495007 | |
| NeonTransfection System 100 µl Kit | Invitrogen | MPK10025 | Reagent kit for electroporation |
| Neon Transfection System | Invitrogen | MPK5000 | Instrument used for electroporation |
| NanoDrop UV/Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | Instrument for DNA/RNA quantification |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Plasmid purification kit |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat. Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).
- Drews, K., Jozefczuk, J., Prigione, A., Adjaye, J. Human induced pluripotent stem cells--from mechanisms to clinical applications. J. Mol. Med. (Berl). 90 (7), 735-745 (2012).
- Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells). Curr. Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Sommer, A. G., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector. J. Vis. Exp. (68), e4327 (2012).
- Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
- Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol. Biol. 997, 45-56 (2013).
- Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat. Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell. Stem Cell. 4 (6), 472-476 (2009).
- Warren, L., Ni, Y., Wang, J., Guo, X. Feeder-free derivation of human induced pluripotent stem cells with messenger RNA. Sci. Rep. 2, 657 (2012).
- Stadtfeld, M., Hochedlinger, K. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. Genes Dev. 24 (20), 2239-2263 (2010).
- Chou, B. K., et al. Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures. Cell Res. 21 (3), 518-529 (2011).
- Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat. Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).
- Streckfuss-Bomeke, K., et al. Comparative study of human-induced pluripotent stem cells derived from bone marrow cells, hair keratinocytes, and skin fibroblasts. Eur. Heart J. 34 (33), 2618-2629 (2013).
- Miyoshi, N., et al. Reprogramming of mouse and human cells to pluripotency using mature microRNAs. Cell. Stem Cell. 8 (6), 633-638 (2011).
- Wang, Y., et al. Induced pluripotent stem cells from human hair follicle mesenchymal stem cells. Stem Cell. Rev. 9 (4), 451-460 (2013).
- Beltrao-Braga, P. C., et al. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from human immature dental pulp stem cells. Cell Transplant. 20 (11-12), 1707-1719 (2011).
- Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell. Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
- Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nat. Protoc. 7 (11), 2013-2021 (2012).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell. Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
- Geti, I., et al. A practical and efficient cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells from adults: blood-derived endothelial progenitor cells. Stem Cells Transl. Med. 1 (12), 855-865 (2012).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. , Appendix 3-Appendix 3B (2001).
- Hasegawa, K., et al. Comparison of reprogramming efficiency between transduction of reprogramming factors, cell-cell fusion, and cytoplast fusion. Stem Cells. 28 (8), 1338-1348 (2010).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. (45), 2565 (2010).
- Fleige, S., Pfaffl, M. W. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Mol Aspects Med. 27 (2-3), 126-129 (2006).
- Meraviglia, V., et al. Human chorionic villus mesenchymal stromal cells reveal strong endothelial conversion properties. Differentiation. 83 (5), 260-270 (2012).
- Caspersson, T., Zech, L., Johansson, C. Analysis of human metaphase chromosome set by aid of DNA-binding fluorescent agents. Exp Cell Res. 253 (2), 302-304 (1999).
- Alikani, M., Munne, S. Nonviable human pre-implantation embryos as a source of stem cells for research and potential therapy. Stem Cell. Rev. 1 (4), 337-343 (2005).
- Tropel, P., et al. High-efficiency derivation of human embryonic stem cell lines following pre-implantation genetic diagnosis. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 46 (3-4), 376-385 (2010).
- Hanna, J., et al. Direct cell reprogramming is a stochastic process amenable to acceleration. Nature. 462 (72-73), 595-601 (2009).
- Li, H., et al. The Ink4/Arf locus is a barrier for iPS cell reprogramming. Nature. 460 (7259), 1136-1139 (2009).
- Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
- Lindner, S. E., Sugden, B. The plasmid replicon of Epstein-Barr virus: mechanistic insights into efficient, licensed, extrachromosomal replication in human cells. Plasmid. 58 (1), 1-12 (2007).
