Summary
Cell organisering av kraniofaciale bein har lenge vært en teori, men aldri direkte visualisert. Multispektral celle merking og in vivo levende bildebehandling tillater visualisering av dynamisk celle atferd i sebrafisk underkjeven. Her, til vi detalj protokollen manipulere Zebrabow transgen fisk og direkte observere celle innskyting og morfologiske endringer av chondrocytes i Meckels brusk.
Abstract
Utvikling av virveldyr kraniofaciale strukturer krever nøyaktig koordinering av celle migrasjon, spredning, heft og differensiering. Mønstring av Meckels brusk, en første svelget bue derivat, innebærer migrasjon av kranie neural crest (CNC) celler og progressive partisjonering, spredning og organisering av differensierte chondrocytes. Flere studier har beskrevet CNC migrasjon under underkjeven morphogenesis, men detaljene om hvordan kondrocyttene oppnå organisasjon i vekst og utvidelse av Meckels brusk er fortsatt uklart. Den sox10 begrenset og kjemisk indusert Cre rekombinase-mediert rekombinasjon genererer permutasjoner av ulike fluorescerende proteiner (RFP, YFP og CFP), og dermed skape en multi-spektral merking av stamceller og deres avkom, som gjenspeiler forskjellige klonale populasjoner. Ved hjelp av konfokal time-lapse fotografering, er det mulig å observere chondrocytes behavieller under utviklingen av sebrafisk Meckels brusk.
Multispektrale celle merking gjør det mulig for forskere å demonstrere forlengelse av Meckels chondrocytter. I forlengelse av Meckels brusk, som et forvarsel om kjeven, chondrocytes intercalate å gjennomføre utvidelsen som de stakk i en organisert encellede lagdelte rad. Unnlatelse av dette organisert interkalerende prosess for å megle celle forlengelse gir mobil mekanistisk forklaring for hypoplastisk kjeven at vi observerer i underkjevens misdannelser.
Introduction
Kraniofaciale utvikling krever kompliserte molekylære, cellulære og vev interaksjoner å kjøre celleproliferasjon, migrasjon og differensiering 1,2, 3. Denne tett regulert og komplisert prosess er gjenstand for genetiske og miljømessige forstyrrelser, slik at kraniofaciale misdannelser er blant de vanligste medfødte misdannelser 1-9. Mens kirurgiske inngrep forbli bærebjelke i behandling for kraniofaciale anomalier, forstå utviklingen basis er avgjørende for å skape fremtidige terapier. Derfor studerer morphogenesis og mekanismene i konvergens og forlengelse og celle integrasjon gir ny innsikt i dannelsen av det kraniofaciale skjelettet 1.
Kranie neural crest migrere og fylle den første svelg bue, deretter danne sammenkoblede underkjevens prosesser som strekker seg for å danne Meckels brusk, som et forvarsel om kjeven. Morphogenesis of Meckels brusk krever kondrocytt organisasjon via retnings spredning, celle polarisering og differensiering 1,10. Men intricacy av kondrocytt organisasjon i vekst og utvidelse av Meckels brusk er fortsatt uklart. Forstå dynamisk celle atferd er avgjørende for å forstå medfødte misdannelser som påvirker mandibular størrelse, for eksempel hypoplastisk kjeven fenotyper 11.
Sebrafisk embryo tilbyr mange utviklings og genetiske fordeler for detaljert studie av Meckels brusk morphogenesis. Deres genetiske tractability, åpenhet, ex vivo og rask utvikling er kraftige fordeler utlån det godt for observasjon av celle bevegelse og organisering av levende avbildning 6. Bruke avstamning-sporing verktøy, for eksempel sox10: kaede transgen linje, har vi og andre avgrenset neural crest opprinnelsen til embryonale kraniofaciale skjelettet 1,5. USIng sox10: ERT2-Cre med Ubi: Zebrabow-M transgen linje, er det nå mulig å utforske detaljer om cellulære bevegelser under kraniofaciale utvikling. Den Zebrabow-M, er en transgen linje konstruert med ubiquitin promoter driver uttrykk for forskjellige fluorophores, hver flankert av Lox nettsider 8. Den Zebrabow-M standard fluorophore er Red, uttrykker RFP. Etter induksjon av Cre uttrykk, Zebrabow-M konstruere recombines og celler uttrykker en kombinasjon av ulike fluoroforer (RFP, CFP og YFP) skaper multispektrale uttrykk i embryoet. Alle dattercellene som deler fra de merkede cellene etter rekombinasjon arrangementet blir så clonally merket, slik at cellepopulasjoner som stammer fra ulike sidestilte stamfedre er clonally merket. Ved denne celle kloning merking, kan cellene proliferasjon og migrering med klonal oppløsning følges (figur 1 og 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Massachusetts General Hospital Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) godkjent alle prosedyrer i henhold til protokoll nummer # 2010N000106. Dette er i samsvar med Foreningen for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC) retningslinjer.
1. Reagenser og materialer Forberedelse
- Forbered 1 liter 50X E3 embryo medium (se tabell 1), og fremstille en liter 1X E3 embryo medium (se tabell 2).
- Forbered E3 embryo medium med N-Phenylthiourea (PTU) ved å tilsette 30 mg PTU til 1 L 1X E3. Stir O / N for å sikre at PTU er helt oppløst. Oppbevar ved romtemperatur.
- For å fremstille pronase oppløsning fortynnes 150 ul pronase (0,5 mg / ml) med 15 ml 1X E3. Dette beløpet er tilstrekkelig for en petriskål. Bruk umiddelbart.
- Forbered Methylcellulose løsning.
- Forbered E3-Tricaine løsning ved å blande 75 ml 0,2% Tricaine med 25 ml1X E3. Kok 3 g metylcellulose i 75 ml av E3-Tricaine løsning.
- Utgjør den endelige volumet til 100 ml med E3-Tricaine løsning. Den endelige metylcelluloseoppløsning er tyktflytende og ugjennomsiktig med en gulaktig fargetone. Oppbevaring: RT beskyttet mot lyset.
- Tamoxifen lager og induksjon løsning
- Forbered 5 mM tamoxifen stamløsning ved å oppløse 4-hydroxytamoxifen i 100% etanol. Butikk lager ved -80 ° C.
- Forbered frisk fortynning av tamoksifen ved ønsket konsentrasjon i 1X E3 for å oppnå den induksjon løsningen. FORSIKTIG! Ta kontakt med HMS-datablad før bruk.
- Forbered en L på 0,2% Tricaine som per tabell 3.
- Skaff konfokale lysbilder. Lim fire dekkglass (18 x 18) sammen for å danne en blokk 2 og deretter plassere blokkene på et 24 x 60 dekkglass 2 cm fra hverandre for å tillate montering av embryoet i midten.
2. Embryo Forberedelse
- Transgene linjer.
- sox10: ERT2-Cre
MERK: Generer målretting vektor pDestTol2- sox10: ERT2-Cre ved hjelp av standard molekylær kloning metoder og kommersielt innhentet rekombinasjon kloning teknologi.- Kombiner 5 'entry klone (pENTR5'- sox10p) inneholder 7.2Kb av sox10 arrangøren, en Gateway midten klone (PME-ERT2-Cre), og en 3' oppføring klone (pENTR3'-polyA) i et LR reaksjon med linse reisemålet vektor pDestTol2- α-crystallin: YFP.
- Rens konstruere pDestTol2- sox10: ERT2-Cre. Co-injisere renset konstruksjon (100 ng / mL) med Tol2 transposase mRNA (50 ng / mL) i WT embryoer (F0) på en celle stadiet.
- Skjerm F0 voksne grunnleggere for bakterie nettoverføring basert på sterk gul fluorescens i F1 embryoer.
- sox10: ERT2-Cre; Zebrabow-M
- Parre den Zebrabow-Mlinje (2.1.1) med sox10: ERT2-Cre transgen linje.
- Velg embryoer som utviser en sterk stedsnærværende RFP uttrykk og YFP objektiv markør og dyrke dem til voksne.
3. Embryo Collection
- Sett opp flere par sox10: ERT2-Cre; Zebrabow-M transgen sebrafisk 17:00-18:00 på dag 1.
- Dagen etter trekker skillevegger i morgen og samle egg utpå formiddagen.
- Overføre dem til petriskåler og tilsett 15 ml av pronase løsning dechorionate embryoene.
- Inkuber embryoene i 1 til 5 min til cirka 60% av embryoene har blitt dechorionated. Stopp reaksjonen ved dekantering av løsningen og vask pronase embryoene 3-4 ganger med friskt medium E3.
- Inkuber dechorionated embryo i E3 på RT O / N og la dem utvikle for å nå 10 somites scenen. Inkuber 50-60 embryoer pr clutch for å unngå ulike utviklings vekst. 4. Behandling
- Sjekk embryoene 'utviklingsstadiet under et lys feltet mikroskop for å sikre at de er på 10 somites scenen.
- Ved hjelp av en fluorescerende mikroskop med en rød fluorescerende protein (RFP) filter, isolere de lyse røde embryoer.
- Fortsett til induksjonen av Cre-rekombinasjon ved tilsetning av 10 uM av hydroxytamoxifen løsning på petriskål og inkubering av de isolerte embryoene ved 28,5 ° C i 3 timer.
- Dekanter tamoxifen løsningen og vask embryoene flere ganger med E3.
FORSIKTIG! kasser tamoxifen oppløsning i en spesiell biologisk avfallsbeholder. - Inkuber embryo ved 28,5 ° CO / N.
- Når embryoene er omtrent 28-29 somites scenen (rundt 24 timer etter befruktning), ruge embryoene på 28,5 ° C i E3-PTU løsning heretter.
MERK: PTU er her brukt til å hemme dannelsen av Melanophores i utviklings embryoer. Denne behandling er nødvendig for å kunneunngå signal forvrengning av fluorescens av auto-fluorescerende Melanophores. - Inkuber embryo ved 28,5 ° C
- For å visualisere de fullt utviklede kraniofaciale strukturer, velg embryoene på 4 dager etter befruktning for intensiteten av Red signal og Cre uttrykk markør positivitet (gul i netthinnen).
- Anesthetize embryoene med E3 / 0,015% Tricaine løsning. Anestesi er bekreftet når ingen aktive bevegelser eller fin aktivitet er observert når forsiktig pirket embryo.
- Overføre valgt embryo for avbildning i en petriskål som inneholdt en dråpe av metylcellulose og forsiktig balsamere embryoet med methylcellulose.
- På en ren konfokalt sklie, plasserer en dråpe frisk propylmetylcellulose og montere embryo innenfor slipp ved hjelp av en microloader tips. Posisjon embryo dorsally tar forsiktig så du ikke berørerembryoet direkte.
- Dekk montert embryo med en 25 x 25 dekkglass og justere posisjonen av embryoet om nødvendig ved å manipulere dekkglass.
- Embryoet er nå klar til bildet.
- Bruk 20x tørr objektiv objektiv (numerisk apertur 0,75; pinhole størrelse 2,0 mikrometer) for å fokusere embryo.
- Trykk på L100 knappen på mikroskopet og velge kanaler i programvaren.
- Velg confocal setup-knappen, og klikk "auto" og velg følgende kanaler før du lukker vinduet: Ch1: CFP, CH2: GFP, Ch3: RFP eller mCherry
- Slå på CH2 og CH3 før du klikker på "fjern interlock" -knappen. Klikk "play" for å starte skanningen.
- Fokus på strukturen av interesse, noe som gjøres best ved å starte med ½ ramme / sek og høy spenning (HV) 150 og deretter justere innstillingene i henhold til ønsket bildekvalitet er achieved. RFP ville være lysere enn andre farger, derfor justere HV. Endre Z posisjon til å finne både YFP og RFP positive celler.
- En gang satt med innstillingene, ta bildet av embryo. Lagre bildet i confocal bildebehandling format og TIFF-format for bildebehandling i hvert split kanal.
- Neste, for CFP bildebehandling, slå av CH2 og CH3 og slå på Ch1. Re-justere innstillingene som i trinn 5 uten å endre fokusområdet.
MERK: CFP kan være veldig vanskelig å oppdage på grunn av bakgrunnssignal i blå kanal som kan omgås ved å justere pinhole størrelse. En større pinhole størrelse tillater bedre deteksjon av fluorescens ved å redusere signal / bakgrunnsstøyforhold. Imidlertid vil større pinhole redusere konfokalt effekt, går på bekostning av bildekvaliteten. Derfor er nøye justering av innstillingene som kreves for å oppnå den ønskede bildekvalitet og intensitet. - Ta bildet og lagre det i begge format (konfokal programvare og TIFF) for bildebehandling. Bilder kan da bli behandlet ved hjelp av vanlige bildebehandlingsprogramvare for å flette lag og bedre fargeinnstillinger som beskrevet av Pan og kolleger 8.
5. Embryo Selection
6. Montering av Embryo i Methycellulose
7. Analyse av Fluorescensmikroskopi
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tradisjonell brusk visualisering av hele mount Alcian blå flekker har vært uvurderlig i å observere utviklingen Meckels brusk og vanligvis brukes til å visualisere slutt cellular organisasjon 12 (figur 1A). For ytterligere å analysere utviklings chondrocytes overtid, avstamning sporing ved hjelp sox10: Kaede transgene linjer har gitt oss mulighet til å studere cellemigrasjon, konvergens og forlengelse i levende embryoer 2,12 (Figur 1b). Men fortsatt organisering av chondrocytes i kraniofaciale skjelettstruktur dårlig forstått. Ved direkte avbildning, er Zebrabow-M transgen linje i stand til å avsløre prosessen med kondrocytt innskyting og forlengelse som medierer forlengelse og vekst av Meckels brusk (figur 1C-G).
I denne protokollen, Ubi: Zebrabow-M; sox10: ERT2-Grobunn embryoene ble behandlet med tamoxifen 10 somites og kondrocytes i underkjeven ble visualisert på forskjellige tidspunkter under utvikling (fra 3 dpf til 5 DPF). Underkjeven er best avbildet ventralt å tillate fri utsikt over Meckels brusk uten forstyrrelser av den ethmoid plate og neurocranium dorsally. De stabilt opprettholdt og arvet farger tillater enkel avstamning oppsporing og CNCC celler skjebne kartlegging som antydet med de sorte piler i figur 2A-2D. Singelen blå celle ser ut til å migrere og intercalate med sine nabocellene. Det elongates deretter langs anterior-posterior aksen for å danne et jevnt formet kondrocytt dermed opprettholde den globale formen på Meckels brusk som det strekker anteriorly.
Denne teknikken gjør det mulig å studere nedre kjevevekst misdannelser på celle og organ-nivå i forhold som Robin sekvens hvor mikrognati er en av de fremtredende egenskaper som er beskrevet. Svikt i spredning, tilbygg eller innskyting kan være effektivt visualisert i t Han vokser kondrocytter over tid.
| NaCl | 14,61 g |
| KCl | 0,65 g |
| CaCl2 | 1,83 g |
| MgSO4 | 1,99 g |
| Avionisert H 2 O | 1000 ml |
| * Oppbevaring: RT | |
| ** Til en dråpe av metylen blått som en anti-sopp | |
Tabell 1. 50X E3 embryonale medium oppskrift
| 50X E3 | 20 ml |
| Avionisert H 2 O | 980 ml |
| * Oppbevaring: RT | |
| 1M Tris-Cl (pH 9,5) | 9 ml |
| Tricaine | 2 g |
| Avionisert H 2 O | Fyll opp til en L |
| * Oppbevaring: RT | |
Tabell 3. 0,2% Tricaine oppskrift
Figur 1. (A) Fluorescens Meckels brusk av sox10:.. GFP (B) dissekert Meckels brusk av en fire dpf Tübingen embryo farget med Alcian Blå (C) Transgene sebrafisk linjer Ubi: Zebrabow-M kors med sox10: ERT2-ere. (DG) Ubi: Zebrabow-M; sox10: ERT2-Cre bilde i RFP (D), YFP (E), CFP (F) kanaler og flette (G). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. (AD) Timelapse fotografering av Zebrabow-M: sox10: ERT2-Cre på 3dpf (A), 3.5dpf (B), 4dpf (C) og 5dpf (D). Svarte pilene peker til samme enkelt klon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Alcian blått og photoconvertible transgene linjer som beskrevet ovenfor utfyller hverandre for å definere innviklet prosess av brusk og bein utvikling. Imidlertid har levende cellemigrasjon og organisasjon under organ lenge vært en teori og indirekte demonstrert men aldri visualisert. Zebrabow-M transgen linje kombinert med en brusk bestemt Cre tillater samtidig levende observasjon av alle disse forskjellige arrangementer som er involvert i bein og brusk formasjon. Denne teknikken gjør det mulig å studere nedre kjevevekstdefekter på celle og organ-nivå i forhold som Robin sekvens hvor mikrognati er en av de fremtredende egenskaper som er beskrevet. Svikt i spredning, tilbygg eller innskyting kan effektivt visualisert i de voksende chondrocytes over tid.
Color mangfold optimalisering
Optimalisere Grobunn nivåer ved å titrere konsentrasjonen av 4-hydroxytamoxifen kan styre extent av rekombinasjon og farge mangfold uten å resultere i embryo letalitet. Østrogen er kritisk for normal retinal utvikling og derfor kan høyere doser av tamoxifen (> 25 pm) indusere hinnen degenerasjon, høy dødelighet (~ 60 til 80%), kraniofaciale misdannelser og utviklingsmessige forsinkelser. I tillegg, er 4-hydroxytamoxifen fortynnet i etanol, som i seg selv er toksisk under embryonal utvikling 13. Derfor er det viktig å bestemme den beste konsentrasjonen og varigheten av utstilling for å oppnå en god rekombinasjon hastighet, men begrense toksisiteten for embryoer.
Den ønskede konsentrasjon av 4-hydroxytamoxifen er optimalisert i denne protokollen. Forskjellige konsentrasjoner (5-25 uM), induksjon tidspunkter (10 somites, 24, 36 og 48 HPF) og varighet (30 min til 6 timer) ble testet (data ikke vist). En lav dose av tamoxifen (5 mm) produsert et begrenset rekombinasjon mens høyere doser (fra 10 mm til 20 mm) produsert simvis lik rekombinasjon og farge mangfold. Doser større enn 20 mikrometer kompromittert normal utvikling av embryoer og derfor ikke egnet for å studere kraniofaciale misdannelser. Induksjon varighet mindre enn 2 timer var ikke tilstrekkelig til å skape tilstrekkelig rekombinasjon mens over seks timer av induksjon indusert toksisitet og uregelmessigheter i embryoene utviklings. Induksjon av tre eller fire timer viste ingen forskjell i mengden av rekombinasjon og resultater.
Induksjon etter 24 HPF fosterstadiet ikke produsert ønsket rekombinasjon og fluorescerende uttrykk. Derfor ble det beste kompromiss mellom normal utvikling og passende mengde av farger uten å resultere i betydelig høye tall av embryoniske dødelighet bestemt til å være 3 timer med induksjon ved 10 somites med 10 uM konsentrasjon av tamoxifen.
Bildekvalitet
Innhenting bilder konsistent og høy kvalitet kan være utfordrende. Hvis en enkelt felt av VIew ikke er i stand til å visualisere hele Meckels brusk eller craniofacial strukturen av interesse, kan hele strukturen kartlegges ved å ta Z-stabler. Men å skaffe Z-stabler kan være utfordrende i levende embryo bildebehandling på grunn av bevegelse gjenstander. Derfor er det viktig å ha et kompromiss mellom kvaliteten av Z-stabelen bilde, mengden av informasjon nødvendig under avbildningssesjon og forebyggelse av laserindusert foto-bleking ved lengre sikt lasereksponering.
En annen begrensning ved denne teknikken er at fluorescerende proteiner som ikke viser den samme stabilitet under avbildning. For eksempel RFP er et relativt stabilt protein, men YFP kan være ustabil. Derfor er det viktig å bestemme den beste bildeinnstillingene empirisk for å detektere det maksimale antall av farger i et gitt embryo med passende intensitet.
I tillegg til fargestabilitet, er konfokalmikroskop annen begrensning, fordi det ikke er i stand til å lese CFPog YFP kanaler sammen. Dette skyldes det faktum at utslippet fra CFP blir detektert i både 470nm og 535 nm kanaler. I tillegg emisjonsspekteret av CFP (470-535nm) og eksitasjon spekteret av YFP (530nm) overlapper hverandre, noe som skaper et FRET (fluorescens-resonans energioverføring) gjenstanden. Med andre ord, når den CFP fluorescens blir detektert, eksiterer det YFP fluorescens og dermed skape et ikke-spesifikt signal. Av denne grunn, skisserer denne protokollen skanne alle fluorescens kanaler var separat og sammenslåing av enkeltbilder separat med en felles bildebehandlingsprogramvare. For å omgå begrensningene av konfokal mikroskop, kan en to-fotoner mikroskop brukes som beskrevet i Pan et al papir der alle tre fluorescens uttrykk kan leses samtidig som åpner for mer farge mangfold 8. Pan et al har beskrevet et stort spekter av farger mangfold i sine Zebrabow-M linjer (opptil 30 farger). Etter vilkårene som er beskrevet i denne protocol kan forskjellige intensiteter av fluorescens og rekombinasjoner oppnås som vist i figur 2, selv om noen farge permutasjoner kan ha gått tapt under etterbildeprosessering.
Color arv og klonale analyser
Pan et al har beskrevet stabilt opprettholdt fargen arv i Zebrabow-M fra stamfar til avkom som gjør det mulig for skjebnen kartlegging 8. Denne protokollen fokusert på nevrale CNCC celler for å karakterisere dannelsen av Meckels brusk. Bruken av CreERT2 i sebrafisk muliggjør effektiv tamoxifen indusert loxP kassett rekombinasjon og evnen til å kontrollere angrep av CNCC avstamning merking under craniofacial utvikling. Denne fremgangsmåten kan lett tilpasses for å visualisere alle neural crest derivater foruten Meckels brusk. I tillegg bruker en annen transgen reporter linje for klonal analyse i ulike organsystemer vil markere annerledes moder av cellevekst under organogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Forfatterne takker Alex Schier for velvillig deler Zebrabow-M transgen linje, Geoffrey Burns for pDEST vektor og Renee Ethier-Daigle for godt vare på fisken anlegget og linjer.
FINANSIERING:
Vi er takknemlige for generøs finansiering støtte fra NIDCR RO3DE024490 og Shriners Hospitals for Children (ECL) og postdoktortreningsstipend fra Shriners Hospitals for Children (LR og YK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pronase | Roche Life Sciences | 10165921001 | Prepare 500 μl stock aliquots at 50 mg/ml |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0262 | |
| PTU (N-Phenylthiourea) | Sigma-Aldrich | P7619 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 4-HydoxyTamoxifen | Sigma-Aldrich | T176 | |
| 24 x 60 coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| 18 x 18 coverslips | Fisher Scientific | 12-540A | |
| 25 x 25 coverslips | Fisher Scientific | 12-540C | |
| pENTR5'-TOPO TA Cloning Kit | Life technologies | K591-20 | |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Life Technologies | K2400-20 | |
| pENTR3'-pA | Tol2Kit | 302 | |
| pDEST | Gift from Geoffrey Burns labs | ||
| Bright field microscope | |||
| Fluorescent microscope | |||
| Confocal microscope | |||
| Image processing software |
References
- Dougherty, M., et al. Distinct requirements for wnt9a and irf6 in extension and integration mechanisms during zebrafish palate morphogenesis. Development. 140, 76-81 (2013).
- Dougherty, M., et al. Embryonic fate map of first pharyngeal arch structures in the sox10: kaede zebrafish transgenic model. The Journal of craniofacial surgery. 23, 1333-1337 (2012).
- Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development. Development. 133, 1069-1077 (2006).
- Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nature reviews Genetics. 12, 167-178 (2011).
- Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. Visualization of craniofacial development in the sox10: kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50525 (2013).
- McCollum, C. W., Ducharme, N. A., Bondesson, M., Gustafsson, J. A. Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth defects research. Part C, Embryo today : reviews. 93, 67-114 (2011).
- Mossey, P. Dental education and CPD: are you being served. British dental journal. Suppl, 3-4 (2002).
- Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
- Vieira, A. R. Journal of dental research. 87, 119-125 (2008).
- Le Pabic, P., Ng, C., Schilling, T. F. Fat-Dachsous Signaling Coordinates Cartilage Differentiation and Polarity during Craniofacial Development. PLoS genetics. 10, e1004726 (2014).
- Ricks, J. E., Ryder, V. M., Bridgewater, L. C., Schaalje, B., Seegmiller, R. E. Altered mandibular development precedes the time of palate closure in mice homozygous for disproportionate micromelia: an oral clefting model supporting the Pierre-Robin sequence. Teratology. 65, 116-120 (2002).
- Javidan, Y., Schilling, T. F. Development of cartilage and bone. Methods in cell biology. 76, 415-436 (2004).
- McCarthy, N., et al. Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD. Development. 140, 3254-3265 (2013).
