Veel zoogdiercellen migreren bij voorkeur naar een stijvere matrix of substraat via durotaxie. Het doel van dit protocol is om een eenvoudig in vitro systeem te bieden dat kan worden gebruikt om cel durotaxie gedragingen te bestuderen en te manipuleren door het opnemen van polydimethylsiloxaan (PDMS) substraten van gedefinieerde stijfheid, in combinatie met glazen dekglasjes.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een vereenvoudigd systeem voor het evalueren van de Cel Mechanosensing en Durotaxis
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De samenstelling en de mechanische eigenschappen van de extracellulaire matrix sterk uiteen weefseltypen. Dit bindweefsel stroma diversiteit grote invloed cel gedrag normaal en pathologische processen, waaronder proliferatie, differentiatie, hechting signalering en directionele migratie te reguleren. In dit verband, het aangeboren vermogen van bepaalde celtypen migreren naar een stijver of minder compatibele matrix substraat wordt genoemd durotaxis. Dit fenomeen speelt een belangrijke rol tijdens de embryonale ontwikkeling, wondgenezing en kankercel invasie. We beschrijven hier een eenvoudige test om durotaxis studie, in vitro, met behulp van polydimethylsiloxaan (PDMS) substraten. Bereiding van de beschreven durotaxis kamers creëert een stijfheid interface tussen de relatief zachte gel PDMS en een stijf glazen dekglaasje. In het voorbeeld hebben we deze durotaxis kamers gebruikt om een rol voor de Cdc42 tonen / Rac1 GTPase activerende protein, cdGAP in mechanosensing en durotaxis regelgeving in menselijke U2OS osteosarcoomcellen. Deze test is gemakkelijk aan te passen aan andere typen cellen en / of knock-down van andere eiwitten van de belangen van hun respectieve rollen verkennen in mechanosignaling en durotaxis.
Inleiding
De extracellulaire matrix (ECM) bestaat uit een complexe reeks van structurele en verknopen van proteïnen zoals collageen, fibronectine en laminine. Hoewel het goed is vastgesteld dat de ECM levert belangrijke structurele steun voor cellulaire weefsels, is er steeds meer bewijs om aan te geven dat cellen actief inspelen op de fysieke veranderingen in hun ECM-omgeving om diverse cellulaire processen zoals overleving van de cel, differentiatie en celmigratie reguleren. Zo kunnen verschillen in stijfheid van de ECM mesenchymale stamcellen rijdt richting verschillende geslachten, met zachte substraten (~ 1 kPa) bevordering neurogene lineages terwijl stijve (~ 25 kPa) sub....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Voorbereiding van Durotaxis Chambers
- Een 6-well weefselkweek plaat voor te bereiden, tarra de balans met een 50 ml conische buis. Weeg ongeveer 10 g PDMS basisoplossing in de 50 ml buis (de oplossing vrij viskeus).
- Voor een 90: 1 substraat (Overeenstemming van ~ 1 kPa), verdeel het gemeten gewicht van de PDMS basisoplossing in de buis 90 door de juiste hoeveelheid verknopingsmiddel oplossing nodig te bepalen. Voeg de berekende hoeveelheid PDMS crosslinker oplossing dezelfde buis.
Voorbeeld: 10 g / 90 = 0,11 g. Voeg 0,11 g PDMS crosslinker oplossing van het PDMS basisoplossing.
Opmerking: De basis en crosslinker oplossingen zijn b....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een schema van de durotaxis kamer wordt getoond in figuur 1A. Soft PDMS substraat (een 90: 1 mengsel van PDMS base oplossingen verknopingsmiddel) is verdeeld in een 6 putjes en een glazen dekglaasje geplaatst bovenop de PDMS, die vervolgens gedeeltelijk bedekt het bovenoppervlak van het dekglaasje waardoor een interface creëren tussen de twee substraten van verschillende compliance. De stijfheid van het zachte PDMS substraat ~ 1 kPa, vergelijkbaar met de typische naleving van hersenweefsel, terwijl de s.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hierin beschrijven we een eenvoudige test om durotaxis bestuderen migrerende cellen. Een grote kracht van deze test is het gemak van de voorbereiding van de durotaxis kamers met behulp van PDMS. De stijfheid van de substraten kunnen gemakkelijk worden gemanipuleerd door de verhouding van PDMS base oplossing verknopingsmiddel voor de studie van diverse starheid in de test toe. Echter, een mogelijke beperking van het systeem is dat cellen alleen worden blootgesteld aan een enkele verandering in substraat stijfheid tegenst.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Dankbetuigingen
Dit werk wordt ondersteund door NIH R01 GM47607, CA163296 en NSF 1.334.493 te CET. Wij danken de leden van de Turner lab voor kritische lezing van het manuscript. Alle in dit rapport gegevens werden overgenomen met toestemming van Wormer et al. 2014 11.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit |
| #1 Cover glass 12 mm | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| 6-well plate | Celltreat | 229106 | |
| DMEM | Cellgro | 15-017-CM | |
| L-Glutamine | Cellgro | 25-005-CI | |
| Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BP356-100 | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 610077 | |
| PBS | Invitrogen | 21600-044 | |
| Falcon tubes | Celltreat | 229456 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| U2OS cells | ATCC | HTB-96 |
Referenties
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Levental, K. R., <....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
