Abstract
İnme araştırması klinik uygulamaya nöroprotektif tedavilerin tercüme birçok aksiliklere dayandı. Buna karşılık, gerçek dünya tedavisi (tPA trombolitik) nadiren preklinik inme araştırma hakim mekanik tıkanıklığı tabanlı deneysel modellerde faydaları üretir. Tezgah ve Yatağımın arasındaki bu bölünme klinik öncesi inme araştırma tPA-duyarlı modeller istihdam ihtiyacını göstermektedir. Bu amaçla, basit ve tPA-reaktif trombotik inme modeli icat burada tarif edilmektedir. 37.5 ± 0.5 ° C 'de, hayvan, rektal sıcaklık muhafaza edilirken bu model, 30 dakika boyunca, yetişkin farelerde bir yüz maskesi vasıtasıyla tek taraflı karotis ve% 7.5 oksijen teslimat geçici oklüzyonu meydana gelir. Tek taraflı karotis arter veya hipoksi geri dönüşümlü ligasyonu her biri sadece geçici serebral kan akımı bastırılmış olsa da, her iki hakaret kombinasyonu reperfüzyon açıkları, fibrin ve trombosit birikimi ve büyük infar kalıcı nedenorta serebral arter tarafından sağlanan bölgede ct. Önemli olarak, kuyruk ven 0.5, 1, ya da 4 saat sonra-Thi (10 mg / kg) yeniden birleştirici tPA enjeksiyonunu bir ölüm oranı ve enfarkt boyutunun zamana bağımlı bir azalma sağladı. Bu yeni model, inme basit ve deney sonuçlarını karşılaştırmak için laboratuvarlar arasında standardize edilebilir. Bundan başka, bu kraniektomi ya da önceden-oluşturulmuş emboli yol açmadan tromboz indükler. Bu eşsiz yararları göz önüne alındığında, THI modeli klinik öncesi inme araştırma repertuvarına bir kullanışlı bir ektir.
Introduction
Tromboliz ve rekanalizasyonun klinik pratikte 1 akut iskemik inme en etkili tedavidir. Oysa, klinik öncesi araştırma nöro çoğunluğu damar tıkanıklığı çıkarılması üzerine serebral kan akımının hızlı iyileşme üreten ve tPA lizisle hiçbir fayda az gösteren bir geçici mekanik tıkanıklık modeli (lümen dikiş orta serebral arter tıkanıklığı) uygulandı. Inme modelini şüpheli seçimi hastanın 2,3 için nöro-koruyucu tedavisi çeviri zorluk, en azından kısmen, katkıda bulunduğu öne sürülmüştür. Bu nedenle, klinik öncesi araştırma tPA duyarlı tromboembolik inme modelleri istihdam için artan bir çağrı var, ama bu tür modelleri de teknik sorunlar (Tartışma) 4-7 var. Burada tek taraflı geçici hipoksik-iskemik (ti) hakaret ve intravenöz tPA tedavisine 8 yanıtları dayalı yeni bir trombotik inme modeli açıklar.
Thi inme modeli 1960 9 yetişkin sıçan deneyleri için icat edilmiştir Levine prosedürü (bir odasında geçici hipoksi maruz kalma ve ardından tek taraflı karotis arter kalıcı ligasyonu) dayalı olarak geliştirilmiştir. Orijinal Levine prosedürü karanlığa gömüldüğü, çünkü sadece değişken beyin hasarı üretti, fakat 1981 10 neonatal hipoksik-iskemik ensefalopati (HİE) bir model olarak Robert Vannucci ve arkadaşları tarafından yeniden tanıtıldı aynı hakaret kemirgen yavrular tutarlı nevropatolojisi neden oldu. Son yıllarda, bazı Araştırmacılar hipoksik odasına 11 sıcaklığı ayarlayarak yetişkin farelere Levine-Vannucci modeli adapte yeniden. Orijinal Levine prosedüründe tutarsız beyin lezyonları hipoksik odasında yetişkin kemirgenler vücut sıcaklıklarını dalgalanan doğabilecek düşünülebilir. Bu hipotezi test etmek için, hipoksik gaz verilerek Levine prosedürünü modifiyeBir yüz maskesi vasıtasıyla, ameliyat masasına 12, 37 ° C'de, kemirgen temel sıcaklık muhafaza edilirken. Beklendiği gibi, katı vücut ısısı kontrolü büyük ölçüde HI-kaynaklı beyin patolojisi tekrarlanabilirliği artmıştır. HI hakaret de pıhtılaşmayı, Otofaji ve gri-beyaz-madde hasarı 13 tetikler. Diğer araştırmacılar da inme sonrası inflamatuar yanıtlar 14 araştırmak için HI modeli kullandık.
HI inme modelinin benzersiz bir özelliği de yakından kan akımı, endotel hasarı (örn nedeniyle HI-kaynaklı oksidatif strese) ve hiperkoagübilite (HI-indüklenen platelet aktivasyonu) staz dahil trombüs oluşumu Virchow'un üçlü, (aşağıda olduğunu Şekil 1A) 15. Bu nedenle, HI modeli gerçek dünya iskemik inme ile ilgili bazı patofizyolojik mekanizmaları yakalayabilir. Bu düşünceyle, biz daha un tersine çevrilebilir ligasyonu ile HI modeli rafineilateral karotis arter (dolayısıyla geçici HI hakaret oluşturmak için), ve ya Edaravone olmadan tPA trombolitik onun yanıtları test edilmiştir. Edaravone zaten başlangıç 9 24 saat içinde iskemik inme tedavisinde Japonya'da onaylanmış serbest radikal temizleyicisidir. Bizim deneyler kadar kısa 30 dakika kadar geçici HI trombotik enfarktüs tetikler gösterdi ve bu kombine tPA-Edaravone tedavi sinerjik faydalar 8 bahşeder. Burada detaylı cerrahi girişimler ve akut iskemik inme reperfüzyon tedavileri optimize etmek için kullanılabilecek Thi modelinin metodolojik hususlar, açıklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol Emory Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış ve Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Sağlık Talimatı'nın Ulusal Enstitüleri izler.
1. Kur
- Ameliyat öncesi en az 15 dakika süreyle 37 ° C'de ısı pompası ile bağlantılı ısınma pad cerrahi yatak hazırlayın. Cerrahi yatakta 3 ml şırınga varil kullanarak boyun rulo yerleştirin. Tıbbi havada% 2 izofluran ile anestezi gazı hazırlayın.
- Otoklavlanmış forseps, makas, iğne mikro sahipleri, hemostat, pamuklu ve sütür hazırlayın. Doku yapıştırıcısı ve göz merhemi hazırlayın.
- Isıtma lambası ve rektal prob ile hipoksi sistemi ve sıcaklık kontrol ayarlayın. % 92.5 N 2 göre dengeli 7.5% O 2% 2 izofluran ile hipoksi gazı hazırlayın.
- Bir saat ameliyattan önce, fareler yavaş salınım Meloksikam (4.0 mg / kg) deri altından enjeksiyonu ile analgesized edilir.
- 10-13 haftalık erkek C57BL anestezisi / hayvan ayak sıkmak yanıt vermeyen ve daha sonra bir elektronik tıraş makinesi kullanarak doğru boyun saç kaldırmak kadar% 3 izofluran ile anestezi indüksiyon odasında 22 ila 30 g ağırlığındaki 6 fareleri.
- 2 litre / dakika akış hızında, tıbbi hava içinde% 2 izofluran ile bağlantılı cerrahi yatak fareler yerleştirin. Güvenli ön ayakları tıbbi bant kullanarak yanlarda boyun rulo boyunca uzanmış.
- Alkol ve daha sonra pamuklu tarafından takip betadin kesi cerrahi siteyi temizleyin.
- Diseksiyon mikroskop altında düz bir forseps ve yaklaşık 0.2 cm orta hat cilt yanal mikro makas kullanarak 0.5 cm sağ servikal kesi yapmak.
- Sağ karotis arter (RCCA) maruz fasya ve doku dışında çekin ince dişli forseps bir çift kullanın. Dikkatle ince yumuşak forseps bir çift kullanarak vagus sinirden RCCA ayrı.
- Canlı RCCA üzerinde (serbestleştirilebilen) iki precut 5-0 ipek sütür düğüm, sonra 4-0 Naylon monofilament sütür (Şekil 1C) kullanarak cilt dikmek.
- Kuruluğunu önlemek için her iki göze göz merhemi sürün.
- Hızla hipoksi sistemine fareler aktarmak ve 30 dakika boyunca / 0.5-1 L akış hızında% 7.5% 2 izofluran ile yüz maskesi olarak min O 2 burun ve ağız koydu.
- Hipoksi sırasında, 37.5 ± 0.5 ° C'de rektal sıcaklığı kontrol etmek için ısıtma lambalı sıcaklık kontrolörleri kullanın. / Dk 80-120 nefesler solunum hızını izleyin. hipoksi sırasında 37 ° C'nin üzerinde vücut ısısı bakım tutarlı beyin enfarktüsü oluşturmak için önemlidir. Düşük solunum hızı genellikle 20 dakika hipoksi sonra olur. Yüz maskesi çıkarın ve solunum hızı Bu 1-2 dakika sürer ve 30 dakika hipoksi süresi içine sayılmaz 40'a altına düşerse, normal hava girişini sağlar.
- Hipoksi sonra, aktarmakcerrahi yatağa fareler ve RCCA iki sütür serbest bırakın. Kafesine fareler dönün doku yapıştırıcı kullanarak yara kapatın ve. İki canlı knot hem beklenmedik hipoksi sonra yayımlanan ise hayvanların dışla.
- Hipoksi ve anestezi kurtarmak için 5-10 dakika boyunca fareler izleyin. Kafeste ıslanan yiyecek koyun ve hayvan bakım tesisi iade.
Not: Thi 24 saat sonra şiddetli çizerek davranışı hafif gösteren hayvanlar beyin kural ihlali ile ilişkilidir. Nöbet semptomları olan çoğu hayvanlar THI sonra 24 saat timepoint gelmeden ölmektedir.
3. Lazer Benek Kontrast Görüntüleme
Not: Bu thi modelin önemli bir işlem değildir, ancak, iki boyutlu bir lazer benek kontrast görüntüleme sistemi 16 içinde ya da geçici hipoksi-iskemi sonrası beyin kan akışının (CBF) değişiklikleri karakterize etmek için kullanılabilir. St hemen sonra, THI altında rekor CBF değişiklikler belgelemek içinep 2.6. Alternatif olarak, bu işlemler adım 2.10 Aşağıdaki yapılabilir, THI hakaret sonra CBF kurtarma karşılaştırmak.
- Yüzüstü pozisyonda bir anestezi fare yerleştirin ve maruz ancak açılmamış kafatası ile saçlı deride 1 cm uzunluğunda orta hat kesi yapmak.
- Üreticinin protokolüne göre bir kan akışı görüntüleyici altında hem serebral hemisferde CBF Monitör ve CCAO cerrahisi (adım 2.6) hemen sonra serebral kan akımını kaydetmeye başlayın. 50 dakika devam edin.
- 16 renk paleti keyfi birimleri ile CBF görüntüyü göstermek ve gerçek zamanlı olarak analiz üreticinin talimatlarına (Şekil 2) Aşağıdaki MoorFLPI yazılımını kullanarak seçilen bölgeler.
- CBF görüntüyü kaydettikten sonra, doku yapıştırıcısı ile kafa derisi kapatın ve kafesine hayvan dönün.
4. tPA İdaresi
- (220-300 ve kg yeniden birleştirici tPA / çözücü ya da 10 mg kuyruk damarından hayvanların enjekte956. 1 mg / m tPA) l, 0.5, 1 ya da tCCAo artı hipoksi sonra 4 saat sonra (Şekil 4).
Birkaç Farklı Seçenekleri ile 5. Brain Damage Algılama
Beyin örnekleri toplamak için Thi sonra 1, 4 veya 24 saatte fareler euthanize: Not.
- Açıklanan önceki olarak Thi hakaret sonra 24 saat in vivo 2,3,5-Triphenyltetrazolium klorür enfarktüs hacminin ölçümü yapın (TTC) yöntemi. 17
- İntraperitoneal 1.4 M mannitol çözeltisi (~ 0.1 ml / g vücut ağırlığı) transcardial perfüzyon 30 dakika önce hayvanlara enjekte edilir. PBS ile perfüze Transcardial farenin% 2 TTC 10 ml eklenmiştir.
- 10 dakika sonra, cerrahi aletler ile hayvanların beyin çıkarın ve bir vibratome 1 mm kalınlığında içine gece boyunca tespit ve bölüm için% 4 paraformaldehid içine koyun.
- Dijital mikroskop ve kuvantı dört kesitli beyin slaytlar bir dizi çekinImageJ yazılımı kullanarak hasarsız, kontralateral yarımkürenin alanına enfarkte alana (sağ tarafta beyaz alan) oranı olarak enfarktüs hacmini ify.
- Alternatif olarak, THI hakaret sonra 1 saat sonra immünofloresans ile tromboz oluşumunu gerçekleştirin.
- Ekim bileşik ve bölüm bir Kriyostat kullanılarak 12 mikron kalınlığında beyinleri sabit beyin dondurun.
- Bir floresan mikroskop üzerinde floresan gözlemlemek için: keçi anti-tavşan Alexa Floro 488 boya (200 1) ile: (1: 100), aşağıdaki tavşan anti-fibrinojen antikor ile beyin slayt inkübe edin.
- Alternatif olarak, thi akıntıdan sonra 4 saat sonra, 100 ul% 2 Evans mavi boya kuyruk damarı enjeksiyonu ile damar tıkanıklığı gerçekleştirin.
- Evans mavisi enjeksiyondan sonra% 4 paraformaldehid içine beyinleri kaldırmak için başını kesip hızla fareler Euthanize ve. Not: Hem fotoğrafların ön mavi renk ile Evans mavisi dolaşım için 5-10 dakika sürer ve bacaklarda gerisinde kalınmıştır.
- Secti100 mikron kalınlığında sabit beyinleri üzerinde kayan bir mikrotom kullanılarak ve bir floresan mikroskop üzerinde 680 nm emisyon filtre kullanarak floresan gözlemleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İki boyutlu lazer benek kontrast görüntüleme (LSCI) 16 30 dk geçici tek taraflı karotis tıkanıklığı (tCCAO), hipoksi 30 dakika maruz kalma (% 7.5 oksijen) ve 30 dakika tek taraflı serebral kan akımı (CBF) ve değişiklikleri karşılaştırmak için kullanıldı hipoksi (ti) altında ligasyonu karotis. Bu deney tCCAO normoxia altında karotis bağlandı yarımkürede CBF bastırılmış ortaya için ~ hızla karotis tıkanıklığı (Şekil 2A R) yayımlandıktan sonra 85 üzerinde% kurtarılan bazal değerin,% 50. Sistemik hipoksiye maruz kalma yalnız geçici normoksik atmosfer (Şekil 2B) döndükten sonra 130 ~ ila% tepme başlangıç değerinin, yaklaşık% 75 CBF azalır. Hızlı bir şekilde ender karotid ligatio serbest bırakılmasından sonra, 20 dakika% 30, yukarıda geri 10 dakika, yaklaşık başlangıç değerinin% 20'den daha az ipsilateral yarımkürede CBF indirgenmiş hipoksi altında kontrast karotid ligasyonu (ti) içinden ve normoxia dönen. CBF kontralateral yarımkürede (L), ancak, hipoksi sırasında% 20 ila 50 dalgalanan ve hızlı bir şekilde Thi hakaret (Şekil 2C) sonra 80 üzerinde% geri döndü.
TCCAo (30 dakika) ya da tCCAO 24 saat sonra ve 30 dakika hipoksi (ti) de, in vivo olarak TTC lekesi enfarktüsü 17 tespit etmek için kullanıldı. Bu analiz thi hakaret (Şekil 3A) Aşağıdaki orta serebral arter tarafından sağlanan bölgede hiçbir tCCAO hakaret tarafından bariz yaralanma, ama büyükçe enfarktüs gösterdi. Anti-fibrin (ogen) immün 1 saat geri de tCCAO- ve Thi-yaralı beyinlerini karşılaştırmak için kullanılır ve fibrin (ojen) yaygın birikimi gösterdi tromboz bir göstergesi, Thi-yaralı değil, aynı fareyi tCCAO-meydan değil beyinleri (Şekil 3B, C). Evans mavi boya kuyruk ven enjeksiyonu da 4 saat geri de tCCAO- ve Thi-yaralı beyinlerin vasküler perfüzyon karşılaştırmak için kullanıldı. Bu analiz, Azalma gösterdiserebral perfüzyon ve Evans mavi boya yoğun ekstravazasyonunu ed tCCAO-meydan fare beyinleri (Şekil 3D, E) Thi-yaralı değil.
Son olarak, aracın kuyruk ven enjekte edilen farelerde thi hasara sonuçları veya rekombinant insan tPA (Activase, 10 mg / kg, 0.5, 1, ya da 4 saat sonra ti) (0.5 saat geri alınması) 'de kullanılarak karşılaştırıldı 24 saat kurtarma (Şekil 4A) de TTC leke vivo. Araç ile tedavi edilen farelerde, 24 saat post-Thi de ölüm oranı% 23.8 idi ve tek 21 Thi-yaralı fareler ortalama ve 2 SD (aykırı) ötesinde oldu. 0.5 saat geri de tPA tedavisi alan farelerde 24 saat ölüm oranı% 8,3 düştü, ancak tPA THI hakaret (Şekil 4B) sonra 1 ya da 4 saat uygulandı zaman bu etki kayboldu. Şekil 4C tüm infarkt çizilen dört tedavi gruplarındaki farelerin hayatta kaldı. Unutmayın ki, 0.5 ve 1 saat tPA-yönetim s hemarada kayda değer ölçüde araçla tedaviye kıyasla enfarkt boyutunu, azaltmıştır. 0.5 saat tPA-tedavi grubu da 4 saat tPA-tedavi grubuna göre önemli ölçüde daha enfarkt boyutunda küçülme görülmüştür. Şekil 4D, her tedaviden sonra Örnek TTC leke çıkarma sonuçları göstermektedir.
Şekil 1:. Erişkin farelerde geçici serebral hipoksi-iskemi (ti) hakaret Prosedür (A) Virchow'un üçlüsü trombozu iter kanın kan akımı, endotel hasarı ve pıhtılaşma staz içerir. (B) Thi inme prosedürünün bir şematik. Fare Rektal sıcaklık 37-38 ° C'de muhafaza edilirken iki salınabilir knot Sağ ortak karotid arter (CCA) üzerine bağlanır, ve 30 dakika boyunca, bir burun konisiyle% 7.5 oksijen verilmesi ile takip edildi. Trans sonrasağ- lasa sistemik hipoksi, CCA ligasyonu serbestleştirilebilen dikiş knot bir ucunu çekerek serbest bırakıldı. MCA, orta serebral arter; ICA, internal karotid arter; ECA, eksternal karotid arter; CCA, karotis arter. (C) geçici hakkı CCA oklüzyonu için cerrahi işlemler. 1. İki önceden kesilmiş ameliyat dikiş ipliği (1 ve 2 #), izole edilmiş bir sağ CAA altına yerleştirildi. 2. İki salınabilir knot yapılmıştır. 3. kesi hattı dikiş # 3 tarafından kapatıldı. Sütür # 1 ve # 2 uçları insizyon hattının dışında ulaşılabilir olduğundan emin olun. 4. dikkatlice CCA serbest bırakmak için dışarıdan dikiş 1. ve 2. çekin. Yavaşça yapıldığında, bu prosedür CCA laserasyonunu neden olmaz.
Şekil 2:. Sırasında ve thi hakaret sonrası beyin kan akımı değişikliklerinin analizi iki boyutlu lazer benek kontrast görüntüleme (LSCI) sistemi beyin kan akışını (CBF) ölçmek için kullanılmıştır. R (sağ) karotis-bağlandı yarımkürede gösterir; L (sol) taraf hemisfer olduğunu. (A) tCCAO normoksi altında baskılanır BKA ~ karotid ligasyon serbest bırakılması üzerine 3 dakika içinde 85 üzerinde% kadar geri kazanılan en az 30 dakika süre ile karotid-lige hemisferde (R), ilgili başlangıç değerinin 50%. Karotid arter ligasyonu olmadan hipoksi (% 7.5 oksijen, 30 dk) (B), CBF bazal değerin% 76 gerilemiştir ve geçici normoxia döndükten sonra yaklaşık% 130 toparlanmış. Hipoksi altında geçici karotis ligasyonu (C) (ti, 30 dk), CBF karotis-bağlandı (R) yarımkürede hızla bazal değerin% 20'den az düştü ve nadiren serbest bırakılması üzerine 30 üzerinde% kurtardığınız ligasyonu ve normoxia dönen karotid. Buna karşılık, kontralateral (L) yarımkürede CBF hipoksi sırasında% 20-50 arasında dalgalanan ve hızlı bir şekilde bazal>% 80 geri döndükarotis ligasyonu yayımlanmasından sonra değer ve normoxia dönen. Her bir grupta n> 4 için temsili CBF iz vardır Gösterildi. temsilci LSCI fotoğraflar için zaman noktaları temsil izleme gri çizgilerle işaretlenmiştir.
Şekil 3: Beyin enfarktüsü, spontan tromboz ve damar sağ karotis arter (tCCAO) 30 dakika geçici ligasyonu 24 saat sonra hiçbir görünür enfarktüs gösterdi in vivo TTC-leke THI hakaret sonrasında tıkanıklığı (A), fakat eklenmesi. tCCAO 30 dk hipoksi (% 7.5 oksijen) çoğunlukla orta serebral arter-tedarik alanında, ipsilateral hemisfer (yıldız işareti) 'de büyükçe enfarktüsü üretti. Thi hakaret sonra 1 saatte immün (B, C) Anti-fibrin (ogen) yaygın mevduat gösterdiipsilateral hemisfer. Bunun aksine, tCCAo sonra 1 saat (30 dakika) Insult (her biri için n> 4) en hiç bir fibrin (ojen) yatakları oldu. (D, E) serebral perfüzyon tCCAO (30 dakika) ya da thi (30 dakika), akıntıdan sonra 4 saat sonra Evans Blue boyası kuyruk ven enjeksiyon ile değerlendirildi. Post-tCCAO Beyinde, Evans Blue boyası ipsilateral yarımkürede kan damarlarının en doldurdu. Buna karşılık, post-Thi beyinde, Evan Mavi boya az kan damarlarını doldurdu ve parankiminde (n> 3) içine sızdırıldı. Ölçek çubuğu: 250 mikron.
Şekil 4: Thi inme modelinde tPA trombolitik Etkileri THI hakaret sonra 0.5, 1, veya 4 saatte intravenöz tPA yönetiminin (10 mg / kg) etkilerini karşılaştırmak için deneyler (A) Anahat.. Ameliyat hayvanların sayısı (B) Özet, mohakaret sonra 24 saat içinde rtality, aykırı (ortalama +/- 2 SD dışında infarkt) ve hayvan sayısı infarkt karşılaştırılması için dahil. (C) Niceleme gruplan, (herbir grup için ortalama ve SEM olarak) (% 20), bir araç grubu içinde ortalama% 32 infarkt hacmi ve 0.5 saat (% 16) 'de enfarktüs önemli bir azalma ve 1 saat için göstermiştir. P-değerleri, t-testi ile tespit edilir. (D) Temsilcisi THI hakaret meydan ve yaralanma sonrası belirtilen zaman noktasında tPA tedavisi alınan hayvanlardan beyin TTC-lekeli. TTC boyama, canlı doku kırmızı renk gösterdi; infarkt doku soluk oldu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İnme bir yaşlanma nüfusa sahip herhangi bir toplum için önemi giderek artan önemli bir sağlık sorunudur. Küresel olarak, inme, tüm ölümlerin 18% 11,1 eşdeğer 2010 yılında tahmini 5,9 milyon ölümcül olaylar ile ikinci ölüm önde gelen nedenidir. İnme da sakatlığa ayarlanmış yaşam yıllık üçüncü önde gelen nedenidir (DALY) 1990, 19 beşinci pozisyona yükselen, 2010 yılında küresel kaybetti. Bu epidemiyolojik veriler akut (iskemik) inme daha etkili tedavilerin ihtiyacını vurgulamaktadır. Ancak, klinik öncesi nöroprotektif tedavi yoğun araştırmalara rağmen, tPA-tromboliz hayvan çalışmalarında çok sayıda zamanlar umut verici nöro ajanlar klinik çalışmalarda başarısız olurken, ABD'de Gıda ve İlaç İdaresi tarafından onaylanan akut iskemik inme yalnızca belirli tedavidir. Hastaların içine nöroprotektif tedaviler çeviri zorluk birçok faktörü vardır ve mevcut önem iyi laboratuvar practi üzerindece, çoklu veri setlerinin meta-analiz ve uluslararası işbirliği preklinik inme araştırmaları 20,21 geliştirmek. Ancak, öteleme zorluk vadesi 2,3 ile klinik öncesi inme araştırma çoğunluğunda mekanik damar tıkanıklığı modelleri kötü bir seçim (örneğin intraluminal sütür MCA oklüzyonu) olduğunu düşündüren bir azınlık görüşü vardır. Mekanik damar tıkanıklığı modelleri nadiren tromboz neden ve serebral reperfüzyon mekanik tıkanıklığı serbest bırakılması üzerine çok hızlı gerçekleştiği için, bu modeller ne gerçek sözcük tedavisi (tPA fibrinoliz) yanıt ne inme hastalarında gibi dar bir terapötik pencere sağlamak. Sonuç olarak, önerilen çare, en azından tromboembolik inme modelleri preklinik inme araştırma 3, dahil, vurgulamaktır.
Bu öneri, ancak, onun kısıtlamaları vardır, çünkü t mevcut tromboembolik inme modelleri (eksojen emboli teslim, MCA-enjeksiyonhrombin ve fototromboz) Tüm belli teknik sakıncaları 4 var. Eksojen emboli modeli için, bağlı pıhtı hazırlanması 4,5 farklılıkları enfarkt boyutu ve konumu önemli farklılık, bunun yanısıra tPA-tromboliz karşı tahmin edilemeyen tepkiler emboli sonuçlar damardan infüzyon. MCA şube içine trombin Direkt enjeksiyon kraniektomi gerektirir ve trombolitik tedavi optimize etmek için onun yarar 4,6 kanıtlanmış henüz. Kimyasal olarak maruz kalan kafatası yoluyla sistemik ışığa boyanın enjeksiyon (örneğin, Rose Bengal ya eritrosin B) ve ışınlama göre tromboembolizm başlatılan genellikle 4,7 trombolize yanıt olmayan trombosit sadece agrega oluşturur. Preklinik strok araştırma için basit ve tPA-duyarlı tromboembolik modelini ihtiyaç vardır, birlikte ele alındığında.
Thi paradigma tromboembolik inme modeli olarak dört eşsiz avantajlara sahiptir. İlk olarak, thi Insult wieldedendojen bileşenler harici kimyasal ya da önceden oluşturulmuş emboli yardımı olmadan, in situ trombi sinde oluşturulması için. Böylece, THI modelinde trombüs oluşumu fizyolojik koşullara daha uygun olduğunu. İkincisi, THI modeli hızlı tPA-tedaviye olumlu yanıt değil gecikmiş tedavi (4 at saat) (0.5 ve 1 saat sonrası yaralanma at). Bu terapötik penceresi inmeli hastalarda gözlenenler ile benzerdir. Böylece, THI modeli akut iskemik inmede reperfüzyon tedavisi geliştirmek amaçlanmıştır araştırma için kullanılabilir. Intraluminal sütür MCA oklüzyonu modeline kıyasla Üçüncüsü, THI modelinde cerrahi işlemler, basit ve anlaşılır. Thi modelinde hipoksi süresi de kontrol edilebilir. Bu nitelikler laboratuvarlar arası usul varyasyonlara Thi modeli daha az duyarlı olun. Son olarak, THI modeli olan trombolitik sonrası büyük arterlerin rekanalizasyonu rağmen yetersiz reperfüzyon mekanizmaları anlayışlar tutabilirfelç tedavi benzersiz bir sorun kardiyak iskemi 1,22 ile karşılaştırıldığında. Bu nedenle, THI modeli hemostaz 23 serebral vasküler yatak özgü disregülasyonun mekanizmaları incelemek için eşsiz bir sistem sağlar.
Tüm deneysel beyin hasarı modellerinde sınırlamaları var ve thi modeli bir istisna değildir. Thi inme modelinde üç önemli teknik kısıtlamalar deneyde tespit edilmiştir. Birincisi, hakaret beyne sınırlıdır diğer inme modelleri aksine, hipoksi ve karotis oklüzyonu kombinasyonu periferik vazodilatasyon ve kalp debisi 12 için daha büyük bir talep yol açar. Fare mutasyonlar veya Thi hakaret karşı nöroprotektif ajanların etkilerini karşılaştıran Böylece, kardiyovasküler fonksiyonlar üzerindeki etkileri de dikkatle karşılaştırılır edilecektir. İkincisi, biz farklı fare kendilenmiş suşları nedeniyle posterior commun dengesiz açıklığı olabilir ki, THI modeline değişken tepkiler bulunduicating arteri 24, benzer olmayan kalp fonksiyonu, ya da her ikisinin bir kombinasyonu olabilir. Bu nedenle, Deney grupları arasında cinsiyet, yaş, vücut ağırlığı ve fare soyları nöroprotektif çalışmalarında benzer olması önerilir. Son olarak, THI inme bir hafif anestezi koşul altında hipoksik gaz nefes hayvanlar üzerinde dayanır. İnme sonuçları üzerindeki anestezi etkileri minimize ve hayvanlar arasındaki tutarlı tutulması gerekir. Bununla birlikte, sürece araştırmacılar bu teknik detayların uyanık ve hayvanlara hayvanlardan değişkenler azaltmak olarak, Thi inme modeli hızla beyin enfarktüsü yüksek tutarlılık elde etmek için kurulabilir.
Özetle, THI klinik olarak anlamlı zamansal pencerede gerçek dünya tedavisi (tPA tromboliz) olumlu yanıt basit ve standart inme modelidir. Bu yeni model klinik öncesi inme araştırma değerli bir katkı olduğunu ve akut iskemik içinde tromboliz tedavisi geliştirmek için yardımcı olabilirinme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| adult male mice | Charles River | C57BL/6 | 10-13 weeks old (22-30 g) |
| Mobile Laboratory Animal Anesthesia System | VetEquip | 901807 | anesthesia |
| Medical air (Compressed) air tank | Airgas | UN1002 | anesthesia |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | NDC 66794-013-25 | anesthesia |
| Multi-Station Lab Animal AnesthesiaSystem | Surgivet | V703501 | hypoxia system |
| 7.5% O2 balanced by 92.5% N2 tank | Airgas | UN1956 | hypoxia system |
| Temperature Controller with heating lamp | Cole Parmer | EW-89000-10 | temperature controllers |
| Rectal probe | Cole Parmer | NCI-00141PG | temperature controllers |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ40 | surgical setup |
| Heat pump with warming pad | Gaymar | TP700 | surgical setup |
| Fine curved forceps (serrated) | FST | 11370-31 | surgical instrument |
| Fine curved forceps (smooth) | FST | 11373-12 | surgical instrument |
| micro scissors | FST | 15000-03 | surgical instrument |
| micro needle holders | FST | 12060-01 | surgical instrument |
| Halsted-Mosquito hemostats | FST | 13008-12 | surgical instrument |
| 5-0 silk suture | Harvard Apparatus | 624143 | surgical supplies |
| 4-0 Nylon monofilament suture | LOOK | 766B | surgical supplies |
| Tissue glue | Abbott Laboratories | NC9855218 | surgical supplies |
| Puralube Vet ointment | Fisher | NC0138063 | eye dryness prevention |
| MoorFLPI-2 blood flow imager | Moor | 780-nm laser source | Laser Speckle Contrast Imaging |
| Mannitol | Sigma | M4125 | in vivo TTC |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | in vivo TTC |
| Vibratome | Stoelting | 51425 | brain section for in vivo TTC |
| Digital microscope | Dino-Lite | AM2111 | whole-brain imaging |
| O.C.T compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| goat anti-rabbit Alexa Fluro 488 | Invitrogen | A11008 | Immunohistochemistry |
| Cryostat | Vibratome | ultrapro 5000 | brain section for IHC |
| Evans blue | Sigma | E2129 | Detecting vascular perfusion |
| Microtome | Electron Microscopy Sciences | 5000 | brain section for histology |
| Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol) | Sigma | T48402 | euthanasia |
| Fluorescent microscope | Olympus | DP73 | |
| Meloxicam SR | ZooPharm | NSAID analgesia |
References
- Broderick, J. P., Hacke, W. Treatment of acute ischemic stroke: Part I: recanalization strategies. Circulation. 106 (12), 1563-1569 (2002).
- Hossmann, K. A. Pathophysiological basis of translational stroke research. Folia Neuropathol. 47 (3), 213-227 (2009).
- Hossmann, K. A. The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32 (7), 1310-1316 (2012).
- Macrae, I. M. Preclinical stroke research--advantages and disadvantages of the most common rodent models of focal ischaemia. Br. J. Pharmacol. 164 (4), 1062-1078 (2011).
- Niessen, F., Hilger, T., Hoehn, M., Hossmann, K. A. Differences in clot preparation determine outcome of recombinant tissue plasminogen activator treatment in experimental thromboembolic stroke. Stroke. 34 (8), 2019-2024 (2003).
- Orset, C., et al. Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion. Stroke. 38 (10), 2771-2778 (2007).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Prado, R., Ginsberg, M. D. Argon laser-induced arterial photothrombosis. Characterization and possible application to therapy of arteriovenous malformations. J. Neurosurgery. 66 (5), 748-754 (1987).
- Sun, Y. Y., et al. Synergy of combined tPA-edaravone therapy in experimental thrombotic stroke. PLoS One. 9, e98807 (2014).
- Levine, S. Anoxic-ischemic encephalopathy in rats. Am. J. Pathol. 36, 1-17 (1960).
- Rice, J. E. 3rd, Vannucci, R. C., Brierley, J. B. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Annals Neurol. 9 (2), 131-141 (1981).
- Vannucci, S. J., et al. Experimental stroke in the female diabetic, db/db, mouse. J. Cereb. Blood Flow Metab. 21 (2), 52-60 (2001).
- Adhami, F., et al. Cerebral ischemia-hypoxia induces intravascular coagulation and autophagy. Am. J. Pathol. 169 (2), 566-583 (2006).
- Shereen, A., et al. Ex vivo diffusion tensor imaging and neuropathological correlation in a murine model of hypoxia-ischemia-induced thrombotic stroke. J. Cereb. Blood Flow Metab. 31 (4), 1155-1169 (2011).
- Michaud, J. P., Pimentel-Coelho, P. M., Tremblay, Y., Rivest, S. The impact of Ly6C low monocytes after cerebral hypoxia-ischemia in adult mice. J. Cereb. Blood Flow Metab. 34 (7), e1-e9 (2014).
- Zoppo, G. J. Virchow's triad: the vascular basis of cerebral injury. Rev. Neurol. Dis. 5, 12-21 (2008).
- Dunn, A. K. Laser speckle contrast imaging of cerebral blood flow. Annals Biomed. Eng. 40 (2), 367-377 (2012).
- Sun, Y. Y., Yang, D., Kuan, C. Y. Mannitol-facilitated perfusion staining with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) for detection of experimental cerebral infarction and biochemical analysis. J. Neurosci. Methods. 203 (1), 122-129 (2012).
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2010).
- Murray, C. J., et al. Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380 (9859), 2197-2223 (2012).
- Dirnagl, U., Macleod, M. R. Stroke research at a road block: the streets from adversity should be paved with meta-analysis and good laboratory practice. Br. J. Pharm. 157 (7), 1154-1156 (2009).
- Dirnagl, U., et al. A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research. Stroke. 44 (6), 1754-1760 (2013).
- Khatri, P., et al. Revascularization end points in stroke interventional trials: recanalization versus reperfusion in IMS-I. Stroke. 36 (11), 2400-2403 (2005).
- Rosenberg, R. D., Aird, W. C. Vascular-bed--specific hemostasis and hypercoagulable states. New Eng. J. Med. 340 (20), 1555-1564 (1999).
- Majid, A., et al. Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains. Stroke. 31 (11), 2707-2714 (2000).
