Tüm montaj preparatlarını hızlı bir şekilde hazırlamak için fare bağırsaklarını kesmek ve 'yuvarlamak' için basit bir cihazın kullanımı açıklanmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Basit Aygıt Hızla Fare Bağırsak Tüm Mounts Hazırlanır
Bu makalede
Özet
Özet
Bir sonraki analiz veya ölçülmesi için farenin ince bağırsak ve kolon tüm bağlar hazırlanması zaman alıcı ve zor olabilir. Biz hızla elle elde edilebilir olanı üstün ve aynı kalitede bütün montaj hazırlıkları hazırlamak için kesmek için basit bir cihazın kullanımını ve 'roll' fare bağırsakları açıklar. Cihaz 4 paslanmaz çelik çubuklar ve bir kesme kılavuzu hareket eden bir üst tutan bir taban ihtiva eder. Çubuklar, ince bağırsakta [üçe ayrılır] ve kolon lümeni içine yerleştirilir. Çubuklar ve numuneler daha sonra, cihazın tabanından tutma yuvalarına filtre kağıdı ya da bir marka kartı üzerine yerleştirilir. Cihazın üst sonra konumlandırılmış ve kesim kılavuzu olarak hizmet vermektedir. Üst kısmın merkezinde iki açılı bölümler bir bıçak ya da bistüri rehberlik etmek için kullanılan ve çubukların üstünde uzunlamasına bağırsak kesilir. Bağırsak bölümleri kesilmiş, sonra, en çıkarılır ve kart, TissUE ve çubuklar yavaşça cihazından çıkartılmış ve tezgah üzerine yerleştirilir. Çubuklar yavaşça dümdüz ve filtre kağıdı veya kartın yatan parça üzerine bağırsak segmentleri sopa yanlara alınır. Son preparat, daha sonra tetkik veya sabit ve sonraki analiz için saklanır. Preparatlar normal veya genetiği değiştirilmiş fare modelleri bağırsak değişikliklerin incelenmesi için paha biçilmezdir. Preparasyonlar iltihabı (kolit), hasar, kanser öncesi lezyonlara etkileri çalışmasında ve miktar tayini için kullanılmıştır (aberant kript odağı (ACFs) ve odaklar (MDFs) tüketilmiş musin) ve polipler veya tümörler.
Giriş
Fare ve genetiği değiştirilmiş fare 1-3 değişik patolojiler özellikle kanser ve gastrointestinal sistemde inflamasyona ilişkisi çalışma için paha biçilmez bir modeldir. Bu genellikle ince bağırsakta ve / veya kolon bütün bağlar hazırlık gerektirir.
Bütün bağlar hazırlanması ofset makas hassas çifti ile yapılabilir ancak fare 4 başına yaklaşık 20 dakika sürebilir. Bu farelerin önemli miktarda gerektirir karşılaştırmalı çalışmalar, çok pratik değildir (istatistiksel analize grup konu başına 10 demek). Buna ek olarak, geçen süre doku bozulması riskini arttırır. Bu sorunu hafifletmek için bir girişimde çeşitli kesim hazırlık yardımlarının deneme yol açtı. İlk kesim bahçeleri ile, metal plakalar, bir dizi dayalı, ancak plakalar doku gizlenmiş ve kesme kontrol etmek ve böylece zor oldu.
Bir Bayağıbiz sonra yarım kalem şekli bir neşter (Şekil 1) için iyi bir rehber yapmak nasıl görebiliyordu l altı taraflı kalem nihayet, kesme cihazı için ilham kaynağı oldu. Bu dört kesim kılavuzları 5 ile bir çerçeve için bir tasarım sonuçlandı. Şekil 4'te hazırlıkları makas hazırlama ve cihaz hazırlığı arasındaki farkı göstermek olarak bu cihazın etkinliği dramatik oldu.
Orijinal cihazların üstleri metal birkaç parçaya, ancak daha sonra olanlardan inşa edilmiştir ve güncel model Duralüminyum sağlam bir parça dışarı işlenmiş oldu. Baz yüksek kalite yüksek yoğunluklu reçine dışarı işlenmiş oldu.
Cihaz büyük ölçüde hızlandırır ve geniş bir uygulama yelpazesi var hazırlıklar, kalite ve tutarlılığını artırır fare bağırsak bütün bağlar hazırlanması için büyük bir kullanım olduğunu kanıtlamıştır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Çeşitli deneysel prosedürler ve insancıl ötenazi konak kurumları etik komite tarafından uygun düzenleyici kurumlar tarafından onaylanmıştır. Ötenazi normal servikal dislokasyon CO2 boğulmaya kullanılarak elde edilir.
1. Cihaz
- Makine Bu yazıda tarif edildiği gibi, yüksek yoğunluklu asetil reçinesi katı bloğu üzerinden cihazın tabanına ana bölümü. Her Sonunda çubuklar almaya bu 2,5 mm'lik bahçeleri arasından 3 mm yüksek yükselmiş şeritler ve parça makine oluşturmak (Şekil 2 ve Şekil 3).
- Yuvarlatılmış uçları olan bir 2,4 mm çapında paslanmaz çelikten çubukları sağlayın.
NOT: Kapağın ana çerçeve duralumin plakanın dışında işlenmiş oldu. Bitmiş cihazların sınırlı sayıda Dr. Goodlad temin edebilirsiniz.
Cihazın 2.
- Makas kullanarak karın boşluğundan küçük bağırsak ve kolon parçalara ayırve eldivenli parmakları. Bağırsak uzağa çekerek hafifçe kavisli bir forseps ile tutarak tarafından mezenterin çıkarın.
- Soğuk fosfat tamponlu salin (PBS, pH 7.4) bir 10 ya da 20 ml diş uydurma plastik şırınga sığacak böylece daha geniş sonunda aşağı kesilmiş bir Gilson tipi pipet kullanarak ile bağırsakları durulayın.
- Kağıt havlu bir levha üzerine ince bağırsak (SB) dışarı Lay ve uzunluğu (proksimal, orta ve distal - SB1, SB2 ve SB3) üç eşit parçaya bölün makas kullanarak. Çekum çıkarın ve kolon yatıyordu.
- Makasla barsak segmentleri içine birkaç çok küçük kesikler sıvı kaçmak ve bağırsakların üzerindeki kağıt havlu bir sayfa yerleştirin ve yavaşça sıvıyı dışarı sıkmak ve kuru leke hazırlıkları üzerinde bir parmak çalışmasına izin vermek için yapın.
- Bölümleri kaldırın ve daha önce fosfat tamponlu tuzlu su içinde bir çanak içinde ıslatılarak ıslatılmıştır, paslanmaz çelik çubuklar yerleştirin.
NOT: bağırsaktayani istenirse içedönük (tersyüz). - Cihazın tabanına uyacak şekilde boyutuna kartı ya da filtre kağıdı kesme bir parça etiketleyin. Neredeyse tüm çözümleri etkilenmez olarak Kalem, en iyisidir. Otopsi tarih, deneysel kod ve hayvan kimlik numarası önerilmektedir.
- Cihazın taban içine kartı veya filtre kağıdı yerleştirin. Cihazın tabanındaki yuvalara çubukları ve bağırsakları yerleştirin. Bölümlerinin yakın ucu standart bir şekilde yerleştirildiğinden emin olun. Proksimal uçları kart etiketleri yakın olmalıdır.
- Tabanının üzerine cihazın üst parçasını yerleştirin. Uzunlamasına bölümleri kesmek için bir neşter bıçak yönlendirmek için açılı çubuklarını kullanın.
NOT: Doku yavaşça ve dikkatlice bıçakla hareket etmez emin olmak için bir parmak ile düzenlenen olup olmadığı olur. - Cihazın üst parça çıkarın. Dikkatle (onların çubuklar hala) filtre kağıdı ve dokuları çıkarın.
NOT: fil altına yerleştirilen sert karta bir parçater kağıt kaldırma yardımcı olacaktır. - Segmentlerde (PBS batırılmış bir eldivenli parmak ucu ile) Hafif ıslak. Çubuk Rulo, yan gut açmak ve düz yaymak için yan. Doku daha sonra filtre kağıdı uyacaktır.
- Görme herhangi brüt lezyonlar için hazırlıklarını incelemek.
- Sığ bir banyo (ya da sandviç kutusu) içeren fiksatif ile filtre kağıdına yapıştırılmış doku aktarın.
NOT: Doku filtre kağıdına yapışır ya da karta sıkıca bağlı kalacaktır sonra. Fiksatif çeşitli hazırlama korumak için de kullanılabilir. Bu Carnoy akışkan iyi hücre çoğalma yöntemleri için ideal bir bağnazlıktır bağırsak hücre proliferasyonu 6 çalışma için kullanılması gerektiğini tavsiye edilir; Bununla birlikte, formalinin ya da diğer uç noktaları gerekli olduğunda diğer pek çok sabitleyici de kullanılabilir. - Fiksasyon (genellikle 3 saat) sonra,% 70 etanol içinde hazırlıkları aktarın. Gerekene kadar Numuneler daha sonra saklanabilir. Hazırlıklar cBir cepheden çalışılmış ve / veya H & E veya diğer histolojik boyama teknikleri, immünohistokimya ve / ya da in situ hibridizasyon için histolojik numune hazırlanması için kullanılabilir.
NOT: Uzun süreli sabitleme immünohistokimyasal reaktivitesi ve / veya in situ hibridizasyon reaktivite azaltabilir. Polipropilen sandviç kutuları hazırlıkları çok sayıda saklamak için idealdir. - Çeşitli bağırsak segmentlerden sabit dokuların Gerekirse 'İsviçre rulo' haline ve yukarıda tarif edilenler de dahil olmak üzere histolojik yöntemler 6 tüm aralığı ile boyanmış olabilir. Bir 'İsviçreli rulo' yapmak için bağırsak segmentleri bir entomolojik pim ile emniyete ve balmumu 6 gömmek için işlenen bir kokteyl çubuğu veya bir kürdan etrafında haddelenmiş filtre kağıdından, kaldırılır.
- Gerekirse, anormal kript odakları 7 görselleştirmek için metilen mavisi ile toplu doku leke.
- Sabit hazırlıklarını Puaneğlence.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Polipler (Şekil 4) doku aydınlatmak yan soğuk bir ışık kaynağı olan bir stereomikroskop altında tespit etmek kolaydır. Bir polip puanlama sonra ele alınabilir ve farklı operatörler anlaşmaya ulaşabilir sırayla gözlenen zaman kalem işaretleri ile kart işaretlemek için yararlıdır. Doku ayrıca [metilen mavisi ile] tanımlamak için lekeli toplu olabilir anormal kript odaklar 8 veya üzeri ya da trans yanması ile gelen aydınlatma ile tüketilmiş odaklar (MDFs) 9 müsin (Şekil
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Iki operatör tam 6 dakika içinde fare otopsi böylece cihaz ölçüde sürecini hızlandırır. Bu bariz brüt lezyonlar ve tartma ve büyük organların sabitlemek için bir görsel kontrol içerecektir. Ayrıca operatörler, durulama kurulayın ve mide, çekum, ince bağırsak ve kolon tartmak ve tüm bağlar hazırlamak için izin verecektir. Basık doku çok hızlı bir şekilde sabit ve dolayısıyla bozulma eserler önlemek olabilir.
(Dışında hızı) cihazın önemli avantajlarından biri Cihaz sonra sonraki analiz ve çok ...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Cihazın evrimi, Bass Hassan tarafından İmparatorluk Kanser Araştırma Fonu (ICRF) fare kulübünde gösterilen biraz farklı kesme prototipi ile başladı, bunu takiben ICRF Clare Hall'daki muhafaza tesisinde Rob Rudling ve Nikki Mandir ile birkaç tartışma yapıldı. ICRF'deki mekanik atölyesinden Jo Kitau ilk versiyonları inşa etti ve Andy Lucas son modeli Oxford'daki CRUK atölyesinde tasarladı ve mükemmelleştirdi.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Delrin | Ryan Plastics, Earls Barton, İngiltere | Yüksek yoğunluklu asetal reçine benzeri malzeme yeterli olacaktır | |
| Duralumin plaka | Metal Supplies Ltd, Park Road, Dukinfield. SK16 5LP UK | Alüminyum, 1909'a kadar uzanmasına izin verir, bu nedenle alternatif tedarikçiler mevcuttur | |
| Bitmiş cihaz(lar) kullanıma hazır | Dr Goodlad ile iletişime geçin r.goodlad@imperial.ac.uk | İletişim r.goodlad@imperial.ac.uk |
Kaynaklar
- Goodlad, R. A. Cancer Handbook. Alison, M. R. , John Wiley and Sons, Ltd. 243-262 (2007).
- Ward, J. M., Treuting, P. M. Rodent intestinal epithelial carcinogenesis: pathology and preclinical models. Toxicol Pathol. 42, 148-161 (2014).
- Sundberg, J. P., Hogenesch, H., Nikitin, A. Y., Treuting, P. M., Ward, J. M. Training mouse pathologists: ten years of workshops on the Pathology of Mouse Models of Human Disease. Toxicol Pathol. 40, 823-825 (2012).
- Wasan, H. S., Novelli, M., Bee, J., Bodmer, W. F. Dietary fat influences on polyp phenotype in multiple intestinal neoplasia mice. Proc Natl Acade Sci USA. 94, 3308-3313 (1997).
- Rudling, R., Hassan, A. B., Kitau, J., Mandir, N., Goodlad, R. A. A simple device to rapidly prepare whole mounts of murine intestine. Cell Prolif. 39, 415-420 (2006).
- Alferez, D., Goodlad, R. A. To best measure cell proliferation in samples from the intestine. Cell Prolif. 40, 231-240 (2007).
- Park, H. S., Goodlad, R. A., Wright, N. A. The incidence of aberrant crypt foci and colonic carcinoma in dimethylhydrazine-treated rats varies in a site-specific manner and depends on tumor histology. Cancer Res. 57, 4507-4510 (1997).
- Park, H. S., et al. Effects of epidermal growth factor and dimethylhydrazine on crypt size, cell proliferation, and crypt fission in the rat colon. Cell proliferation and crypt fission are controlled independently. Am J Pathol. 151, 843-852 (1997).
- Femia, A. P., Dolara, P., Caderni, G. Mucin-depleted foci (MDF) in the colon of rats treated with azoxymethane (AOM) are useful biomarkers for colon carcinogenesis. Carcinogenesis. 25, 277-281 (2004).
- Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55, 91-106 (2003).
- Goodlad, R. A., et al. Inhibiting vascular endothelial growth factor receptor-2 signaling reduces tumor burden in the ApcMin/+ mouse model of early intestinal cancer. Carcinogenesis. 27, 2133-2139 (2006).
- Mandir, N., Englyst, H., Goodlad, R. A. Resistant carbohydrates stimulate cell proliferation and crypt fission in wild-type mice and in the Apc(Min/+) mouse model of intestinal cancer, association with enhanced polyp development. Br J Nutr. 100, 711-721 (2008).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
