Répandre surface et Immunocoloration des chromosomes de levure

Résumé

Une méthode de propagation superficielle des chromosomes à partir de levures bourgeonnantes est présentée. Cette méthode est dérivée d’une méthode précédemment décrite par Loidl et Klein. De plus, nous démontrons une procédure d’immunomarquage des chromosomes propagés.

Résumé

La petite taille des noyaux de la levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae limite l’utilité de la microscopie optique pour l’analyse de la distribution subnucléaire des protéines liées à la chromatine. L’étalement en surface des noyaux de levure entraîne une expansion de la chromatine sans perte de protéines liées. Procédé d’étalement de surface, équilibre la fixation de protéines liées à l’ADN avec traitement détergent. La méthode démontrée est légèrement modifiée par rapport à celle décrite par Josef Loidl et Franz Klein^1,2. La méthode a été utilisée pour caractériser la localisation de nombreuses protéines liées à la chromatine à divers stades du cycle cellulaire mitotique, mais elle est particulièrement utile pour l’étude des structures chromosomiques méiotiques telles que les recombinosomes méiotiques et le complexe synaptonimal. Nous décrivons également une modification qui ne nécessite pas l’utilisation de Lipsol, un détergent exclusif, qui était prévu dans la procédure initiale, mais qui n’est plus disponible dans le commerce. Un protocole d’immunocoloration compatible avec la méthode de propagation des chromosomes est également décrit.

Introduction

La levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae présente de nombreux avantages pour les études des mécanismes moléculaires des processus biologiques, y compris l'étude des protéines qui contrôlent la fonction de chromosome. Bien qu'il existe des avantages bien connus de la levure bourgeonnante pour les études génétiques, moléculaires et biochimiques, les études cytologiques de la distribution des protéines dans le noyau de la cellule est compliquée par sa petite taille. Le noyau de la levure typique a un diamètre de moins d'un micron, ce qui est seulement d'environ 5 fois la limite de résolution de la lumière visible. Ainsi, la quantité d....

Protocole

NOTE: Certaines étapes du protocole ci-dessous ont besoin de travailler dans une hotte propre. En outre, la méthode nécessite une dissection microscope levure tétrade équipé d'un objectif à distance 10X long travail chargé de suivre sphéroplastes. Le microscope devrait être mis en place dans la hotte à l'avance. Retirez le bras de micromanipulateur et support de plaque de la portée et de placer ces éléments dans un endroit sûr, loin de la zone de travail.

1. Préparation des sphéroplastes

1. Cultiver la levure dans des conditions souhaitées. Utilisez environ 2 x 10 ⁸ cellules pour chaque échantillon, par exemple ....

Résultats

L'apparition de germes de propagation dépend de façon critique de l'équilibre entre la fixation du chromosome et de compactage. Même lorsque les réactifs sont correctement équilibrées, la variation dans le degré de compactage de chromosome peut se produire dans différentes régions de la même lame et / ou entre les différentes lames. Ainsi, la qualité des spreads dans une région donnée d'une diapositive devrait être évaluée avant que les images sont interprétées.

Les effets de &qu.......

Discussion

L’apparition des noyaux étalés dépend de manière critique de l’équilibre entre la fixation et le traitement par lyse/détergent. Comme nous l’avons vu ci-dessus, la préservation de structures cellulaires variables nécessite l’utilisation de différentes concentrations de PFA. Pour la plupart des protéines, 3 % de PFA est optimal. Cependant, la conservation des broches nécessite l’utilisation de 4 % de PFA. Même avec un seul ensemble de réactifs, le moment de la lyse par rapport à la fixation peut également affecter la qu.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Zymolyase	US Biological  ;	Z1004	Préparez une solution à 20 mg/mL dans 50 mM de Tris pH 7,5 complété par 2 % de glucose. Préparez frais chaque expérience et conservez-le à 4 ° C jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi.
Lipsol  ;	L.I.P. Ltd  ;	n’est plus disponible dans le commerce	Préparer une solution à 1 % (v/v) dans l’eau. Conserver sur de la glace.
NP-40	USB	19628	Préparez une solution à 1 % (v/v) dans l’eau. Conserver sur de la glace.
Tween 20	Sigma	P2287
Slides	Corning	2948-75x25
Lamelles standard	Fisher	12-544-E ou 12-540-B
Couvertures haute résolution	Fisher	12-542-B
Photo-Flo 200 solution	Kodak	P-7417	Préparer une solution à 0,2 % (v/v) dans l’eau.
TBS			137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 24,7 mM Tris, pH 8
BSA	Sigma	A2153	Préparer une solution à 1 % (p/v) dans du TBS. Conserver à 4° ; C pendant un mois au maximum.
Anticorps
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit	Invitrogen	A-21206
IgG (H+L) Anticorps
Vectashield support de montage avec DAPI	Vector Laboratories	H-1200
ProLong Gold	Invitrogen	P36930
Boîte à lames en plastique	Fisher	03-448-1	Stocker les lames contenant des pâtes à tartiner séchées dans des fentes à -20°C. Utilisez-le également comme chambre humide.
Boîte à diapositives en carton	Fisher	12-587-10	À utiliser pour transporter facilement les lames tachées/scellées ou les stocker à 4°C.
Pot Coplin	Fisher	08-816	Utiliser comme lavabo pour toboggans.

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