We rapporteren significante verbeteringen voor de reproduceerbare meting van somatische colonische stamcelmutaties na blootstelling van muizen aan potentieel DNA-beschadigende stoffen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Kwantificering van Colonic Stem Cell Mutaties
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De mogelijkheid om stamcellen mutaties te meten, is een krachtig hulpmiddel om te kwantificeren in een kritische cel populatie of, en in welke mate, kan een chemische mutaties die kunnen leiden tot kanker veroorzaken. De toepassing van een enzymatische bepaling om stamcellen mutaties kwantificeren in de X-gebonden glucose-6-fosfaat-dehydrogenase gen is eerder gemeld. 1 Deze methode vereist de bereiding van ingevroren secties en incubatie van het doorgesneden weefsel met een reactiemengsel dat een oplevert blauw wanneer de cellen functioneel glucose-6-fosfaatdehydrogenase (G6PD) enzym. Indien niet, de cellen lijken witachtig. We hebben het reactiemengsel met behulp van optimale Cutting Temperatuur Verbinding (oktober) medium in plaats van polyvinyl alcohol gewijzigd. Dit vergemakkelijkt pH meting verhoogt oplosbaarheid van de G6PD kleuring componenten en beperkt diffusie van de G6PD enzym. Om aan te tonen dat een mutatie zich in een stamcel, moet de gehele crypt G6PD enzymatische missenactiviteit. Alleen als een stamcel herbergt een fenotypische G6PD mutatie zullen de nakomelingen in de crypte gebrek G6PD enzymatische activiteit. Om crypten met een stamcel mutatie te identificeren, werden vier opeenvolgende aangrenzende vriescoupes (niveau) gesneden op 7 urn dikte. Deze benadering van het maken aangrenzende sneden worden conformatie die een crypte volledig gemuteerd aangezien dezelfde gemuteerde crypte zal worden waargenomen in aangrenzende secties. Slides met weefselmonsters die meer dan 50 urn uit elkaar waren bereid waren totaal> 10 4 crypten per muis evalueren. De mutatie-frequentie is het aantal waargenomen gemuteerde (wit) crypten ÷ door het aantal wild type (blauw) crypten in een behandelgroep.
Inleiding
Darmkanker wordt gedacht dat blootstelling aan milieu-agenten en voedingscomponenten dat DNA kan beschadigen betrekken en produceren van activerende somatische mutaties in oncogenen (bijvoorbeeld ß-catenine) of inactiveren mutaties in tumorsuppressorgenen (bijvoorbeeld APC). Aangenomen wordt dat deze kritische mutaties optreden in colon stamcellen. Vanwege de unieke architectuur crypte van het colonepitheel is het mogelijk om stamcellen mutaties in het colon te meten na blootstelling van dieren aan chemicaliën geassocieerd met darmkanker. Verscheidene X-gebonden enzymen kunnen dienen als indicatoren voor de mutaties die voorkomen in stamcellen, de m....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De experimentele procedures en de ethische behandeling van dieren werd goedgekeurd door de Universiteit van Pittsburgh IACUC (protocol # 1.104.674).
1. Bereiding van G6PD kleuring Mixture
OPMERKING: Zorg ervoor dat de uiteindelijke concentratie van elke reagentia is als volgt; 5 mM glucose-6-fosfaat (G6P); 2 mM NADP, 5 mM MgCl2, 0,35 mM 1-methoxy-5-methylphenazinium methylsulfaat (MMPMS) en 0,8 mM NBT. 1,8,9 Voor elk reagens de aanvankelijke concentratie die voor een 40 ml eindvolume. Oplossingen werden vers bereid en toegepast per dag.
- Voeg 2 ml van 200 mM pH 7,4 fosfaatbuffer (PB) tot 35 ml oktob....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het vermogen om colon stamcellen mutaties meten bij dieren biedt een unieke manier om mutaties kankerinductie correleren. Gewoonlijk wordt aangenomen dat de kritische stap in carcinogenese omvat activerende mutaties in oncogenen en / of inactiverende mutaties in tumorsuppressorgenen. Geïnjecteerd C57BL / 6 muizen met 200 ul PBS of 10 mg / kg AOM in 200 pl PBS. AOM is een bekend colon kankerverwekkend. 07/05 Bij 90 dagen werden de dubbele punten geanalyseerd voor stamceltransplantatie mutaties. Deze tijd nodig.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Vaak genotoxische effect van een verbinding wordt bepaald door zijn vermogen om DNA te wijzigen. Dit gebeurt normaal gesproken door het isoleren van het weefsel en het meten van het globale niveau van DNA adducten. Voor AOM, zou dit inhouden kwantificeren O 6 methylguanine adducten in de colon. Met deze aanpak gegevens over schade in specifieke celtypen, zoals in de stamcelniche, verloren. Verder een DNA adduct is niet hetzelfde als een mutatie aangezien slechts een klein deel van adducten uiteindelijk worden.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs hebben geen bevestigingen.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| reagentia | |||
| nitroblue tetrazoliom | |||
| NADP | |||
| glucose-6-fosfaat | |||
| 1-methoxy-5-methylfenazinium methylsulfaat | |||
| dimethylformamide | |||
| fosfaatbuffer (pH 7,4 | |||
| Optimale Snijtemperatuur Compound (OCT) | |||
| Apparatuur | |||
| lichtmicroscoop uitgerust met een 5 megapixel camera | |||
| cryostat | |||
| warme kamer |
Referenties
- Griffiths, D. F., Davies, S. J., Williams, S., Williams, G. T., Williams, E. D. Demonstration of somatic mutation and colonic crypt clonality by X-linked enzyme histochemistry. Nature. 333 (6172), 461-463 (1988).
- Griffiths, D. F., Sacco, P., Williams, G. T., Williams, E. D.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
