Abstract
Lateral ventriküllerin subventriküler bölgesinde nöral kök hücreler (NSC'lerde) (SVZ) memeli beyninde ömrü boyunca koku nöron sürdürmek. Onlar gittikçe onlar koku ampuller entegre kez nöronlar içine ayırt geçiş yükselterek hücreleri (TAC) ve neuroblasts üretir. Gelişen floresan aktive hücre (FACS) teknikleri NSC'lerde izolasyonu yanı sıra döl izin sıralama ve yetişkin nörojenik nişler gen düzenleyici ağlar ışık tutmaya başladı. Burada takip eder ve Lex / EGFR / CD24 üçlü boyama erişkin SVZ'unda yukarıda bahsedilen hücre popülasyonlarının hücre döngüsü dinamikleri ayrımını sağlayan hücre sıralama tekniği sunulmuştur. İzole hücreler daha sonra time-lapse video mikroskopi hücre döngüsü ilerlemesini detayları keşfetmek için yapışık hücreler olarak kaplanmıştır. Bu amaçla, hücreler Durin kırmızı flüoresan olan transgenik Floresan Ubikitinasyon Hücre Döngüsü Göstergesi (Fucci) fareler kullanmakg G G 1 özgü kırmızı-Cdt1 muhabiri nedeniyle 1 fazlı. Bu yöntem son zamanlarda çoğalan NSC'lerde giderek nöron bozukluğu neden yaşlanma sırasında G 1 faz uzatmak olduğunu ortaya koymuştur. Bu yöntem diğer sistemlere kolaylıkla transposable ve beyin patolojileri bağlamında beyin hücrelerinin hücre döngüsü dinamikleri çalışma için büyük ilgi olabilir.
Introduction
Hareketsiz nöral kök hücreler (NSC'lerde) yetişkin nöron 1 için kaynak ve onların proliferatif haline dönüştürebilirsiniz EGFR (aNSCs) ifade biçimi 2 "aktive". Bir kere aktif hale, bunlar astrosit bir tüp içinden koku ampuller (OB) göç etme ve nihayet nöronlar 4,5 farklılaşırlar daha sonra geçiş amplifiye hücreleri (TAC) 3 ve nöro yol açmaktadır. NSC'lerde ve bunların soyu onların çoğalmasını 6 kontrol faktörlerin sayısız suçlayan, lateral ventrikül boyunca uzman "niş" mimarileri düzenlenmektedir. SVZ nörojenik hücrelerinin izolasyonu ve saflaştırılması, proliferasyonları kompleks moleküler düzenleme aydınlatmak için gerekli olan fakat özel işaretleri uyarlanmış tekniklerin olmaması için uzun bir süre için bir meydan okuma kalmıştır.
Akışını kullanarak yeni yaklaşımlar sitometri NSC'lerde ve thei izolasyonunu mümkün hale getirmiştirBir yetişkin SVZ 2,7-11 den r soyu. , Durgun ve aktif NSC'lerde, TAC: hücrelerini 2 çoğalan üzerinde EGFR etiketlemek neuroblast işaretleyici CD24 13 ve floresan EGF ile birlikte kök hücre işaretleyici Lex 12 kullanarak, son zamanlarda ana SVZ nörojenik nüfusun beş arıtılmasını sağlayan FACS strateji geliştirdi olgunlaşmamış yanı sıra göç Nöroblastlar 9. Burada, ayrıntılar bu tekniği sıralama hücreyi ve anlatan ilk kez izin Lex / EGFR / CD24 üçlü boyama sakin ve aktif NSC'lerde hem izolasyon.
Nöron yetişkinlik döneminde devam rağmen, yeni nöronların üretimi büyük ölçüde yaşlanma beynin 14 azalmıştır. Çalışmaların çoğu SGZ ve SVZ'unda 15-20 progenitör çoğalan hücrelerin sayısında bir azalma ilerici katılıyorum. SVZ'unda nöron yaşa bağlı düşüş n bir azalmaya kışkırtır olarak sonuçları zararsız değildiryaşlı beynin koku ampuller ewborn nöronlar, sonuçta yaşlı farelerde 18 koku ayrımcılık bozulma yol açar. Sinir atalarıdır hücre döngüsü kinetikleri açıklık yaşlanma sırasında yetişkin nöron gelişimini altında yatan mekanizmaları anlamak için önemli bir adımdır. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, in vitro ve in vivo 21 22 yetişkin nöral kök hücrelerinin hücre döngüsü ilerlemesini ve soy araştırdık ancak bunların hiçbiri İzole hücrelerin hücre döngüsü aşamalarını görselleştirmek için hücre sıralama teknikleriyle ve genetik olarak kodlanmış bir floresan hücre döngüsü probları yararlandı bir tek hücre düzeyinde.
Burada G 1 ve SG 2 / M fazlar 23 arasındaki ayrım sağlayan, hücreleri, hücre döngüsü sırasında floresan edildiği transjenik farelerin Fucci yararlanır bir protokol açıklar. Bu protokol, yetişkin Fucci mi dan NSC'lerde ve bunların döl nasıl prospektif izolasyonu gösterirtime-lapse video mikroskobu ile kombine ce bir tek hücre düzeyinde hücre döngüsü dinamikleri çalışma sağlar.
Protocol
Bu protokol 24 Kasım Avrupa Toplulukları Konseyi direktifine uygun olarak dizayn edilmiştir, 1986 (86/609 / EEC) ve hayvan refahı kurumsal komitesi (CETEA-CEA DSV IdF) tarafından onaylanmıştır.
Kültür ve videomikroskopi 1. Temel Kurulum Önceki
- Konfokal görüntü mikroskopi için cam alt kültür plakaları veya μ-Plakaları kullanın. 1 için - / gözenek 5 x 10 3 hücre / göz fazla 5 x 10 3 hücreleri için 96-yuvalı plakalar ve 24-kuyucuklu plakalar kullanılmıştır.
- En az bir gün önce deney başlamadan yapışık tek tabakalı kültürler steril Poly-D-lisin (PDL) kaplanmış plakalar hazırlar. De kaplamak için her bir alt yeterli PDL (dH2O 10 ug / ml) ilave edilir ve 37 ° C 'de O / N inkübe edin. PDL çözeltisini çıkarın ve plaka, bir laminer akış altında en az 2 saat boyunca başlık kurumaya izin vermeden önce dH 2 O ile üç kez yıkayın. Derhal kullanılmadığı takdirde en kaplanmış plaka saklayın-20 ° C.
- 9 at NSC bazal ortam ve NSC çoğalma Supplement karıştırılarak kültür ortamı hazırlayın: 1 oranında 2 ug / ml heparin, 20 ng / ml saflaştırılmış insan rekombinan epidermal büyüme faktörü (EGF) ve 10 ng / ml ile (Malzeme tabloya bakınız) İnsan yeniden birleştirici fibroblast büyüme faktörü 2 (FGF-2). Kullanımdan önce bir su banyosu içerisinde 37 ° C'ye kadar bir kültür ortamı ısıtın.
- SVZ ayrışma için, papain çözeltisi hazırlayın: 1 mg / ml papain 0.2 mg / ml L-sistein, 0,2 mg / ml EDTA ve 0.01 mg / ml DNase I içeren Earl Denge Tuz Çözeltisi (EBSS) 'de (15 UI / ml) PBS içinde. 0.2 um'lik bir filtreden geçirilerek çözelti sterilize edin. Kullanımdan önce 37 ° C 'de çözüm dengelenmesi.
- DMEM: F12 ortamı 0,7 mg / ml tripsin inhibitörü Tip II ihtiva eden enzimatik reaksiyonu durdurmak için, bir proteaz inhibitörü çözeltisi (ovomukoid) hazırlar. 0.2 mikron filtre kullanarak çözüm Filtre.
- Beyinleri ve PBS% 0.15 BSA s toplamak için glükoz solüsyonu PBS% 0.6 hazırlayınyıkama adımları ve antikor boyama için ların çözüme.
- Diseksiyon ve neşter forseps bağlama, makas: diseksiyon araçları hazırlayın. % 70 etanol içinde bekletin.
2. Hasat Yetişkin Mouse Brain ve SVZ Microdissections
- Uygun kurumsal kurallarına uygun olarak servikal dislokasyon gerçekleştiren Kurban yetişkin Fucci fareler 23 (2-3 aylık ve / veya çalışmaları yaşlanma için 12 aylık).
- % 70 etanol kullanılarak fare püskürtün ve keskin bir makas kullanarak kafasını kesti.
- Kafatası ortaya çıkarmak için kafa derisi boyunca bir kesi yapmak.
- Makas küçük bir çifti kullanarak koku ampuller karşı kafatası tabanında başlayan uzunlamasına orta hat kesme gerçekleştirin. Makas bıçakları ile yatan beyin zarar vermemek için emin olun. Beyin ortaya çıkarmak için kavisli bir forseps ile kafatası üst açık kısmını çıkarın.
- PBS içinde% 0.6 glükoz ihtiva eden bir 15 mm petri kabı beyin toplayın.
- Dkoku ampuller uzakta issect. Dorsal yüzeyinde beyin yerleştirin ve bir neşter kullanılarak kiazmada yoluyla koronal bölümü yapmak.
- Bir mikroskop altında, deneyci doğru yukarı bakacak kesim koronal yüzeyi ile beyin bölümünün rostral kısmını yerleştirin.
- , SVZ teşrih ince kavisli bir forseps ile septum kaldırmak için daha sonra ventrikül hemen bitişiğinde striatum içine ince forseps bir ucunu yerleştirin ve çevredeki doku SVZ ayırın. Ek ayrıntılar için, Azari ve ark., 24 bakın. PBS-% 0.6 glükoz 1 ml ihtiva eden bir petri çanağı parçalandığı SVZ'unda yerleştirin.
3. SVZ Doku Ayrılma
- Hiçbir büyük parçalar kalmayıncaya kadar petri disseke SVZ kıyma.
- 5 dakika boyunca 200 x g'de 15 ml tüp ve santrifüj PBS% 0.6 glukoz ile birlikte kıyılmış doku aktarın.
- (1 Süpernatantı atın ve önceden ısıtılmış papain 1 ml ekleyinmg / ml, 37 ° C'de bir su banyosu içinde 10 dakika için 0.01 mg / ml DNase I inkübe ile takviye edilmiş) aşama 1,4 hazırlandı. Fare başına papain 1 ml kullanın.
- 5 dakika boyunca 200 xg'de Santrifüj ve supernatant atın.
- 1 ml ekleyin ovomukoid önceden ısıtılmış (0,7 mg / ml, 1.5 adım hazırlandı) papain etkinliğini durdurmak için. Mekanik hafifçe P1000 mikropipet ucu aşağı 20 kere yukarı pipetleme ve tek bir hücre süspansiyonu içine daha fazla kıyılmış doku ayırmak. Hava kabarcıkları kaçının.
- Yeni 15 ml'lik bir tüp içinde bir steril 20 um filtre üzerinden bir hücre süspansiyonu geçirin. Hücreleri kaybetmemek için PBS% 0.15 BSA ile hücre filtreyi yıkayın emin olun.
- 10 dakika boyunca 200 xg'de Santrifüj ve supernatant atın. % 0.15 BSA içeren PBS 100 ul hücreleri yeniden askıya.
Hücre Sıralama için 4. Immunofluorescent Boyama
Hücre için Fucci-Kırmızı fareler (Şekil 2A), aşağıdakileri kullanın kullanarak sıralamaantikorları: CD24 fikoeritrin-eşleniği cyanine7 [PY7]; CD15 / Lex floresin izotiyosiyanat [FITC] konjüge edilmiş ve Ax647 konjüge EGF ligand.
Not: Lex + EGFR + hücreleri ve EGFR + hücreleri yetişkin SVZ'unda bol değildir: ≈ 600 ve 1500 hücre / fare sırasıyla 9. Biz yeterli malzeme var 2 ila 3 farelerin SVZ hücrelerin havuzu öneririz. Hücre sıralama süresi 3 saat geçmemesi için, aynı günde birden 12 fareler ile çalışma. Aynı gün çok sayıda fare ile çalışan bir artış hücre sıralama süresinin muhtemelen artan hücre ölümü ve / veya hücre farklılaşmasında sonuçlanan yol açacağı göz önünde bulundurun.
- Fare başına (ya da uygun boyama 2 farenin 3 arasında bir grup için 200 ul) PBS% 0.15 BSA, 100 ul FACS boyaması gerçekleştirin.
- Kontrol tüpleri hazırlayın. Üreticiye göre tek renk kontrolü tüpler hazırlamak için tazminat boncuk kullanın9'un; s protokolü. Hücrelerin bir fraksiyonu (bir fare yeterlidir çıkarılan hücre 1/10) seçip 1 negatif kontrol tüpü (işaretlenmemiş hücreleri) ve 3 floresan eksi bir (FMO) kontrol tüpleri hazırlanması için 4 tüplerde ayırın. Tüp başına PBS% 0.15 BSA, 200 ul tekrar süspansiyon hücreleri.
Tavsiye: Lex-FITC FMO kontrolü için, CD24-PC7 (01:50) ile Ax647-konjüge EGF ligand ile hücreler (1: 200) etiket; ve Ax647-konjuge EGF ligand FMO kontrolü için CD15 / LeX- olan hücreleri etiketlemek: CD24-PY7 FMO kontrolü için, CD15 / Lex-FITC (01:50) ile Ax647-konjüge EGF ligandı (200 1) ile hücreleri etiketlemek FITC (01:50) ve CD24-PY7 (01:50). - Hücre sıralama için kullanılan borular için, PBS içinde gösterilen seyreltme,% 0.15 BSA, aşağıdaki antikorların kullanımı: CD24-PY7 (01:50), CD15 / Lex-FITC (01:50) ile Ax647-konjüge EGF ligandı (1: 200).
- Karanlıkta 4 ° C'de 20 dakika boyunca inkübe edin. 10 dakika boyunca 200 x g'de 1 ml PBS% 0,15 BSA ve santrifüj ile yıkanır. 200 hücrelerin yeniden süspanse81; beyin başına PBS% 0.15 BSA l. Buz üzerinde hücre sıralama tüpleri tutun ve hücre sıralama hemen geçin.
- Fucci-Yeşil fareler kullanıyorsanız, hücre Lex-FITC antikor hisse gibi Fucci-yeşil floresan daha aynı emisyon dalga boyu sıralamadan önce ayırma kolonları kullanılarak ayrı Lex-pozitif ve Lex negatif fraksiyonlar (Şekil 3A, B).
- İlk olarak, PBS% 0,15 BSA, 100 ul karanlıkta 4 ° C'de 15 dakika süre ile, bir fare anti-insan Lex-antikoru (01:50) ile hücrelerin etiketlenmesi.
- Daha sonra, karanlıkta 4 ° C'de 15 dakika süre ile anti-fare IgM mikro-(01:10) ile hücrelerin etiketlenmesi, 10 dakika boyunca 200 x g'de 1 ml PBS% 0,15 BSA, santrifüj ile hücreler yıkanır.
- 10 dakika boyunca 200 x g'de 1 ml PBS% 0,15 BSA, santrifüj ile hücreler yıkanır. 500 ul PBS% 0.15 BSA içinde hücrelerin tekrar Şekil 3 C şematize olarak manyetik alan ayırma kolonu boyunca hücrelerin dökün. 1 ml PBS% 0,15 B ile kolon yıkayınSA Lex negatif kısmın elde edilmesi için.
- Lex pozitif kısmını elde etmek için, manyetik alandan ayırma sütunu kaldırmak ve 2 ml PBS% 0.15 BSA ile hücreleri Zehir.
- 4.2 belirtildiği gibi CD24-PC7 ve Ax647-konjuge EGF ligand boyama devam edin.
5. Hücre Sıralama
Not: Hücreler 86 mikron noozle 40 Psi bir FACS sıralayıcı üzerinde dizildi. 520 / 35nm (FITC), 575 / 26nm (PE), 670/20 nm (Ax647) ve 740LP (PY7): Flüoresans Aşağıdaki filtre seti kullanılarak toplanmıştır. Bir örtüşme Fucci-kırmızı floresan emisyon spektrumları ve PC7 boya arasında bulunan olarak Tazminat yanlış pozitif sinyaller önlemek için gereklidir.
- Sıralama hücre hemen önce, ölü hücrelerin canlı ayırmak için bir vital boya ekleyin. Biz 2 ug / ml nihai konsantrasyonda HO (malzeme tabloya bakınız). FACS sıralayıcı basıp th yoluyla negatif kontrol tüpü (işaretsiz hücreleri) çalıştırınyan dağılım (SSC) ve forward scatter (FSC) parametrelerini (Şekil 1A) kullanarak e hücreleri.
NOT: Ölü hücreleri (Şekil 1A ') Sadece HO-negatif fraksiyon yolluk ve sonra çiftlerin Darbe Genişliği negatif kısmını (Şekil 1A seçerek dışı bırakıldı' ') tarafından dışlandı. - Adım 4.2 hazırlanan tek renk kontrolleri çalıştırın ve photomultiplier tüp ayarlayın (PMT) gerekirse (yani negatif nüfus çok yüksek ve / veya pozitif hücreler kapalı ölçek) gerilimleri. Yazılımın tazminat penceresinde renk tazminat gerçekleştirin.
- Run FMO adım 4.2 (Lex-FITC FMO kontrolü, CD24-PC7 FMO kontrol ve Ax647-konjuge EGF ligand FMO kontrol) hazırlanan kontrol ve sıralama kapıları (Şekil 1) çizin. Şirketinden 1.5 mi mikrotüplerde kültür ortamında 100 ul halinde sıralama hücreleri.
Mikroskopi için Hücre 6. hazırlanması
- Taze sıralanmış hücreyi Plate1 bir yoğunlukta s - 3 x 10 3 hücre / kuyu ile ilgili Poly-D-lizin-kültür ortamında 300 ul, 96 oyuklu μ-Plate kaplama.
- Video mikroskopi önce, hücre yapışmasını sağlayacak kadar en az 1 saat boyunca CO2 37 ° C'de kültür plakaları inkübe ve% 5.
7. Mikroskop Kurulum ve Image Acquisition
- CO2 atmosferinde% 5 altında 37 ° C de ters termostatlı bölmeye bağlı bir konfokal lazer tarama mikroskobu sisteminde: Plan Apo VC 20x objektif DIC (0.75 NA) kullanılarak canlı görüntüleme gerçekleştirin.
- Önceden ısıtılmış ve dengelenir termostatlı odasının içine 96 kuyu μ-Plate yerleştirin ve termostatlı bir kapak ile kapağı değiştirin.
- NIS-Elements yazılımı açın ve menü çubuğunda tıklayın time-lapse seçenekleri (uzunluk, sahne pozisyonları, konfokal z bölümler, ...), "Acquire / Toplama kontrollerini seçmek için" Acquire / Toplama / ND edinimi kontrol " / Ti Pad221; hedefleri seçmek ve "Acquire / Toplama kontrolleri / A1plus Ayarları" menü çubuğunda her floresan için PMT seviyesini seçmek için. veri dosyalarını kaydetmek için bir klasör seçin.
- ND edinme penceresini kullanarak, her merkezi sıra sahne konumunu ayarlamak ve 7 x 7 mm² büyük görüntü seçeneği seçin. Bu iyi, her merkezi etrafında bir mozaik görüntü yaratacaktır. % 5 büyük mozaik resim için örtüşme ayarlayın. 24 saat boyunca her 20 dakika fotoğraf çekmek. Ti Pad penceresinde: Planı Apo VC 20x DIC objektif (0.75 NA) seçin.
- A1plus Ayarlar penceresinde, 1.26 mm / piksel çözünürlüğe sahip 512 x 512 piksel formatında yüksek hızda rezonans tarayıcı kullanarak görüntü elde. Hücre şekilleri görselleştirmek için aydınlık kullanın. Fucci-Kırmızı farelerin durumunda, 561 nm kırmızı floresan heyecanlandırmak ve 595/50 nm filtre kullanılarak toplamak. Fucci-Yeşil farelerde durumunda, 488 nm 'de yeşil flüoresans tahrik ve 530/40 nm filtre kullanılarak toplanır. Optimal PM belirleyinHer dalga boyu T seviyesi, ofset ve lazer güç.
NOT: Yazılım, her satın alma önce her aşama pozisyonunda otofokus izin aydınlık kanalı için otomatik odaklama işlevini kullanmanızı öneririz. İpucu: Bir Planı Apo VC 20x DIC hedefi (NA: 0.75) petrol için gerek kalmadan mükemmel çözünürlük için kullanıldı. Diğer hedefler istenilen optik çözünürlüğe bağlı olarak kullanılabilir. - Edinimi başlamak için ND edinme penceresinde 'şimdi çalıştır' düğmesini seçin.
İpucu: Düzgün çalışan her şeyin emin olmak için 1 döngü bilgisayar çalışmalarını izleyin.
8. Görüntü İşleme ve Analizi
- Hücreleri tek tek takip ederek NIS-Elements yazılımı doğrudan verileri analiz edin. İpucu: zaman kazanmak NIS-Elements yazılımı kullanılarak .avi formatında her konumunu kaydetmek ve ImageJ ile film analiz etmek.
- ImageJ yazılım olarak, en az 2 tümen (yani bir hücre geçiren bireysel hücreleri izlemekDört hücre kolonisi). Hücrenin etrafında küçük bir alanı kırpma ve 'Resim / Çoğalt' öğesini seçin.
- Bir montaj yapmak için menü çubuğundaki 'Resim / Yığınlar / Make Montage' seçeneğini seçin. Çerçeveler dahil edilecek görüntülerin boyutunu belirtin ve optimum çözümü için bir tif dosyası olarak montaj kaydedebilirsiniz.
- İlk SG 2 / M faz uzunluğu (Şekil 2C, D) hesaplamak için, (G 1) tek bir kırmızı floresan hücre seçin ve ardından t (kırmızı-floresan kapanır kez başlayacak S fazı) 0 = ayarlayın. Hücre SG 2 / M uzunluğunu tahmin etmek böler kadar kare sayısını sayın.
NOT: Hesaplanan zaman her karede arasındaki zaman aralığına bağlıdır. - Aşağıdaki G1 fazı (Şekil 2C, D) hesaplamak için, sadece bölünmüş hücreyi izlemek için devam ediyor. Bölünmüş hücre G1 fazı girerse, cdt1 kırmızı floresan proteini birikimi olacaktır. Kırmızı-floresan aga kapanana kadar kare sayısını hesaplayınher bir hücre için in.
İpucu: G 1 yılı başında kırmızı floresan zayıf olabilir bu yüzden hücre yaklaşımlar önlemek için ikiye böldü çerçeve üzerinde G 1 fazının başlangıcını seçin.
Representative Results
Güvenilir yetişkin fare SVZ kök hücre soyunun farklı hücre popülasyonlarının arasında ayrım yeteneği fonksiyonel özelliklerini araştırmak için ilkel olduğunu. Bu amaçla, biz yetişkin SVZ'unda belirli hücre popülasyonlarının arıtılmasını sağlayan Lex / EGFR / CD24 üçlü etiketleme stratejisi geliştirdik: hareketsiz NSC'lerde (Lex parlak), aktive NSC'lerde (Lex + EGFR +), TAC (EGFR +) , olgunlaşmamış ve göç Nöroblastlar (CD24 + EGFR + sırasıyla CD24 +), 9 (Şekil 1). Fucci transgenik farelerin Uygulanan tekniği sıralama hücre tek hücre düzeyinde 25 farklı nörojenik popülasyonlarının hücre döngüsü aşamalarında canlı görüntüleme sağlar. Fucci-Kırmızı fareler kırmızı floresan kullanarak time-lapse video mikroskopi (Şekil 2A) ile G 1 faz izlemek için kullanıldı. Fucci-Kırmızı negatif hücreleri S- hücreleri temsilG hücre döngüsünün 2 / M evreleri, Fucci-Kırmızı pos hücreleri G 1 hücreleri ve Fucci-Kırmızı parlak hücreleri veya hücre döngüsü dışında (Şekil 2B) 23,26 çıkan hücreler vardır bulunmaktadır. Lex + EGFR + ve genç yetişkin (Şekil 2C) ve orta yaşlı farelerde (Şekil 2B) için EGFR + hücreleri, poli-D-lizin kaplı kültür plakaları üzerine yapışık hücreler olarak plakalanmıştır. Kırmızı floresan Hücre bölünürken kadar kapanır kez ilk SG 2 / M faz tek hücre tespit edilmiştir. Daha önce SG gözlemlediği gibi 2 / M faz uzunluğu ya genç ya da orta yaşlı farelerde Lex + EGFR + ve EGFR + hücreler arasında hiçbir farklılık göstermedi. Kırmızı floresan kapanana kadar Sonra ilk bölümü sonraki G 1 faz uzunluğu hesaplanır. İlginçtir, G 1 fazlı uzatma Lex + EGFR + hücreleri değil, yaşlanma sırasında bulunduEGFR + hücreleri 25 (Şekil 2C, D). Sonuç olarak, 5 gün neurospheres kaplama sonrası elde edilen Şekil 2E'de gösterildiği gibi, yaşlı farelerde elde edilen Lex + EGFR + hücrelerinin daha küçüktür.
Fucci-Yeşil fareler de SG yeşil bir parlaklığı olan 2 / M faz görselleştirmek için kullanılabilir (Şekil 3A, B), fakat hücre Lex-FITC antikoru ve ayırma kolonları kullanılarak önceden sıralanmış olması FUCCI- ile aynı emisyon dalga boyu paylaşılan yeşil floresan (Şekil 3C). Genç yetişkin Lex + EGFR + ve EGFR + hücrelerinin ilk SG 2 / M faz için Fucci yeşil floresan bir örneği, Şekil 3D'de gösterilmektedir.
Şekil 1:. FACS ile hücre seçimi Strateji (A) Hücreler ilk t göre seçilmiştirİleri saçılım (FSC) parametreleri vs Yan dağılım (SSC) kullanarak mirasçı morfolojisi. Morfoloji kapısı seçimi Daha fazla bilgi için, Daynac ark bakın. 9 (A ') Ölü hücreleri HO kalem kullanarak etiketli ve seçimin dışında bırakıldı. (A') ikilileri darbe genişliği parametresi kullanılarak dışı bırakıldı. Sıralama kapıları, Floresan eksi bir (FMO) kurmak amacıyla CD24-PC7 için kontrolleri (Lex-FITC / Fucci-Kırmızı / EGF-Ax647 etiketleme; B) ve Lex-FITC (Fucci-Kırmızı / EGF-Ax647 / CD24 -PC7 etiketleme; B ') kullanılmıştır (Cı-C.! Sonra ayırma kapıları Lex-FITC / Fucci-Kırmızı FMO kontrolleri ile birlikte / EGF-Ax647 / CD24-PY7 işaretlenmiş tüplere tespit edilmiştir). Toplam hücrelerin ortalama yüzdeleri kapıları temsil edilmektedir. CD24 + hücreler (Nöroblastlar) seçildiğinde, kapısından CD24 parlak ifade eden hücreleri dışlamak için dikkatli olun. Ependim ce için Nitekim, CD24 parlak karşılık gelmektedirlls 2,9. C 'CD24 negatif hücreler (C siyah kare) temsil eder. Sadece Lex + EGFR + EGFR + (C ') ayırma kapıları bu çalışma için kullanıldı.
Şekil 2: Fucci-Kırmızı fareler kullanılarak hücre döngüsünün canlı analizleri (A) hücreleri SG 2 / M fazlar 23 (B), FACS gösterimi arasında sırasında G1 fazında kırmızı fluoresan ve renksizdir Fucci-Kırmızı hücre döngüsünün şematik temsili.. SVZ hücreler üzerinde Fucci-Kırmızı floresan. (C, D) Lex + EGFR + ve EGFR + hücreleri genç (C) sıralanır ve orta yaşlı (D) Video mikroskopisi Fucci-Kırmızı fareler G 1 faz izleme ile izin verir 2 / M evreleri whe çıkarılabilir SG ise kırmızı floresann kırmızı floresan kapanır. Ardışık görüntüler D sunulan bir zaman ölçeği ile gösterilir. Kolonilerin (E) Temsilcisi görüntüleri (neurospheres) kaplama 5 gün sonra aldı. Ölçek çubuğu:. 10 mikron (C, D), 30 um (E), bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3:.. Fucci-Yeşil fareler kullanılarak hücre döngüsünün canlı analizler için Stratejisi (A) hücreleri SG sırasında G 1 faz 23 sırasında 2 / M faz ve renksiz yeşil Fucci-Yeşil hücre döngüsünün şematik gösterimi (B) FACS gösterimi Fucci-Yeşil floresan: Fucci-Yeşil negatif hücreleri G hücre döngüsü faz 1 hücreleri temsil Fucci-Gree isen pos hücre / M 23 SG 2 hücrelerdir. (C) yeşil floresan SG 2 / M Lex + EGFR + evrelerini ve EGFR + hücreler takip etmek amacıyla, SVZ hücrelerin ayırma kolonları önceden sıralanmış gerekiyordu. Hücreler anti-fare Lex antikoru ve Lex + kesir anti-fare mikroboncukları kullanılarak sütun üzerinde muhafaza edilmiştir ile etiketlenmiş (protokol 4. bakınız). Ardından, Lex + ve Lex - fraksiyonlar ayrıştırılmıştır ve EGF-Ax647 ve FACS sıralama için CD24-PC7 antikorları ile etiketlendi (D) video Lex + EGFR + 'nın mikroskobu ve EGFR genç Fucci-Yeşil farelerden sıralanır + hücrelerinin takibi sağlar. yeşil floresan SG 2 / M evreleri. Birbirini takip eden görüntüler D sunulan bir zaman ölçeği ile gösterilmiştir. Ölçek çubuğu: 10 mikron (D).
Discussion
Burada tarif edilen hücre sıralama tekniği yetişkin beyin 9 quiescent NSC'lerde aktive NSC'lerde ve özellikleri onların döl sağlayan çalışmalar ve dinamikleri arasındaki güvenilir ayrımcılığı verir. Canlı hücrelerde 23 hücre döngüsü ilerlemesinin görselleştirme izin Fucci teknolojisi ile birleştiğinde, genç yetişkin ve yaşlı fare beyin hücrelerinden hücre döngüsü G 1 ve SG 2 / M evrelerini takip etmek hızlı ve verimli bir teknik geliştirdi.
Bu protokolde kullanılan hücre ayırma tekniği SVZ'unda 9'dan beş ana nörojenik nüfus arıtılmasını sağlayan belirteçler ilk doğrulanmış kombinasyonu oldu. Ayrıca durgun ve aktive NSC'lerde ayrım sağlayan ilk doğrulanmış tekniktir. Bu teknik, su transjenik fare modelleri için adapte gerekli olan transgenik farelerde tek başına kullanımını gerektirmez dikkat çekicidirFucci olarak ch. O zamandan beri, Codega ve ark., 10 kendi aktive edilmiş karşıtından hareketsiz NSCs ayırt etmek için bir GFAP-GFP / CD133 / EGFR üçlü etiketleme kombinasyonu kullanılmış ancak GFAP-GFP transgenik farelerin kullanımını gerektirir gibi Fucci teknolojiye uygun edilemez. Mich ve ark., 11 Bu çalışmada 9 kullanılan teknikle ortak sonuçlar paylaşan bir Glast / EGFR / CD24 üçlü etiketleme stratejisi geliştirdik. Nitekim, Lex ve Glast NSC'lerde belirteçleri arasında yüksek bir korelasyon zaten Daynac ark gözlendi. 9 çalışma. Bununla birlikte, Mich ve ark., Teknikte kullanılan Glast antikoru fıkoeritrin akuple edilir ve böylece Fucci-Kırmızı farelerin kullanımı adapte edilemez.
SVZ hücrelerin sıralamadan önce dikkat edilmesi gereken birkaç önemli teknik noktalar vardır. İlk olarak, ayrıştırma adımı beyin dokusu yapısal korurken tek hücre ayrışması için olduğu gibi çok önemlidirAntikor etiketleme stratejisi için kullanılan proteinlerin bütünlük içeri-. % 0.05 tripsin-EDTA SVZ doku 27, ancak Lex antijeni gibi hemen hemen tüm Lex-FITC immünofloresan (veriler gösterilmemiştir) yitiren oldukça hassas olduğu saptanmıştır ayırmasına çok etkili olduğu gösterilmiştir. Bu daha verimli ve beyin dokusu üzerinde, diğer proteazlardan daha az yıkıcı olarak Böylece, papain kullanılmıştır. Ayrıca, Lex ne EGFR ne CD24 ne papain tedavi etkilendi. Bu papain tedavisi 15 dakika aşıldığında Antikor etiketleme değiştirilmiş olduğu not edilmelidir. Biz mekanik ayrışma (pipet yukarı ve aşağı 20 kez) ile ilişkili bir 10 dakika papain tedavi ile en iyi sonuçları elde ettik.
Poli-D-Lisin kaplama yapışan hücrelerin kültürü ve kültür birkaç gün sonra koloniler elde edilmesine olanak sağlamaktadır. Bu artık yaygın vitro deneylerde kendi sınırlamaları 28,29 ile geldiğini kabul edilmektedir. Biz sadece ilk hücre döngüsünü belirleyen tavsiyeen az bir sonraki bölümü geçiren hücreler in vivo hücre fenotipi mümkün olduğunca yakın kalmak.
Bu Geminin (yeşil floresan) ve Cdt1 (kırmızı floresan) proteinleri, daha önce farelerde 30 ve yetişkin beyin 9,25 dokular erken nöron sırasında bol sinir atalarıdır tarafından ifade edilmesi gösterildi 23 Fucci sistem tasarımı için kullanılan söz çekicidir . MKO2-hCdt1 (30/120) yapı ağırlıklı kırmızı floresan ile G1 fazı takip etmek bu çalışmada kullanılan olmasına rağmen, her iki yapıları kullanımı [mKO2-hCdt1 (30/120) ve MAG-hGem (1/110) ] hücre döngüsünün ana evrede görselleştirme (G 1 ve SG 2 / M) yanı sıra, G1 / S geçiş 23 sağlamak için tasavvur edilebilir. Iki renkli görüntüleme temel sakıncası, halen hücre etiketlenmesi için kullanılabilecek flüoresan sınırlı uyumlu ayarlar. Bir çözüm separati kullanmaktırsütunlarda. Örneğin, başarılı bir sıralama hücrenin önce ayırma kolonları kullanılarak hücrelerin CD24-pozitif kısmını tükenmiş ve canlı görüntüleme biz Fucci-Kırmızı floresan 25 ile aynı emisyon dalga boyu paylaşılan bir CD24-PE antikor kullanıldığı gibi.
Az sayıda çalışmada erişkin fare SVZ popülasyonlarının hücre döngüsü uzunluğu araştırdık. Bizim tekniği ile elde edilen toplam hücre döngüsü uzunluğu Costa et al. 21 in vitro olarak tahmin edilen bir yakın, ama biz farklı hücre döngüsü evrelerini ayırt ilk defa başardık. Bir in vivo çalışmada Ponti ve ark., 22 farklı SVZ hücre popülasyonlarının çoğalması dinamiklerini tespit etmek timidin analogları dahil edilmesine kullanılır. Ancak, hücre döngüsünün sürekli izleme gerçekleştirmek ne tek hücre düzeyinde hücreleri izlemek olabilir de. Bu, güçlü bir heterojenite zekâ var olduğunu gösterdiği gibi bir sorun olabilirBelirli bir SVZ hücre popülasyonunu 22,25 hin. Biz burada bir tek hücre düzeyinde farklı yetişkin nörojenik popülasyonlarının hücre döngüsü aşamalarında canlı görüntüleme sağlar kurmak kolay vitro tekniğinde bir alternatif, açıklar.
Nöral kök hücre ve atalarıdır hücre döngüsünün düzenlenmesini anlamak yaşlanma veya beyin patolojileri bağlamında yeni terapötik yaklaşımların geliştirilmesi için bir sorun olmaya devam etmektedir. Bizim protokol böylece geniş bir uygulama yelpazesi var olabilir. Yaşlanma bağlamında, bu teknik de NSC'lerde farklılaşma yaşlanma etkilerini anlamak için yararlı olabilecek. Gerçekten de, bu da kırmızı floresan yoğunluğu 26 belirgin bir şekilde yüksektir olarak farklılaşma giren nöral kök / progenitör hücreleri tanımlamak mümkündür. Son olarak, aynı zamanda soy pro sorumlu hücre içsel ve dışsal süreçleri incelemek için bir tek hücre düzeyinde sürekli canlı görüntüleme yararlanmaya ilgi olabilirYetişkin NSC'lerde regresyon.
Acknowledgments
Biz C Joubert, V Neuville, V Barroca, J Tilliet ve hayvan tesislerinin tüm personeline borçlu olan; hücre sıralama J Baijer ve N Dechamps için; Onun idari yardım için teknik yardım için O. Etienne, ve A. GOURET. Flow sitometri ve hücre sıralama DIM-Kök-kutuplu, INSERM, Fondation ARC ve CEA gelen ekipman hibeleri ile kurulan, IRCM Sitometrisi Paylaşılan Kaynak de gerçekleştirilmiştir. Bu çalışma Electricité de France (EDF) hibe ile desteklenmiştir. MD Région Ile-de-France (DIM Biothérapies) La Ligue Contre le Cancer ve LM gelen burslu vardır. Marc-André Mouthon ve hisse ortak kıdemli yazarlık François D. BOUSSIN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well uncoated glass bottom culture plates | MatTek Corp. | P96G-1.5-5-F | |
| µ-Plates 96-well | Ibidi | 89626 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A003E | |
| NeuroCult NSC Basal Medium | STEMCELL Technologies | 5700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplement | STEMCELL Technologies | 5701 | |
| Heparin | STEMCELL Technologies | 7980 | |
| EGF | Millipore | GF144 | |
| FGF-2 | Millipore | GF003 | |
| Papain | Worthington | LS003119 | |
| EBSS | Invitrogen | 24010-043 | |
| L-cysteine | Sigma | C-7352 | |
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Promega | V4231 | |
| DNase I | Sigma | D5025-15KU | |
| Trypsin inhibitor type II | Sigma | T9128 | Ovomucoid |
| DMEM:F12 medium | Life Technologies | 31330-038 | |
| 20 µm filter | BD Medimachine Filcon | 340622 | |
| Eppendorf microtubes 3810X | Sigma | Z606340-1000EA | |
| BSA | Sigma | A1595 | Bovine serum albumin solution |
| CD24 phycoerythrin-cyanine7 conjugate [PC7] | Life Technologies | A14776 | Mouse IgM; clone MMA. 1:50 |
| CD15/LeX fluorescein isothiocyanate [FITC] - conjugated | BD Biosciences | 332778 | Rat IgG2b; clone M1/69. 1:50 |
| Mouse anti-human LeX antibody | BD Pharmingen | 559045 | Mouse IgM; clone MAM. 1:50 |
| Alexa647 - conjugated EGF ligand | Life Technologies | E35351 | 1:200; Ax647-conjugated EGF ligand in the text |
| CompBeads | BD Biosciences | 644204 | |
| MACS LS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | separation columns (in the manuscript) |
| Anti-mouse IgM microbeads | Miltenyi Biotec | 130-047-301 | |
| Hoechst 33258 | Sigma | 861405 | HO (in the manuscript) |
| INFLUX cell sorter | BD Biosciences | FACS sorter (in the text) | |
| Nikon A1R confocal laser scanning microscope system attached to an inverted ECLIPSE Ti | Nikon Corp. | confocal laser scanning microscope (in the manuscript) | |
| NIS-Elements AR.4.13.01 64-bit software | Nikon Corp. | NIS-Elements software (in the manuscript) | |
| Plan Apo VC 20x DIC objective (NA: 0.75) | Nikon Corp. | ||
| ECLIPSE Ti thermostated chamber | Nikon Corp. | thermostated chamber (in the manuscript) | |
| ImageJ | RBS | ||
| FlowJo | Tree Star, Ashland, OR | ||
| FUCCI mice | RIKEN BioResource Center, JAPAN | Sakaue-Sawano et al. 2008 |
References
- Morshead, C. M., et al. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Pastrana, E., Cheng, L. C., Doetsch, F. Simultaneous prospective purification of adult subventricular zone neural stem cells and their progeny. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 6387-6392 (2009).
- Doetsch, F., Caille, I., Lim, D. A., Garcia Verdugo, J. M., Alvarez Buylla, A. Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain. Cell. 97, 703-716 (1999).
- Kriegstein, A., Alvarez Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Lois, C., Garcia Verdugo, J. M., Alvarez Buylla, A. Chain migration of neuronal precursors. Science. 271, 978-981 (1996).
- Fuentealba, L. C., Obernier, K., Alvarez Buylla, A. Adult neural stem cells bridge their niche. Cell stem cell. 10, 698-708 (2012).
- Rietze, R. L., et al. Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain. Nature. 412, 736-739 (2001).
- Fischer, J., et al. Prospective isolation of adult neural stem cells from the mouse subependymal zone. Nat Protoc. 6, 1981-1989 (2011).
- Daynac, M., et al. Quiescent neural stem cells exit dormancy upon alteration of GABAAR signaling following radiation damage. Stem Cell Res. 11, 516-528 (2013).
- Codega, P., et al. Prospective identification and purification of quiescent adult neural stem cells from their in vivo niche. Neuron. 82, 545-559 (2014).
- Mich, J. K., et al. Prospective identification of functionally distinct stem cells and neurosphere-initiating cells in adult mouse forebrain. Elife. 3, e02669 (2014).
- Capela, A., Temple, S. LeX ssea 1 is expressed by adult mouse CNS stem cells identifying them as nonependymal. Neuron. 35, 865-875 (2002).
- Calaora, V., Chazal, G., Nielsen, P. J., Rougon, G., Moreau, H. mCD24 expression in the developing mouse brain and in zones of secondary neurogenesis in the adult. Neuroscience. 73, 581-594 (1996).
- Pineda, J. R., et al. Vascular derived TGF-beta increases in the stem cell niche and perturbs neurogenesis during aging and following irradiation in the adult mouse brain. EMBO Mol Med. 5, 548-562 (2013).
- Lugert, S., et al. Quiescent and active hippocampal neural stem cells with distinct morphologies respond selectively to physiological and pathological stimuli and aging. Cell stem cell. 6, 445-456 (2010).
- Blackmore, D. G., Golmohammadi, M. G., Large, B., Waters, M. J., Rietze, R. L. Exercise increases neural stem cell number in a growth hormone dependent manner augmenting the regenerative response in aged mice. Stem cells. 27, 2044-2052 (2009).
- Bouab, M., Paliouras, G. N., Aumont, A., Forest Berard, K., Fernandes, K. J. Aging of the subventricular zone neural stem cell niche evidence for quiescence associated changes between early and mid adulthood. Neuroscience. 173, 135-149 (2011).
- Enwere, E., et al. Aging results in reduced epidermal growth factor receptor signaling diminished olfactory neurogenesis and deficits in fine olfactory discrimination. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 8354-8365 (2004).
- Maslov, A. Y., Barone, T. A., Plunkett, R. J., Pruitt, S. C. Neural stem cell detection characterization and age related changes in the subventricular zone of mice. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 1726-1733 (2004).
- Tropepe, V., Craig, C. G., Morshead, C. M., van der Kooy, D. Transforming growth factor alpha null and senescent mice show decreased neural progenitor cell proliferation in the forebrain subependyma. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 17, 7850-7859 (1997).
- Costa, M. R., et al. Continuous live imaging of adult neural stem cell division and lineage progression in vitro. Development. 138, 1057-1068 (2011).
- Ponti, G., et al. Cell cycle and lineage progression of neural progenitors in the ventricular-subventricular zones of adult mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1045-1054 (2013).
- Sakaue Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. Journal of visualized experiments JoVE. , (2010).
- Daynac, M., et al. TGFbeta lengthens the G1 phase of stem cells in aged mouse brain. Stem cells. 32, 3257-3265 (2014).
- Roccio, M., et al. Predicting stem cell fate changes by differential cell cycle progression patterns. Development. 140, 459-470 (2013).
- Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse two cultures isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. Journal of visualized experiments JoVE. , e51225 (2014).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres re evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Pastrana, E., Silva Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open a critical review of sphere formation as an assay for stem cells. Cell stem cell. 8, 486-498 (2011).
- Spella, M., et al. Licensing regulators Geminin and Cdt1 identify progenitor cells of the mouse CNS in a specific phase of the cell cycle. Neuroscience. 147, 373-387 (2007).
