Abstract
Adaptiven Immunität wird von dynamischen Wechselwirkungen zwischen T-Zellen und Antigen-präsentierenden Zellen ("APCs") reguliert die so genannte "immunologischen Synapsen. Innerhalb dieser intimen Zell-Zell-Schnittstellen diskreten subzellulärer Cluster von MHC / Ag-TCR, F-Actin, Adhäsion und Signalmoleküle bilden und umgestalten schnell. Diese Dynamik werden gedacht, um kritische Determinanten der sowohl die Effizienz und die Qualität der Immunantwort, die sich entwickeln und damit der Schutz gegen pathologische Immunität. Aktuelle Verständnis der immunologischen Synapsen mit physiologischer APCs wird durch die Unzulänglichkeit der erhältliche Bildauflösung beschränkt. Obwohl künstlichen Substrat-Modelle (zB planaren Lipid-Doppelschichten) bieten hervorragende Auflösung und waren äußerst wertvolle Instrumente, sie sind von Natur aus nicht-physiologischen und vereinfacht. Vaskulären und lymphatischen Endothelzellen haben sich als wichtige peripheren Gewebe (oder Stroma) Abteil "semi-Beruf entstandenal APCs ". Diese APCs (die meisten der molekularen Maschinerie der professionellen APCs Express) haben die einzigartige Eigenschaft von nahezu planaren Zelloberfläche bilden und sind (mit fluoreszierenden Proteins Reportern zB) leicht transfizierbar. Hier ein grundlegendes Konzept für Endothelzellen als neuartige und physiologische 'planaren Zell APC-Modell "für eine verbesserte Bildverarbeitung und Abfrage der Grundantigenen Signalprozesse zu implementieren beschrieben.
Introduction
T-Lymphozyten sind ein Zweig des adaptiven Immunsystems gekennzeichnet durch die Fähigkeit, Peptidantigen (Ag) effizient zu erkennen Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) gebundenen Moleküle durch ihre T-Zell-Rezeptoren (TCRs) 1. Naive Lymphozyten konstitutiv migrieren und scannen Berufs Ag-präsentierende Zellen "(APC; zB dendritische Zellen) innerhalb von Lymphknoten, während Memory / Effektor-T-Zellen benötigen, um eine extrem breite Palette von APCs und potentiellen Zielzellen im peripheren Gewebe effektiv zu überwachen.
Im min nach dem erstmaligen Ansatz des verwandten Ag auf einer APC, Lymphozyten zu verhaften ihre Migration und beginnen, eine spezialisierte intime Zell-Zell-Schnittstelle genannt 'immunologischen Synapse' zu bilden (IS). Anhaltende (dh 30-60 min) Kontakte sind erforderlich, um zu verstärken und zu erhalten Signalisierungs 2-7. Schwellen Studien identifizieren, die innerhalb der IS, ist es die kontinuierliche und schnelle Bildung remodeling diskreter subzellulären Signalisierungsmikrocluster (dh enthaltend MHC / Ag-TCR, F-Actin, Adhäsion und Signalmolekülen), die die Stärke und Qualität der resultierenden Immunantworten 2-7 zu bestimmen. Allerdings sind dynamische Details und regulatorischen Mechanismus dieses Prozesses unvollständig verstanden 8,9. Dies ergibt sich im Wesentlichen aus technischen Herausforderungen mit unregelmäßigen Topologien von APC Oberflächen und schlecht kontrollierte Ausrichtung der Zell-Zell-Interaktion Flugzeuge, Fragen, die zutiefst begrenzen die erforderliche Raumzeit-Bildgebung assoziiert nähert 8-10 (Abbildung 1a).
Abbildung 1. Ein Physiologische Planar Handy APC-Modell für Imaging immunologischen Synapse Dynamics. Die Abbildung zeigt, traditionellen Bildgebung von immunologischen Synapse zwischen einer T-Zelle und einer professio nal APC (A) und T-Zell-und ein traditionelles planaren Lipid-Doppelschicht APC-Modell (B) im Vergleich zu diesem Roman Endothelzellen planar APC-Modell (C). Professionelle APCs bereitzustellen physiologischen immunologischen Synapsen bieten aber schlecht orientierte Zell-Zell-Schnittstelle (dh in Bezug auf die optimale xy Abbildungsebene; Auflösung ~ 0,2 & mgr; m), die dramatisch beeinträchtigt räumliche (z Abbildungsebene Auflösung ~ 1 & mgr; m) und zeitliche (dh aufgrund der Notwendigkeit, immer wieder zu scannen durch alle z Abbildungsebenen) Auflösung der Bildgebung. Doppelschicht-Modelle haben eine planare Topologie, die eine optimale Raumzeit-Bildauflösung bietet, werden aber auch in stark vereinfachter, nicht-physiologischen und starr. Diese Endothelzellen-Modell vereint die planare Topologie der Lipid-Doppelschichten mit dem physiologischen Substrat eines klassischen APC, um eine optimale räumliche und zeitliche Bildauflösung in einer physiologischen Umgebung zu liefern.m / files / ftp_upload / 53288 / 53288fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Frühere Arbeiten haben zum Teil diese Hindernisse durch Entwicklung planaren Substrat Modellen (dh Lipiddoppelschichten und Antikörper-beschichteten Oberflächen), welche optimale Raum-Zeit-Auflösung (dh bereitzustellen umgangen über Fixierung des T-Zell-Aktivierungsfläche in einem einzigen Plan, die parallel zu der optimalen xy Bildgebung Ebene) 11-15 (1B). Diese Modelle haben wichtige Einblicke in die subzelluläre / Molekulardynamik, die Antigen-Signalisierung in T-Zellen, einschließlich der Entdeckung der dynamischen Aktin / TCR Signalisierung Mikro-Clustern 7,11-14 Kontrolle erleichtert. Allerdings sind solche Modelle von Natur aus stark vereinfacht, sowie starre (Ausschluss der Entwicklung / Untersuchung der 3-dimensionale topologische Merkmale) (1B). Daher bleibt es unsicher, wie man solche Feststellungen phy beziehensiologic Zell-Zell-Immunüberwachung.
Obwohl noch under werden vaskulären und lymphatischen Endothelzellen als großen Schwellen (dh mehr in den Zahlen als alle professionellen APCs, die von ~ 1.000-fach) Peripheriefach 'semi-professionellen "APCs 16-18. Diese Zellen exprimieren MHC-I- MHC-II- und einer Vielzahl von Co-Stimulator Moleküle (zB CD40, LFA3, ICOSL, 4-1BB, OX40L, TL1A, PD-L1, nicht aber CD80 und CD86) und sind strategisch an der Blut-Gewebe-Grenzfläche, wo sie dienen spezialisierte Sentinel-Funktionen 16-18 positioniert. Frühere Studien zeigten, dass Endothelzellen wirksam neu zu stimulieren Effektor / Memory, aber nicht naiv, T-Zellen 19-25. Somit sind Endothelzellen wahrscheinlich einzigartig APC Rollen in Effektorphase adaptive Immunantworten in den peripheren Geweben, wie etwa lokale Einfluss auf T-Zellaktivierung, Differenzierung, Speicher und Toleranz 16,17,26 spielen. Crimatisch, wenn sie in vitro gezüchtet, Endothelzellen bilden praktisch planaren Zelloberflächen und leicht transfektierbare (beispielsweise mit fluoreszierenden Reporterproteine). Diese Eigenschaften sind ideal für hohe Raum-Zeit-auflösende Bildgebung der topologischen Dynamik während der Zell-Zell-Wechselwirkungen 19,27. So Endothelzellen als physiologische 'planaren Zell APC-Modell ausgesprochen geeignet für die Untersuchung der subzellulären / molekulare Umbaumechanismen, die Antigen-Erkennung zu fahren und zu regulieren Antworten (1C) 19,20 dienen könnte.
Vorher festgelegten komplementären Bildgebungstechniken (einschließlich Transfektion der Endothelzellen mit fluoreszierenden Protein Trägern der Plasmamembran und Cytosol) zur Untersuchung der Details der Leukozyten-Endothel-Interaktion während der Adhäsion und transendotheliale Migration 27, zeigte, daß Leukozyten die Oberfläche des Endothels Sonde aktiv durch dynamische Insertion eind Einfahren der Submikron-Maßstab, Actin-reiche zylindrischen Vorsprünge (~ 200-1000 nm Durchmesser und Tiefe) bezeichnet invadosome artigen Vorsprüngen (dh "ILPs ') 27,28. Diese bildgebenden Ansätze wurden weitere mit der Erstellung von Protokollen erweitert, um die Vorteile der endothelialen APC-Funktion, um die ersten Methoden zur hohen Raum-Zeit-auflösende Bildgebung des T-Zell-endothelialen immunologischen Synapse wie berichtet 19,20 entwickeln und weiter zu beschreiben hier. Eine zentrale Erkenntnis aus diesem neuartigen planaren Zell APC-Modell abgeleitet ist, dass T-Zell-ILPs funktionieren sowohl bei der Förderung der anfänglichen Ag Nachweis und bei der Aufrechterhaltung nachfolgende Signalisierung. Tatsächlich Arrays von mehreren ILPs (die stabilisiert und als Reaktion auf aufgelaufene Calciumfluss initial wurden) zeigen die Anreicherung in TCR und Molekülen andeutend aktives Melde wie PKC-Q, ZAP-70, Phosphotyrosin und HS1. Daher ILPs scheinen eine dreidimensionale physiologischen äquivalent der TCR-Signalgebung Mikro darstellenCluster in planare Doppelschicht-Modellen gesehen. Dieser Ansatz, so zeigt sensibel / Berichte molekularen und architektonischen (und stillschweigende biomechanischen) Dynamik sonst nicht nachweisbar.
Das hier beschriebene Verfahren ist nützlich, um die Lücke zwischen professionellen APC und künstliche APC-Substrat-Modelle, um unsere Fähigkeit, grundlegende Mechanismen der adaptiven Immunantwort zu verhören zu verbessern. Während hier der Schwerpunkt auf der Aktivierung von CD4 + Th1-Typ-Effektor / Speicherzelle kann dieser Ansatz leicht modifiziert werden, um eine breite Palette von T-Zell-Typen und Ags zu studieren, wie unten diskutiert.
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Protocol
Alle in diesem Protokoll beschriebenen Experimente mit primären menschlichen T-Zellen und im Handel erhältlich primären humanen Endothelzellen (dermal oder Lungenmikrovaskulären ECs) .Any Forschungsprotokoll am Menschen muß durch eine Ethikkommission genehmigt werden und eine schriftliche Einverständniserklärung muss von zur Verfügung gestellt werden durchgeführt Jede Blutspende. Experimente durchgeführt, unter Verwendung dieses Protokolls wurden von der IRB der Diakonisse Beth Israel Medical Center bestätigt.
1. Vorbereiten Menschen CD4 + Th1 Effektor / Memory T-Zellen
- Bewerben Stauschlauch an den Arm des Spenders, wischen Vene mit Alkohol, und Nadel. Langsam ziehen 15 ml Blut in EDTA Vacutainer Verwendung als Antikoagulans. Wenn das Blut gezogen worden ist, lösen die Blutsperre, bevor Sie die Nadel. Druck, mit steriler Gaze gewickelt, wenn die Nadel entfernt wird unmittelbar gelten.
- Übertragen Sie Blut in ein 50 ml Röhrchen. Hinzufügen RPMI-1640 bei Raumtemperatur zu einem 1: 1-Verdünnung (Endvolumen 30 ml). Die verdünnte sorgfältig überlagernd Blut auf zwei 50 ml-Röhrchen mit 15 ml vorgefilterten Lymphozyten Isolationsmedium, wie beispielsweise Ficoll-Paque bei RT.
- Zentrifugieren Sie die Steigung bei RT für 30 min bei 1200 × g in einer Schwingbecherrotor. Während der Zentrifugation vorbereiten T-Zell-Medium (500 ml RPMI-1640, 50 ml FCS, 5 ml Penicillin / Streptomycin).
- Nach dem Entfernen der 50-ml-Röhrchen aus der Zentrifuge beachten vier Schichten: ein Pellet aus roten Blutzellen in der Unterseite, die Paque, eine Schicht von Zellen, die weiße Blutzellen (einschließlich Lymphozyten) und des Plasmas enthält. Die weißen Blutzellschicht mit einer Pasteurpipette und Transfer in einem 50 ml Falcon-Röhrchen vorsichtig entfernen.
- Durch Zugabe von RPMI-1460 RT (bis zu 20 ml) und Zentrifugieren bei RT für 5 min bei 1.200 x g wasche die weißen Blutzellschicht. Resuspendieren der weißen Blutzellen in 1 ml der T-Zellmedium. In 5 ul der 1 ml Zellsuspension auf 250 & mgr; T-Zell-Medium in einem 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen geben und vorsichtig mischen nach oben und unten mit einer Pipette.
- In 25 ul verdünnted Zellsuspension in 25 ul 0,4% Trypanblau. Zugabe von 10 ul des Gemisches auf jeder Seite einer Standard Hämozytometer.
- Zeigen Hämozytometer auf einem Low-Power-Lichtmikroskop. Unter Verwendung eines 10X-Objektiv zählen die Anzahl der lebenden Zellen, die das Trypanblau ausgeschlossen sind und in der Mitte Platz von beiden Seiten des Hämozytometer vorhanden sind.
- Um die Zellkonzentration zu berechnen, multiplizieren den Durchschnitt der 2 Plätze 100 (Verdünnungsfaktor) und dann mehrfach um 10 4, die Anzahl der Zellen / ml zu erhalten.
- Einstellen der Endkonzentration von 0,5 x 10 6 Zellen / ml in T-Zellmedium. Hinzufügen einer Endkonzentration von 1 ug / ml jeder der bakteriellen Superanti Staphylokokken-Enterotoxin B (SEB) und das toxische Schocksyndrom Toxin 1 (TSST) zu den Zellen. Kultur für 72 Stunden (37 ° C und 5% CO 2), um die CD4 + T-Zellpopulation zu erweitern.
- Pellet-T-Zellen (1.200 xg, 5 min) und resuspendieren in 0,5 × 10 6 Zellen / ml in T-Zellmedium mit demZugabe von humanem IL-15 (20 ng / ml). Transfer-Lymphozyten zu einer T150-Kolben. Weiterhin geteilte Zellen zeigen / in voller mittel IL-15 alle 24-48 h nach Bedarf (basierend auf Medien Farbe, dh, wenn Medien dreht sich von rosa bis hellgelb) danach. Pflegen Sie die resultierenden Lymphozyten-Population für die bis zu 15 Tage.
HINWEIS: Mit dem Design, wird dieses Protokoll zu aktivieren und zu erweitern gezielt Teilmenge von CD4 + T-Zellen, die SEB und TSST reaktiv sind und dann fahren sie in Richtung einer Th1-ähnlichen Effektor / Memory-Phänotyp. Andere weiße Blutzellen nicht überleben und wachsen unter diesen Bedingungen, so daß für Schritt 1.10 die Zellen mindestens 95% CD4 + CD45RO + -T-Zellen 19 ist, wie sich leicht durch Durchflusszytometrie beurteilt werden. Falls gewünscht, kann eine weitere Reinigung leicht durch kommerziell erhältliche Antikörper / magnetische perlenbasierte positive oder negative Selektionssätze erzielt werden.
2. Starten primären humanen Endothelzellkultur
<ol>3. Allgemeine Splitting und Expansion von Endothelzellen
- Wachsen Zellen, um ~ 90-95 Konfluenz. Dies kann 2-5 Tage dauern. Zum Spalten,entfernen Medien und mit PBS spülen. Entfernen PBS und ersetzen Sie mit Mindestvolumen von frischem 1x Trypsin (0,5 ml für T25 oder 1,5 ml für T75). Vorsichtig schwenken, um alle Oberflächen mit Trypsin zu decken. Bei 37 ° C für ca. 5 min. Überwachen Sie die Ablösung der Zellen von der Platte mit einem Low-Power-Lichtmikroskop.
- Beim Großteil der Zellen erscheinen abgerundet oder freistehend, fügen 5 Volumen (dh gegenüber dem Trypsin Volumen aufgenommen) vorgewärmtes komplette EGM-2-Medium und sanft Pipette über die Oberfläche des Kolbens, um alle Zellen zu lösen.
- Zählen Endothelzellen mit einem Hämozytometer nach 1.6-1.7 beschrieben. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation (5 min, 1200 x g). Entfernen Sie den Überstand. Passen Konzentration auf 0,5 Mio. Zellen pro ml durch Zugabe von vorgewärmten komplette EGM-2 MV Medien.
- Übertragen Aliquots der Zellen an die entsprechende FN-beschichteten Schalen oder Flaschen für die Wartung. Vorsichtig schwenken und in den Inkubator. Ändern Sie die Medien innerhalb von 6-12 h der Plattierung. Medien shoULD etwa alle 48 Stunden danach verändert werden.
4. Endothelzellen Transfektion
HINWEIS: Primäre Endothelzellen sind refraktär Transfektion durch häufigste chemische und Elektroporation Methoden. Das unten beschriebene Kern Transfektion basierende Verfahren ermöglicht bei relativ hohen Transfektionseffizienz (~ 50-70%). Eine wirksame alternative Methode ist die Verwendung einer Infektion durch geeignete virale Vektoren (siehe Kommentare in der Material Tabelle).
- Vorbereitung T25 oder T75-Kolben (je nach Bedarf) von HLMVECs oder HDMVECs auf eine Enddichte von 90-95% confluency.Coat mit Fibronectin (FN) 20 ug / ml in PBS in sterilen Bedingungen entweder Mikroskop Kulturplatten, wie Delta-T-Platten (für Schritt 5) oder 12 mm kreisförmigen Deckgläser in einer Vertiefung einer 24-Well-Zellkulturplatte (für Schritt 6 platziert) mit, wie oben (2.1) beschrieben.
- 1 ml komplettes EGM-2 Nährmedien in Kultur Mikroskop platesor 0,5 ml zu jeder 24-Well-Platten und äquilibriereneinem befeuchteten 37 ° C / 5% CO 2 -Inkubator.
- Ernte und zählen Endothelzellen wie in den Schritten 3.1-3.3.Centrifuge das erforderliche Volumen von Zellen (0,5 Millionen Zellen pro Probe) bei 1.200 xg für 5 Minuten bei RT. Zellpellet vorsichtig in 100 ul RT Kern Transfektionslösung pro Probe.
- Kombinieren Sie 100 ul der Zellsuspension mit 1-5 & mgr; g DNA. Übertragen Sie Zell / DNA-Suspension in zertifizierten Küvette; Probe muss den Boden der Küvette luftblasenfrei abdecken.
HINWEIS: Die Konstrukte Targeting YFP oder DsRed an die Zellmembran (über die N-terminalen 20 Aminosäuren von Neuromodulin, die ein Signal für posttranslationale Palmitoylierung enthält) wurden allein (alone membran YFP oder membran DsRed allein) oder in Mischung mit einem Co-transfiziert zytoplasmatische Volumenmarker (zB Membran-YFP und DsRed löslich). Viele Permutationen von fluoreszierenden Protein-Marker kann verwendet werden. - Schließen Sie die Küvette mit dem Deckel. Setzen Sie die Küvette mitZell / DNA-Suspension in den Küvettenhalter des Elektroporator und gelten Elektroporation Programm S-005. Nehmen die Küvette aus dem Halter, sobald das Programm beendet ist.
- In ~ 500 ul des voräquilibriert Kulturmedien in die Küvette und entfernen Sie vorsichtig die Zellsuspension aus der Küvette mit den Kunststofftransferpipetten im Nuklear Transfektion Kit bereitgestellt.
- Für Experimente mit Mikroskop Kulturplatten zu partitionieren die Zellsuspension von einer Reaktions gleichmäßig zwischen zwei Schalen mit vorgewärmten Medien (Schritte von 4,2 bis 4,3). Für Experimente mit 24 gut / Platte, Partition einer Reaktions gleichmäßig zwischen 3 Brunnen.
- Inkubieren Sie die Zellen in einem befeuchteten 37 ° C / 5% CO 2 Inkubator und ändern Medien 4-6 h, und wieder bei 12 bis 16 h nach der Transfektion.
5. Live Cell Imaging and Analysis
- Vorbereiten Endothel
- Tag 0: Co-Transfektion von primären HLMVECs mit Membran-YFP und DsRed lösliche über eine nucleofection-Technologie, wie in Schritt 4 und Platte beschrieben, auf Live-Cell-Imaging-Kulturplatten.
- Tag 1: Medium durch frisches Medium, das IFN-γ (100 ng / ml) an MHC-II-Expression zu induzieren Ersetzen. Am Tag 2. Stimulieren transfizierten Zellen durch Zugabe von 20 ng / ml TNF-α an die vorhandenen Medien.
- Am Tag 3, Inkubation das Endothel mit 1 ug / ml jeder der bakteriellen Superantigene Staphylokokken-Enterotoxin B (SEB) und toxischen Schock-Syndrom-Toxin 1 (TSST) bei 37 ° C für 30-60 min unmittelbar vor den Experimenten. Lassen Sie diesen Schritt für "Ag" Kontrollbedingungen.
- Vorbereiten Lymphozyten
- Parallel zu Schritt 5.1.3 bereiten Puffer A (Phenolrot-frei HBSS) mit 20 mM Hepes, pH 7,4 und 0,5% v / v Humanserumalbumin und 37 vorgewärmt, ° C. Nehmen Sie eine Probe von kultivierten Lymphozyten und zu bestimmen, die Dichte durch Zählung mit einem Hämozytometer (Schritt 1,12 bis 1,17).
- Zentrifuge 2 Millionen Zellen pro Probe nach 1,200 × g für 5 min bei RT in einem 15 ml konischen Röhrchen. Aspirat Medien und vorsichtig resuspendieren Zellpellet in 2 ml Puffer A, so dass keine Zellklumpen bleiben.
- Entfernen Sie ein frisches Aliquot von Fura-2 Calcium-Farbstoff und resuspendieren in DMSO, um eine Stammkonzentration von 1 mM zu machen.
- Add 2 ul Fura-2-Stammlösung zu dem T-Zellsuspension (2 & mgr; M Endkonzentration) Das Röhrchen und unmittelbar durch Umschütteln des Rohres an eine gleichmäßige Dispersion des Farbstoffs sicherzustellen. Bei 37 ° C für 30 min.
- Zentrifuge nach Schritt 5.2.2. Saugen Sie Buffer-A und vorsichtig, aber gründlich resuspendieren Lymphozyten in 20-40 ml frisches Buffer-A.
- Live-Cell-Imaging-Setup und Akquisition
HINWEIS: Eine Vielzahl von Systemen kann für Live-Zell-Fluoreszenz-Bildgebung am aufrechten und inversen Lichtmikroskopen eingesetzt werden. Grundlegende Anforderungen umfassen eine Fluoreszenzlichtquelle und Filter, eine CCD-Kamera, motorisierte Filterschalt und Fensterläden, einen beheizten Bühne (oder Microscope-montierbar beheizten Kammer) und Software für die automatisierte Bildaufnahme. Für dieses Protokoll mit hoher numerischer Apertur, hoher Vergrößerung (dh 40X, 63X) Ölimmersionsobjektive sind erforderlich, um die notwendige räumliche Auflösung zu erreichen. Besondere Sorgfalt ist bei der Auswahl der geeigneten Fluoreszenzquelle und Linsen für Fura-2-basierte Kalzium-Imaging, da nicht alle mit den erforderlichen 340/380 nm Anregungswellenlängen sind kompatibel gemacht werden. Ein alternativer Ansatz (kompatibel mit Standard-grünen und roten Fluoreszenzfiltersätze) können mit nicht ratiomentic Calcium-sensitiven Farbstoffen verwendet werden (zB Fluo-4, Rhod-3), die allerdings nicht genau zu quantifizieren, Calcium-Fluss und nur eine relative bieten / quantitative Auslesen.- Schalten Sie Mikroskopsystem (PC für den Betrieb, Mikroskop, CCD-Kamera, Filterrad und Xenon-Lampe).
- Öffnen Sie die Software bezeichnet.
- Set up Mikroskop / Software für die automatische Mehrkanal-Zeitraffer-Bildgebung. Gehören sequentielle Akquisition der adDifferenzweg Interferenzkontrast (DIC), Standard-grüne Fluoreszenz, Standard rot fluoreszieren und Standard 340 und 380 nm Anregungs Fura-2 Bildern. Stellen Sie das Intervall für den Erwerb für 10-30 sec und einer Gesamtdauer von ~ 20-60 min.
- Stellen Sie Belichtungszeiten für Fura-2-Bildgebung.
- Add frischen Ziel Öl und montieren ein Mikroskop Schale mit nur 0,5 ml Puffer-A auf die Heizstufe Adapter und schalten Sie sofort auf, um bis 37 ins Gleichgewicht ° C (dauert ~ 2-3 min).
- In Ruhe Fura2 belasteten Lymphozyten an den montiert Mikroskop Gericht Kammer unter Verwendung einer 20 ul-Pipette.
- Schalten Sie Hellfeldabbildung. Wählen Sie den Lichtweg zu den Okularen. Verwenden Sie den Grobtriebknopf auf objektive in Kontakt mit Boden der miscoscope Gericht zu bringen. Verwenden Sie das Okular und der Feinfokusknopf, um auf die T-Zellen am Boden der Schale angesiedelt konzentrieren.
- Verwenden Sie die XY-Stufe steuert, um ein Feld mit mindestens 10 Zellen auswählen. Vermeidenüberfüllten Feldern und Zellklumpen, da diese Bildartefakte erstellen.
- Wechsel von Hellfeld-Lichtquelle Leuchtstofflampe. Schalten von Okular-Bildgebung zur CCD-Kamera. Stellen Erfassungsparameter (zB Belichtungszeit, die Detektorverstärkung und Binning). Verwendung der Software acquire ruht Fura2-340 und Fura2-380 Bilder (beginnend mit gleicher Belichtungszeit für jeden, in der Regel im Bereich von ~ 200-1000 ms).
- Verwenden Sie die in Schritt 5.4.1, um die Fura2-340 / Fura2-380 für jeden Lymphozyten berechnen beschriebenen Methoden. Führen wiederholten Iterationen der Einstellung der Fura2-340 und Fura2-380 Belichtungszeiten, Erfassen von Bildern und Berechnen von Verhältnissen, bis die Durchschnittswerte sind in der Nähe 1.
- Stellen Sie Belichtungszeiten für mem-YFP und DsRed.
- Ersetzen Sie das Mikroskop Gericht in Schritt 5.3.3.1 mit einem miscroscope Gericht verwendet transfiziert, aktiviert und der SAG behandelt (oder unbehandelt, Kontrolle) HLMVECs oder HDMVECs aus Zellkulturbrutschrank (Schritte 4.5.1). Verwenden Sie eine Einweg-Transferpipette schnell Medien zu entfernen, spülen einmal durch Zugabe von ~ 1 ml vorgewärmten Puffer-A. Saugen Sie und fügen Sie 0,5 ml Puffer-A.
- Identifizieren Sie Bereiche, in denen hell fluoreszierende positive Transfektanten Endothelzellen vorhanden sind und scheinen gesund mit gut ausgebildeten interzellulären Verbindungen.
- Passen Erfassungsparameter (zB Belichtungszeit, die Detektorverstärkung und Binning) für mem-YFP und DsRed. Achten Sie darauf, dass mittlere Fluoreszenzsignalintensität in jedem Kanal liegt zwischen 25% und 75% der Dynamikbereich des Detektors.
- Stellen Sie Belichtungszeiten für Fura-2-Bildgebung.
- Führen Sie Live-Cell-Imaging-Experiment.
- Verwenden Sie automatisierte Software zur Bildaufnahme beginnen und erfassen mehrere Intervalle der Bilder auf die Grundlinie zu etablieren.
- Während der Erfassung anzuwenden ~ 5 ul konzentrierter Fura-2-beladenen Lymphocyten (aus Stufe 5.2) auf der Mitte der Bildgebungsfeldmikroskop Schale durch Einführen der Spitze einer kleinen Volumen (P-5oder P-20) der Pipette in den Medien in der Nähe der Mitte der Objektiv und Auswerfen langsam.
- Als Lymphozyten in das Bildfeld zu regeln, Feineinstellungen in den Fokus, um sicherzustellen, dass die T-Zell-Endothel Zellschnittstelle (immunologischen Synapsen) sind in der Brennebene gehalten. Mit 40 und 63X Ziel, ~ 10-20 Zellen pro Feld sind optimal. Wenn weniger Zellen in der Bildfeld wiederholen Sie Schritt 5.3.4.2 beobachtet.
- Nachdem der gewünschte Beobachtungsintervall von Experiment traten weiterhin Bildgebung und sofort pipettieren Ionomycin direkt in den miscoscope Schale (unter Verwendung der Technik, wie in 5.3.4.2) zu einer Endkonzentration von 2 & mgr; M, um eine maximale Calciumfluss / Fura-2 Signalisierungssignal zu induzieren (dh , ein Mittel zur Kalibrierung finden Sie unter Analysis 5.4.).
- Als Alternative zu den gewünschten Beobachtungsintervall des Versuchs 5.3.4.4after wird konkurrierten, sofort saugen Sie den Buffer-A und ersetzen Sie es mit 0,5 ml Fixierungslösung (3,7% Formaldehyd in PBS) für 5 min beiRT, gefolgt von dreimaligem Spülen mit PBS. Dann fahren Sie mit Schritt 6.
- Die Analyse der Bildgebung lebender Zellen
HINWEIS: Nach der Speicherung von Dateien übernommen werden, können sie direkt analysiert oder mit einer Vielzahl von Off-line-Bildanalyse-Software-Anwendungen zur Analyse exportiert werden. ImageJ ist ein besonders wertvolles, sehr vielseitiges Paket, das frei verfügbar und kompatibel mit fast jedem Erfassungssoftware-Paket ist. Die Konstruktion der in den Schritten 5.1-5.3 beschriebenen Abbildungsexperimente mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung Dynamik der Wechselwirkungen zwischen Lymphocyten und Endothelzellen APC in Abwesenheit und Gegenwart von kognaten SAg ergeben. Nahezu grenzenlose Analysen möglich sind, wenn es um Bilddaten von zellulären morphometrische / Signaldynamik. Die in diesem Protokoll beschriebenen spezifischen Ziele sind koordinativ quantifizieren Lymphozytenmigration und Signalgebung (dh die Kinetik und die Höhe der intrazellulären Calcium-Flux) sowie dynamischeal ändert in der immunologischen Synapse Architektur mit Schwerpunkt auf spezifischen Merkmalen (dh ILPs / Podo-Drucke). Die folgenden sind Beispiele für separaten Standard-und Nicht-Standard (dh, die speziell für diesen Experimenten / Fragen entwickelt) analysiert.- Messen Sie Lymphozyten Calciumfluss
- Wählen Sie die anfängliche Fura2-340 (340 nm EX-510 nm EM) und Fura2-380 (380 nm EX-510 nm EM) Bilder, die vor der Zugabe der Lymphozyten erworben wurden. Verwenden Sie diese als Hintergrundbildern und subtrahieren sie von der alle Bilder in der Zeitreihe für den jeweiligen Kanal digital.
- Für jeden Zeitpunkt zu erstellen einen digitalen Verhältnis Bild des Hintergrunds-subtrahiert Fura2-340 und den Hintergrund-subtrahierten Fura2-380 Bilder (dh 340 nm EX-510 nm EM-Hintergrund / 380 nm EX-510 nm EM-Hintergrund).
- Wählen Sie die entsprechende Software-Zeichenwerkzeug. Klicken Sie auf den Bildschirm, um einen kreisförmigen Bereich von i zu ziehennterest (ROI) um jede Lymphozyten. Diese werden ein Pixel gemittelten Verhältniswert für jede Lymphozyten und Zeitrahmen zu erzeugen.
- Zeichnen Sie die berechnete Verhältnis als eine Funktion der Zeit unter Verwendung eines geeigneten Software-Anwendung (zB Tabellenkalkulation). Berechnen gemittelt Calciumfluss für das Experiment durch Summieren der Verhältniswerte aller Lymphozyten pro Feld und Dividieren dieses Wertes durch die Gesamtzahl der Lymphozyten für jeden Zeitpunkt
- Zuführen lympocyte Migrations Tracking-Analyse.
- Analysieren Zelle T-Zell-Migration unter Verwendung eines geeigneten Zell Tracking-Software-Anwendung (zB ImageJ) mit Hilfe des DIC-Kanal von jedem Video. Mit ImageJ Handy-Tracking-Plugin, identifizieren in jedem Rahmen des Schwerpunkts jeder Zelle manuell durch Anklicken in jeder Vollbildverfahren.
- Mit den daraus resultierenden Serien xy-Koordinaten (dh Spuren der Migrationspfade), um die mittlere Geschwindigkeit (Gesamtabstand migriert / Gesamtintervall o berechnenf Imaging) und die Tortuosität (Gesamtabstand migriert / die lineare End-zu-End-Abstand zwischen dem Zellenposition in der ersten und letzten Bild).
- Cross-Korrelation dieser Parameter mit den Calcium-Fluss (5.4.1) Dynamik auf einer Zelle-für-Zelle-Basis.
- Beurteilen Sie die Podo-print / ILP-Dichte innerhalb des IS
- Zählen Gesamtzahl der ILP in jedem T-Zelle gebildeten definierten Intervallen (zB 5 Minuten nach der Zugabe von T-Zellen). Diese können diskrete Mikrometermaßstab fluoreszierende Membran-YFP Ringe, die co-lokalisieren mit dunklen Ringen in zytoplasmatischen DsRed auf der endothelialen APC an einer Stelle Lymphozytenadhäsion identifiziert werden.
- Kreuzkorrelation der resultierenden 'ILP Indizes' mit Calciumflusses (5.4.1) Dynamik auf einer Zelle-für-Zelle-Basis.
- Messen Sie den Podo-print / ILP Lebenszeiten.
- Für jede Podo-print / ILP in einem bestimmten IS berechnet seinen Lebzeiten als der letzte Zeitpunkt, zu dem ein ILP zu sehen war - dem Zeitpunkt, wenn das Podo-print / ILP first erschienen. Durchschnittliche ILP Lebenszeiten sowohl pro IS.
- Quer korrelieren diese Lebensdauern mit Calciumflusses (5.4.1) Dynamik auf einer Zelle-für-Zelle-Basis.
- Beurteilen Sie die zeitliche Beziehung zwischen Erstausbildung ILP Bildung und Calciumfluss.
- Für jede Lymphozyten identifizieren den Zeitpunkt (Frame), bei dem Calcium ersten steigt über der Grundlinie 19.
- Für jede Lymphozyten identifizieren den Zeitpunkt, zu dem die erste Podo-print / ILP angezeigt.
- Für jede Lymphozyten-Berechnung ein "Offset-Zeit 'durch Subtraktion der Anfangscalciumfluss Zeitpunkt von der des ursprünglichen Podo-print / ILP. Der Mittelwert der Werte für alle Lymphozyten in einem Feld. Positive Werte zeigen die ILP Bildung vorausgeht Calciumfluss während negative Zahlen zeigen das Gegenteil.
HINWEIS: Diese Experimente können leicht unter physiologisch relevanten laminare Scherströmung mit im Handel erhältlichen Parallelwandströmung Bildgebung Kammern durchgeführt werden, wie beschrieben, 19.
- Messen Sie Lymphozyten Calciumfluss
6. Fest Cell Imaging und Analyse
- Fixendpunkt T-Zell-Endothel ist die Bildung und Färbung
- Vorbereitung T-Zellen, wie in 1 beschrieben, vorbereitet Endothelzellen (- / + SAg), wie in Schritt 5.1 (Transfektion, wird Schritt 5.1.1 optional). Nehmen Sie eine Probe von kultivierten Lymphozyten und zu bestimmen, die Dichte durch Zählung mit einem Hämozytometer (Abschnitt 1).
- Übertragen einer Lymphozytenkulturvolumens in Höhe von mindestens 3 x 10 5 Lymphozyten / Probe in ein 15 ml konisches Röhrchen und Zentrifugieren bei 200 × g für 3 min. Entfernen des Überstandes und Resuspendieren der Lymphozytenpellet in Puffer A (Schritt 5.2.1) Konzentration von 6 x 10 5 Lymphozyten / ml.
- Entfernen Sie die Endothelzellen aus dem Zellkulturbrutschrank und (fortfahren einer Probe zu einem Zeitpunkt) sukzessive absaugen Medien und ersetzen mit 0,5 ml Lymphozytensuspension (3 x 10 5 Lymphozyten / Probe), und ersetzen Sie bis 37 ° C incubator.
- Nach entsprechender Inkubationszeit, oben erwähnt, absaugen Medium aus den Vertiefungen ein und gebe ausreichend Fixationslösung (3,7% Formaldehyd in PBS), um die Probe vollständig zu bedecken (zB in 24-Well-Platte ~ 300-500 ul). Inkubieren bei Raumtemperatur für 5-10 Minuten.
- Spülen Probe 3-mal mit PBS. Durch Zugabe von primären Antikörper für 60 min bei RT Fleck (siehe Liste). Wenn der primäre Antikörper an ein intrazelluläres Protein gerichtet ist, muss eine zusätzliche Permeabilisierung Schritt durch Zugabe von ausreichend Permeabilisierung Lösung (0,01% Triton X-100 in PBS), um die Probe für 1 min bei RT vollständig bedecken geführt werden. Spülen Probe 3-mal mit PBS. In geeignete Sekundärantikörper (in einigen Fällen gleichzeitig fluoreszierende Phalloidin) für 60 min bei RT.
- Montieren Sie den kreisförmigen Deckglas auf einem Bildträger. Fixendpunkt T-Zell-Endothel ist die Bildung und Färbung. Um Abbildungs Stelle beginnen die Abbildungsschieber enthaltenden Proben auf dem Mikroskoptisch und wählen Sie das 63X ÖlObjektiv. Bewerben frischen Immersionsöl.
- Verwenden Sie das Hellfeld-Bildaufnahmemodus und Augenlinsen, um die Brennebene zu lokalisieren. Wechseln Sie zu Epifluoreszenz und prüfen Probe über den Augenlinsen. Wählen Sie ein Feld von Interesse. Wechseln Sie in den Laser-Scanning-Modus.
- Verwendung der Fast-Scan-Modus und arbeiten im weitesten Bereich können einzeln Laserleistung und die Verstärkung jedes Kanals einzustellen, um das Signal, so dass im Idealfall erreicht der bestimmten Signalintensität zu optimieren mindestens ca. 25% und nicht mehr als 75% des dynamischen Bereichs der Detektoren.
- Manuellen Fokus steuert, schnell durch die Z-Achse zu scannen und identifizieren die oberen und unteren Grenzen der Unterteilung (in der Regel sämtliche Informationen innerhalb einer Dicke von ~ 15 & mgr; m enthalten sein). Wählen Sie die Z-Achsen-Schnittdicke im Bereich von ~ 0,2 bis 1,0 & mgr; m.
- Schließlich Zoom / beschneiden Sie das Bildfeld auf den spezifischen Bereich von Interesse und Verhalten Scan. Zusätzlich dazu, dass sehr helle und spezifische Fluoreszenz signal in der Probe, den Erwerb hochauflösende 3D-Bildgebung erfordert Iterationen des Scannens und der Anpassungen an Erfassungsparameter. Das Ziel ist, eine maximale xy und z-Achsen-Auflösung, ohne nennenswerte Photobleaching erhalten.
- Qualitative Analyse der Topologie der Topologie des 3D wird durch Leiten digitaler 3D-Rekonstruktion der resultierenden optischen Sektionen durch eine geeignete Anwendungssoftware (zB Bild J). Durch ähnliche Anwendungen quantitativ zu erfassen Fluoreszenzsignalverteilung (zB Pearson-Co-Lokalisation und korrelative Fluoreszenzintensität Zeilenanalyse und orthogonal Leser).
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Representative Results
Eine neuartige Abbildungsansatz mit Endothelzellen und Kombinieren der Auflösung Vorteile der planaren Lipiddoppelschicht-Modell mit der physiologischen Komplexität und Verformbarkeit professionelle APCs wurde (Figur 1) entwickelt. 2 stellt Beispiele von typischen Migration, Calciumflusses und topologische Dynamik bei dieser beobachtete Ansatz. In Abwesenheit der SAG auf Endothel SAG-spezifische CD4 + Th1-Lymphozyten schnell verbreiten, zu polarisieren und lateral wandern über den Endotheloberfläche (2A) ohne Fluss Calcium (nicht dargestellt). Innerhalb von ~ 5-10 Minuten diese Lymphozyten initiieren Transmigration durch das Endothel. In Gegenwart von SAg Laden auf Endothel, Lymphozyten symmetrisch mit einem "Spiegelei" Topologie verteilt einleiten aufrechterhalten (dh 30-60 min) die intrazelluläre Calcium-Fluss (2B; Film 1), während welcher Zeit sie aufweisenwenig oder keine Migration (Abbildung 2C).
Abbildung 2. lebenden Zellen Analyse der T-Zell-Aktivierung und Migration und immunologischen Synapse Topologie Endothelial APCs. (A) Panels zeigen ein Beispiel für Zeitreihen Bildgebung von T-Zell-Migration auf Endothel in Abwesenheit der SAG. Obere Feld zeigt DIC Bilder. Die Anfangsposition des wandernden T-Zelle wird durch die rote gestrichelte Linie gekennzeichnet. Untere Feld zeigt Einstülpungen auf das Endothel von der Migration T-Zellen gebildet. Pfeile zeigen die Bildung von transienten Ringe (~ 0,5-1 um Durchmesser) der Membran-YFP-Fluoreszenz als Ergebnis von T-Zellgeneration 'invadosome artigen Vorsprünge "(ILP) gegen die endotheliale APC Oberfläche (siehe D) gebildet wird. (B) zeigt ein Beispiel für eine ähnliche Serie in Gegenwart von SAg belasteten Endothel (links, siehe auchentsprechende Film 1) und quantitative Spuren der dynamischen Änderungen in der Calciumspiegel (rechts). Pfeile zeigt anfängliche ILPs Formation, die mit der Einleitung von Calciumflusses (i) korreliert und anschließende Stabilisierung mehrerer ILPs, die mit hoher Calciumflusses (ii) korreliert. (C) Versuchen, wie in A und B wurden einer Tracking Zellanalyse. DIC Bilder links zeigen repräsentative T-Zell-Migrationspfade über die Laufzeit von 10 min (rot Spuren). Grafik rechts zeigt die berechneten Wanderungsgeschwindigkeit in Abwesenheit und Anwesenheit der SAG. (D) Dynamische Analyse der immunologischen Synapse Topologie (ab 19 modifiziert). Schematische (i) veranschaulicht eine empfindliche Endothelzellen / APC-Topologie Reportersystem ", bestehend aus Membran-Targeting-YFP und löslichen cytosolischen RFP. Actin-vermittelte ILP, die in die Oberfläche von Endothelzellen ragen erzeugen zylinderförmigen Einstülpungen (eine Art der zellulären Fußspur, bezeichnet als ein "podo-print") giving Vorrücken in abgeknickt Membran, die als Ringe membran YFP-Fluoreszenz angezeigt (dh die Wände des Zylinders angesehen en face). Cytosol Vertreibung und Ausgrenzung auf dieser Loci erscheinen als dunkle Kreise der cytosolischen RFP. DIC und Fluoreszenzbilder in (ii) zeigen ein Beispiel für eine solche Analyse in Gegenwart von SAg (siehe auch entsprechende Film 2). Eine einzelne anfängliche Podo-print / ILP entwickelt sich zu einer Reihe von> 20 stabilisiert ILPs über 15 min. Blue-Box bei 15 min (iii) zeigt eine hochauflösende Ansicht eines einzelnen Podo-print / ILP wobei ein Ring aus Membran-YFP überschneidet sich mit einer Region ausgeschlossen cytosolische RFP. Eine gestrichelte Linie (iv) zeigt eine quantitative Linienrasteranalyse der Fluoreszenzintensitäten. Maßstabsbalken = 5 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Wie bereits festgestellt, Lymphozyten aktivEly Sonde die Oberfläche des Endothels durch Verlängerung Actin und HS1 (a Cortactin Homolog) -angereichertem und WASp- und src-abhängige Vorsprünge bezeichnet 'invadosome artigen Vorsprüngen; (ILPs; jeweils ~ 0,5-1 um Tiefe Durchmesser) 27,28. Transfektion von Membran-bezogene Fluoreszenzprotein (FP) wurde gezeigt, daß hochempfindliche Reporter für subzelluläre topologischen Dynamik an Zell-Zell-Oberflächen bereitzustellen. Auf diese Weise wurde gezeigt, dass die hellen Ringen von fluoreszierenden Membran-FP weisen auf Membran während der T-Zell-Endothel Interaktion als Ergebnis der T-Zell-ILPs Vorsprünge Biegen. Hier ist gezeigt, und in früheren Studien 19,20, daß, während kleine Cluster von ILPs Form und Umsatz rasch (dh Lebensdauern von ca. 10-30 sec) während der seitlichen Wanderung von T-Zellen auf Endothel in Abwesenheit von SAg (2A ), werden sie zu hoch stabilisierte (dh Lebensdauern von ca. 30 min) und reichern sich in dichte Arrays in Gegenwartder SAG (2B). Darüber hinaus Analyse der ILPs und Kalzium Einleitung Kinetik ('Offset time') zeigen, dass ILPs voran Calcium-Signal, was darauf hindeutet, sie in der MHC-II / Ag Erkennungsprozess (Abbildung 2Bii) zu unterstützen. Zusätzlich stabilisiert ILPs Arrays bilden Einklang mit maximaler Calciumfluss (Abbildung 2Bii). Die Idee, dass die Ringe der Membran-Fluoreszenz entsprechen den T-Zell-Vorsprünge Fahr diskreten Einstülpung Spots endotheliale APCs, wird durch den Nachweis, dass diese Ringe in allen Fällen korreliert räumlich und kinetisch mit Zonen von Vertriebenen / ausgeschlossen Zytoplasma (wie von löslichen DsRed gemeldet bestätigt; 2D und Movie 2).
Abbildung 3 zeigt Beispiele von festen Endpunkt konfokalen bildgebenden Untersuchungen. Nach 10 min der Co-Inkubation in Gegenwart von sAg ISs zwischen T-Zellen und Endothel-APCs wurden gebildet durch Fixierung abgebildet wird, immuno-Fluoreszenzfärbung und der konfokalen Mikroskopie. Diese Studien liefern Analyse der subzelluläre Verteilung Dynamik der kritischen Moleküle und Signalaktivitäten innerhalb ISs insbesondere Bezug auf ILPs. Insbesondere Zytoskelett / Zytoskelett-Regler (Actin, HS1; 3A), Antigenpräsentation / Erkennung (CD3 / MHC-II; 3B) Haftung (ICAM-1, LFA-1, Talin; 3C) und antigenen Signalisierung (PKC Q; 3D) gesehen werden, um in Podo-Drucke / ILP zusammen angereichert werden. Digitale Rekonstruktion konfokalen Serienschnitt z-Stapeln enthält ergänzende Beweise wie in 2D gezeigt, dass die T-Zell-Endothelzellen Endothelzellen ist, eine diskrete 3-dimensionalen Architektur durch T-Zell ILP im APC-Oberfläche hervor unterbrochen (Fig 3Aii, Ci, iii, D). (Abbildung 3Civ).
Abbildung 3. Festprobenanalyse von Molecular Dynamics Verteilung der T-Zell-Endothelzellen immunologischen Synapsen. Die Lymphozyten wurden auf SAg belasteten Endothel für 30 min inkubiert und fixiert und gefärbt. In angegebene Platten Endothelzellen wurden pre-transfiziert, um Membran-YFP oder -DsRed auszudrücken. (A) Repräsentative Bildgebung zeigen Aktin (i) und HS1 (a Cortactin Homolog, ii) an der Peripherie der immunologischen Synapse in der Mikro-Cluster, die mit der Mitte der endothelialen fluoreszierenden Ringe membran YFP (dh "korrelieren mit Co angereicherten Podo-prints "; siehe Abbildung 2D) bestätigt wird, dass T-Zellen sind für ILPs Aussehen Podo-Drucke verantwortlich. Eine Seitenansicht (90º Projection ii.) Zeigt, daß ILPs stellen 3-dimensionalen Vorsprung in der z-Abbildungsebene (von 19 modifiziert). (B) Repräsentative Anreicherung von T-Zell-TCR (i) und endothElial MHC-II-(ii) innerhalb der immunologischen Synapse, zeigen diskrete subzellulären Partitionierung der ILP / Podo-Drucke. (C) (i) Vertreter Co-Anreicherung von ICAM-1 und LFA-1 in Podo-Prints und ILP bzw. des IS. (i) eine 3-D digitale Rekonstruktion konfokale Schnitte des gedreht 60 (obere Tafeln) und 90 ° (orthogonal Ansicht; untere Tafeln) °. (ii) zeigt eine vergrößerte Ansicht des IS en face. (iii) Zeigt eine orthogonale Querschnittsansicht des boxed Region in (ii) (ab 19 modifiziert). (iv) Repräsentative Co-Anreicherung von Talin (ein integtin / Aktin-Linker-Protein) und Aktin in IS ILPs. (D) Repräsentative Co-Anreicherung des TCR-Signalmolekül PKC-Q mit Aktin in IS ILPs. Jedes Panel zeigt eine en face-Ansicht (links unten) und zwei verschiedenen orthogonalen Ansichten (90 ° Projektion). Die weit nach links und rechts Platten verwenden, sind Wiederholungen ihrer, jeweils benachbarten Platten, projiziert mit einem Regenbogen fluorescence Intensitätsskala (von 19 modifiziert). Maßstabsbalken = 5 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Film 1:. Lebenden Zellen Dynamic Imaging von T-Zell-Calcium-Signale und immunologischen Synapse Topologie Zeitraffer-Live-Cell-Imaging von Fura2 belasteten CD4 + Th1-Lymphozyten-Interaktion mit Endothelzellen exprimieren membran YFP und mit der SAG geladen, entsprechend 2B. Linke Tafel zeigt die intrazelluläre Kalziumspiegel (rainbow: kühle Farben, geringe Calcium; warmen Farben hohe Calcium) in T-Zellen. Rechte Tafel gezeigten Membran-YFP-Fluoreszenz auf der Oberfläche der endothelialen APC. Lymphozyten werden gesehen zu initiieren verbreiten und ILP Bildung (wie über die Leuchtstoffringe in mem-YFP-Kanal zu sehen, das heißt, "Podo-prints"; siehe Abbildung 2Bi), gefolgt von Induktion einer nachhaltigen (30-60 min) intrazellulären Calciumfluss, was im Einklang mit Bildung von peripheren Anordnungen von ILPs / Podo-Drucke analog TCR / Aktin tritt 'signalisiert Mikro geclustert', die in planaren Doppelschicht APC-Modelle (siehe Abbildung 2Bii) zu sehen sind. Das Intervall zwischen den Frames 20 sec. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen.
Movie 2: Phasen-Cell Dynamic Imaging der immunologischen Synapse Topologie vieinem fluoreszierenden Reporter in Endothelial APCs. Zeitraffer-Live-Cell-Imaging von CD4 + Th1-Lymphozyten (DIC, links) die Interaktion mit Endothel Coexpression Membran-YFP (grün) und löslichen cytosolischen DsRed (rot) und mit der SAG geladen wird, entspricht, 2D. Rechte Bild zeigt Zusammenführung von DIC, Membran und Cytoplasma-Signalisierung. Die kombinierten Signale der Membran und Zytoplasma Fluoreszenz sensibel berichten Bildung und Umbau von mehreren ~ 0,2-1 & mgr; m-Skala Oberfläche Einstülpungen (Podo-Drucke), die von T-Zell-Arrays Sondieren mit ILP Vorsprünge führen. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen.
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Discussion
Insgesamt ist dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Untersuchung Endothelzellen als i) under physiologischen APCs und ii) als eine neue Art von "planare Zell APC-Modell". In Bezug auf die frühere, wurde es zunehmend klar, daß nicht-hämatopoetischen peripheren (oder "Stromazellen") APCs spielen kritische, nicht redundanten Rollen (dh gegenüber hämatopoetischen APCs) bei der Gestaltung der adaptiven Immunantwort 16-18. Unter solchen 'semi-professionellen "APCs, vaskulären und lymphatischen Endothelzellen (die in beträchtlichem Ausmaß zahlenmäßig überlegen professionelle APCs) gehören zu den besten geschätzt 16-18. Die Einzelheiten der Signalereignisse und ihre immunologischen Synapsen verbunden bleiben jedoch weitgehend unerforscht. Die hier beschriebenen Verfahren bilden die Grundlage für die Förderung der Verständigung in diesem aufstrebenden Bereich. B. Anwendung dieser Ansätze zur Untersuchung der ISS an Endothelzellen aus verschiedenen Gewebe, die bekanntermaßen unterschiedliche adaptiv weisen gebildete immunologische Funktion (zB Leber und lymphatischen Endothelien) kann besonders aufschlussreich sein.
Deutlich, hilft diese Methode, um die Lücke zwischen den professionellen APCs und künstliche APC-Substrat-Modelle, um die Fähigkeit, grundlegende Mechanismen der adaptiven Immunantwort zu verhören zu verbessern brücken. In der Erwägung, ebenen APC Substrate (dh Lipid-Doppelschichten, antikörperbeschichteten Glas) sorgen für eine optimale Bildgebung, sind solche Modelle von Natur aus begrenzt (die für viele kritische Einblicke 7,11-14 geführt hat). Alternativ Einzelheiten physiologischen Zell-Zell-Scanning Dynamik waren bislang tief von Orientierungsbezogene Abbildungsprobleme 8-10 verdeckt. Die Imaging-Funktionen in der aktuellen Ansatz vorgesehen überwinden diese Hürde eindeutig zeigen, sonst nicht nachweisbar dreidimensionale subzellulären Architektur und schnellen Umbau eines physiologischen APC-T-Zell-Schnittstelle. Diese bieten Potenzial für neues Verständnis von antigenen signalinG.
Beispielsweise die Erkenntnis, daß T-Zellen bilden ILPs mit TCR, Actin und Signalmolekülen (zB 2D, Bild 3) angereichert ist, nahe, dass diese wahrscheinlich die über physiologischen 3-dimensionalen Gegenstücke zu der planaren TCR Signalisierungsmikroclustern beobachtet on künstliche APC Substrate 6,7,12-14,29-31. Dies bedeutet, dass unter physiologischen Einstellungen Lymphozyten können ILPs als diskrete subzellulären '3D-Reaktionsvolumina "mit" signalosome' ähnlichen Eigenschaften, die zu verstärken, zu beschäftigen und zu erhalten Signalisierung durch die Konzentration wichtiger Moleküle / Aktivitäten 32,33. Zusätzlich kann die Anwesenheit signifikanter biomechanischen Eingänge (dh Zell-Zell-Kraftangriff) auf Sehenswürdigkeiten, wenn ILP Vorsprung gegen die APC kann von der Abbildungs entnehmen. Dies ist nicht-triviale, wie mechanische Kräfte werden immer mehr als wichtige Vermittler von antigenen Signal angesehen, während, wie genau solche Kräfte sindmanifestierten bleibt unklar 14,34-37.
Die Gesamt Relevanz dieses Modells als eine vernünftige Ersatz für professionelle APCs durch unsere direkte Demonstration unterstützt, dass ähnliche ILP Arrays könnte in Synapsen auf ECs und DCs (und in geringerem Maße B-Zellen) gebildet wird, wenn analoger Imaging Ansätze beschäftigt waren zu sehen ist (zB , Verwendung der gleichen Fluoreszenzträgern und Kontrolle der plan Orientierungsebene 19). Dennoch ist zu berücksichtigen, dass die relativen biomechanischen Eigenschaften der EG gegenüber professionellen APC Membranoberflächen unbekannt sind und dass die Unterschiede in diesem Parameter können Details von IS-Topologie und antigene Reaktionen beeinflussen.
Der Schlüssel zu der hier beschriebenen Vorgehensweise ist stark im Zusammenhang mit seiner Entschließung Vorteile. Dies wiederum ist stark verbunden mit der Stärke des Fluoreszenzsignals. Somit ist es wichtig, besondere Aufmerksamkeit bei der Optimierung der Transfektion und Färbung der fluores bezahlencent Reporter und Abbildungsparameter / Technik (zB Belichtungszeit, Fokus, etc ...). In Bezug auf die frühere, das Protokoll für Lebendzell-Studien, die hier beschrieben sind, sind beschränkt auf die Transfektion von generischen Membran und zytoplasmatischen Marker, die topologischen Veränderungen an der T-Zell-APC-Schnittstelle in Echtzeit (beispielsweise 2, Filme 1 mitteilen, 2). Darüber hinaus dieses Protokoll kann leicht für komplexere Analyse durch gleichzeitig die Einführung / Imaging weiteren Reportern im Endothel (modifiziert werden, beispielsweise fluoreszierende Protein-markierten MHCI / II und Haftung, kostimulatorischen und Co-inhibitorische Moleküle und Biosensoren für die Signalisierung und biomechanischen Dynamik). Leider jedoch ist eine allgemeine Beschränkung, dass Lymphozyten sind notorisch schwierig zu transfizieren. Dies schließt eine bequeme Verwendung von fluoreszierenden Proteinen (zB um TCR getaggt, PKC-Q, etc.) in T-Zellen für die lebenden Zellen.
Währenddas aktuelle Protokoll beinhaltet die Aktivierung des menschlichen Effektor / Memory CD4 + Th1-Typ-Lymphozyten durch SAg (ein weit verbreitetes Modell), existieren viel breitere Möglichkeiten. Wie zuvor gezeigt, 19,20 ist dieser Ansatz leicht an eine breite Palette von anderen Einstellungen, wie zB Antworten anderer CD4 + Untergruppen und die Aktivierung von CD8 + Lymphozyten-Reaktionen Töten. Durch Isolierung von Lymphozyten und Endothelzellen aus bestehenden TCR-transgenen Stämme ist dieses Verfahren auch leicht auf Antworten auf bestimmte Peptidantigene 19,20 studieren. Schließlich wird der aktuelle Ansatz zur Untersuchung von Effektor / Memory T-Zellen beschränkt. Jedoch Transfektion der Endothelzellen mit den wesentlichen kostimulatorischen Molekülen (CD80 / 86, die üblicherweise nicht der Endothel exprimiert) könnte für das Studium von naiven Zellen Priming Dynamik in diesem Modell zu ermöglichen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer stretch latex free tourniquet | BD Biosciences | 367203 | |
| BD alcohol swabs | BD Biosciences | 326895 | |
| BD Vacutainer Safety-Lok | BD Biosciences | 367861 | K2 EDTA |
| BD Vacutainer Push Button Blood Collection Set | BD Biosciences | 367335 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R8758-1L | |
| Ficoll-Paque | Sigma-Aldrich | GE17-1440-02 | Bring to RT before use |
| FCS-Optima | Atlanta Biologics | s12450 | Heat inactivated |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | |
| staphylococcal enterotoxin B | Toxin Technology | BT202RED | Stock solution 1mg/ml in PBS |
| toxic shock syndrome toxin 1 | Toxin Technology | TT606RED | Stock solution 1mg/ml in PBS |
| human IL-15 | R&D Systems | 247-IL-025 | Stock solution 50ug/ml in PBS |
| PBS | Life Technologies | 10010-049 | |
| Fibronectin | Life Technologies | 33016-015 | Stock solution 1mg/ml in H20 |
| HMVEC-d Ad-Dermal MV Endo Cells | Lonza | CC-2543 | Other Human Microvascular ECs can be used, i.e. HLMVECs |
| EGM-2 MV bullet kit | Lonza | CC-3202 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T-4174 | Stock solution 10x, dilute in PBS |
| amaxa-HMVEC-L Nucleofector Kit | Lonza | vpb1003 | Required Kit for step 4 |
| IFN-g | Sigma-Aldrich | I3265 | Stock solution 1mg/ml in H20 |
| TNF-alpha 10ug, human | Life Technologies | PHC3015 | Stock solution 1mg/ml in H20 |
| phenol Red-free HBSS | Life Technologies | 14175-103 | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP299-100 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016-100G | Stock solution 1M in H20 |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 208337 | Stock solution 1M in H20 |
| Human Serum albumin | Sigma-Aldrich | A6909-10ml | |
| Immersol 518 F fluorescence free Immersion oil | Fisher Scientific | 12-624-66A | |
| Fura-2 AM 20x50ug | Life Technologies | F1221 | Stock solution 1mM in DMSO |
| pEYFP-Mem (Mem-YFP) | Clontech | 6917-1 | |
| pDsRed-Monomer (Soluble Cytoplasmic DsRed) | Clontech | 632466 | |
| pDsRed-Monomer Membrane (Mem-DsRed) | Clontech | 632512 | |
| pEGFP-Actin | Clontech | 6116-1 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Life Technologies | A12379 | |
| Formaldehyde solution 37% | Fisher Scientific | BP531-500 | Toxic, use fumehood |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-5ML | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Falcon Tissue Culture Treated Flasks T25 | Fisher Scientific | 10-126-9 | |
| Falcon Tissue Culture Treated Flasks T75 | Fisher Scientific | 13-680-65 | |
| Corning Cell Culture Treated T175 | Fisher Scientific | 10-126-61 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-85 | 12 mm diameter |
| Falcon Tissue Culture Plates 24-well | Fisher Scientific | 08-772-1 | |
| Delta-T plates | Bioptechs | 04200415B | |
| Wheaton Disposable Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-8D | |
| 1.5 ml Eppendorf tube | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| ICAM1 mouse anti-human | BD Biosciences | 555509 | |
| HS1 mouse anti-human | BD Biosciences | 610541 | |
| Anti-Human CD11a (LFA-1alpha) Purified | ebioscience | BMS102 | |
| Anti-Human CD3 Alexa Fluor® 488 | ebioscience | 53-0037-41 | |
| Anti-MHC Class II antibody | Abcam | ab55152 | |
| Anti-Talin 1 antibody | Abcam | ab71333 | |
| Anti-PKC theta antibody | Abcam | ab109481 | |
| phosphotyrosine (4G10 Platinum) | Millipore | 50-171-463 | |
| Nucleofector II | Amaxa Biosystems | Required electroporator for step 4 | |
| Zeiss Axiovert | Carl Zeiss MicroImaging | ||
| Zeiss LSM510 | Carl Zeiss MicroImaging | ||
| Zeiss Axiovison Software | Carl Zeiss MicroImaging | ||
| NU-425 (Series 60) Biological Safety Cabinet | NuAIRE | Nu-425-600 | |
| Forma STRCYCLE 37 °C, 5% CO2 Cell culture Incubator | Fisher Scientific | 202370 | |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | EW-02570-02 | |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemocytometer |
| Isotemp Waterbath model 202 | Fisher Scientific | 15-462-2 |
References
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