Wir beschreiben eine Technik, um Neuronen und ihre Prozesse über anterograden oder retro Tracer Injektionen in Hirnkernen unter Verwendung eines in vitro-Präparat zu bezeichnen. Wir modifiziert eine vorhandene Methode der i n vitro Tracer Elektroporation durch die Nutzung von fluoreszenzmarkierte Mausmutanten und grundlegende optische Geräte, um die Kennzeichnung Genauigkeit zu erhöhen.
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Methodenartikel
Lasergelenkte neuronale Tracing in Brain Explantate
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Präsentieren wir eine Technik, die eine in vitro-Tracer Injektionsprotokoll, das eine Reihe elektrischer und Druckimpulse verwendet, um die Farbstoffaufnahme durch Elektroporation in Gehirn Explantate mit gezielten Laserbeleuchtung und passende Filterbrille während des Verfahrens zu erhöhen verbindet. Die beschriebene Technik der in vitro-Elektroporation von selbst ergibt eine relativ gute Sichtkontrolle für Targeting bestimmter Bereiche des Gehirns. Durch die Kombination mit Laseranregung fluoreszierender genetischen Markern und deren Auslesen durch Band-Passing-Filterbrille, die abholen können die Emissionen der genetisch markierten Zellen / Kerne und der Fluoreszenz Tracing-Farbstoff, ein Forscher kann im Wesentlichen die Genauigkeit der Einspritzungen zu erhöhen von der Suche nach den interessierenden Bereich und Controlling für das Farbstoff-Ausbreitung / Aufnahme im Injektionsbereich sehr viel effizienter. Außerdem ermöglicht das Laserbeleuchtungstechnik, um die Funktionalität eines gegebenen neurocircuit Prov studierenIding Informationen über die Art von Neuronen auf einen bestimmten Bereich in den Fällen, wo der GFP-Expression in den Typ des Senders von einer Subpopulation von Neuronen verbunden vorsteht.
Einleitung
Um eine bestimmte neuronale (Mikro-) Schaltung zu definieren, muß man durch Auffinden der verschiedenen Teilnehmer der Schaltung und ihre Verbindungsstruktur zu beginnen. Seit Wallers Publikation über neurofiber Verfolgung durch Läsion 1 eine Vielzahl von neuroanatomischen Tracing-Techniken hergestellt wurde. Einige dieser Techniken können in festen Gewebe post mortem 2-4 angewendet werden, andere stützen sich auf den aktiven Transport des Farbstoffes in lebenden Neuronen, wie 1971 5-6 entdeckt. Letztere kann weiter in zwei Gruppen Unterscheiden zwischen Methoden unter Ausnutzung der aktiven retrograden unterteilt werden (von der Inje....
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Protokoll
1. Optische Genotypisierung
1. Optische Genotypisierung von Maus Pups
- Check für die Expression des jeweiligen Fluoreszenzmarker mit einem Laserzeiger des geeigneten Anregungswellenlänge (405 nm in den hier beschriebenen Experimenten) und entsprechenden Filterbrille Blockierung der Anregungswellenlänge aber Passieren der Emissionswellenlänge (450 - 700 nm in den hier beschriebenen Experimente) . Richten Sie den Laserpointer auf der Rückseite des Kopfes oder das Rückenmark der Maus pup (siehe Abbildung 1). Vermeiden Aufstrahlen des Lasers in den Augen und langwierige Exposition der Haut mit Laserlicht.
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Ergebnisse
Die 1 und 2 zeigen, wie der Laserpointer und Laserschutzbrillen verwendet werden, um GFP-positiven Tieren schnell und kostengünstig Genotyp aus einem Wurf werden. In Fällen von jungen Maus Jungtieren kann die Technik verwendet werden, um nicht-invasiv zu identifizieren GFP Label in das Tier Gehirn durch den Schädel und die darüber liegende Haut (1A - D) werden. Emittierte Fluoreszenz durch die Haut und dem Schädel des Maus Welpen mindestens bis zur postnatalen Tag 3 (1C)
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Diskussion
Eine allgemeine Stärke in vitro Tracer Elektroporation, im Gegensatz zu in vivo Darstellung Studien ist, dass es Forschern besseren Zugang zum Gehirn Bereich von Interesse und folglich nicht teuer stereo (und oft elektro) Ausrüstung umfassen. Darüber hinaus ist die für das Gehirn Explantate erforderliche Überlebenszeit erstreckt sich über nur ein paar Stunden (1 - 4) anstelle von Tagen oder sogar Wochen im Fall von in vivo-Tracer Injektionen (siehe eine detaillierte Überprüfung auf der Verwend.......
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Offenlegungen
Wir haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Teilweise durch NIH / NCRR Colorado CTSI Statt Anzahl UL1 RR025780 und den Rocky Mountain Neurlogical Disorders Kernmitte Statt NIH P30NS048154 Unterstützt von NIH / wurden NIDCD R01 DC 011582. Imaging Experimente in der Universität von Colorado Anschutz Medical Campus Advanced Light Microscopy Kerndurchgeführt unterstützt. Dr. Sascha du Lac aus dem Salk Institute hat uns mit den GlyT2-GFP-Mäusen.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Natriumchlorid | Sigma-Aldrich | S7653 | Alle Chemikalien stammen von Sigma-Aldrich, sofern nicht anders angegeben. |
| Kaliumchlorid | P9333 | ||
| Kaliumphosphat einbasisch | P5655 | ||
| Natriumphosphat zweibasisch | S907 | ||
| Magnesiumchlorid | M2670 | ||
| Calciumchlorid | C5080 | ||
| Glukose | G7528 | ||
| Natriumbicarbonat | S6297 | ||
| Ascorbinsäure | A4544 | ||
| Myo-Inositol | I5125 | ||
| Natriumpyruvat | P2256 | ||
| Rinderserumalbumin | A2153 | optional, für zusätzliche (Immun-)Histochemie | |
| Triton-X-100 | X100 | optional, für zusätzliche (Immun-)Histochemie | |
| Poly(ethylenglykol), 8000 MW | P2139 | optional, für die Reinigung des Gehirns | |
| Formamid | Fisher Scientific | F84 | optional, für die Reinigung |
| Gehirns Choleratoxin subunit-b | Molekulare Sonden | C-34776 (Alexa 555) | |
| Dextran-Tetramethyl-Rhodamin | Molekulare Sonden | D-7162 (Alexa 555) | |
| Fluoreszierendes Nissl | Invitrogen | N-21479 (blau) | optional |
| Paraformaldehyd | Fisher Scientific | SF93 | |
| Agarose | Invitrogen | 16520 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Pentobarbi-tal | Vortech Pharmaceuticals | Fatal-Plus | |
| Borosilikatglas-Filamente | Harvard Apparatur | G150F-10 | |
| Pipettenabzieher | Zeitz Instruments, Deutschland | DMZ Universal Puller | |
| Perfusionseinrichtung | Maßgeschneiderte | ||
| Laserpointer | laserpointerpro.com, Hong Kong | HK-88007294 (405 nm) | |
| Filter/Schutzbrille | Dragon Lasers, China | LSG09 (Bandpass 450-700 nm) | |
| Bionokulares Mikroskop | Wild Heerbrugg, Schweiz | Wild M3 | Ausgestattet mit High-Intensity Illuminator (MI-150; Dolan-Jenner Inc.) |
| Picospritzer | Parker Instruments | Picospritzer III | |
| PC mit installierter MC Stimulus Software | Mehrkanalsysteme, Deutschland (Software) | ||
| 2-Kanal Stimulator | Mehrkanal Systeme, Deutschland | STG-1002 | |
| Stimulationsisolationseinheit | A.M.P.I., Israel | Iso-Flex | |
| Mikromanipulator | Narishige, Japan | YOU-1 | |
| Vibratome | Leica, Deutschland | VT1000S |
Referenzen
- Waller, A. Experiments on the sections of glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog and observations of the alterations produced thereby in the structure of their primitive fibers. Philos. Trans. R. Soc. Lond. 140, 423-429 (1850).
- Fink, R. P., Heimer, L.
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Nachdrucke und Genehmigungen
