Summary
Under bananfluga slagsmål, beteendemönster observeras bekämpa dynamik, och tillhörande inlärning och minne påverkas av experimentella betingelser. Protokollet presenteras här beskriver ett nytt förfarande som helt eliminerar hantering av flugor under experiment. Detta förbättrar kampen dynamik och möjliggör bildandet av starka "förlorare" effekter.
Abstract
Aggressivt beteende i Drosophila melanogaster är sammansatt av den sekventiella uttryck för stereotypa beteendemönster (för analys se 1). Denna komplexa beteende påverkas av genetiska, hormonella och miljöfaktorer. Som i många organismer, påverkar tidigare striderna erfarenhet striderna strategi flugor och resultatet av senare tävlingar: att förlora en kamp ökar sannolikheten för att förlora senare tävlingar, avslöjar "förlorare" effekter som sannolikt innebär inlärning och minne 2-4. Lärande och minne som följer med uttrycket av komplexa sociala beteenden som aggression, är känslig för förtest hantering av djur 5,6. Många experimentella procedurer används i olika laboratorier för att studera aggression 7-9 dock ingen rutinmässigt används protokoll som exkluderar hantering av flugor är för närvarande tillgänglig. Här rapporterar vi ett nytt beteende apparat som eliminerar hantering av flugor, med hjälp av insteaend deras medfödda negativa geotactic svar att flytta djur i eller ut ur striderna kammare. I detta protokoll är små runda kampen arenor som innehåller en livsmedels kopp uppdelad i två lika stora delar av ett reglage löstagbart plast före införandet av flugor. Flugor anger kammare från sina hem isolering flaskor via skjutbara kammardörrar och geotaxis. Vid avlägsnande av reglagen plast, flugor är fria att interagera. Efter angivna tidsperioder, är flugor separeras igen genom reglagen för efterföljande experiment. Allt detta sker enkelt utan hantering av enskilda flugor. Denna apparat erbjuder en ny metod för att studera aggression och tillhörande inlärning och minne, inklusive bildandet av "förlorare" effekter i Fly slagsmål. Dessutom kan den nya allmänna ändamål beteende apparat användas för att studera andra sociala beteenden av flugor och bör i allmänhet vara av intresse för att undersöka erfarenhetsrelaterade förändringar i fundamentala beteende processer.
Introduction
Aggression i djursystem är starkt förknippad med förvärv och innehav av resurser såsom mat, territorium och kamrater. Med tanke på den viktiga roll detta spelar i fitness individer, är det inte förvånande att aggression har utvecklats över djurriket. Som en adaptiv drag som direkt gynnar individer, är en stark inlärning och minneskomponent i samband med aggression. I konkurrens för social rang, påverkar resultatet av senare tävlingar tidigare striderna erfarenhet. I allmänhet tidigare kända förlorande erfarenhet ökar, och vinnande erfarenhet minskar sannolikheten för att förlora senare tävlingar (kallas "förlorare" och "vinnare" effekter). "Förlorare" effekter har observerats i ett brett spektrum av arter, och vissa rapporter tyder på att dessa kan pågå i flera dagar medan "vinnare" effekter vanligtvis kortare tid 2,10,11.
Den första rapporten av aggressivt beteendei fruktflugor (D. ampelophila) var Sturtevant 1915 i en uppsats behandlar sex erkännande och urval 12 kön. Ett halvt sekel senare, mer kompletta undersökningar av manliga bananfluga aggression gjordes som beskrivs de flesta av de beteendemönster som observerades under frukt flyga slagsmål. Dessa experiment var mestadels genomförs i små grupper av manliga och kvinnliga flugor som observerats under timmar 13-15. Nyligen, med tillägg av kraftfulla genetiska verktyg, dyadisk enkönade kampen uppställningar och kortare tider för observation, D. melanogaster har dykt upp som en viktig systemmodell för att studera biologi aggression 1,16. Analys av slagsmål mellan samkönade par av manliga och kvinnliga flugor visade att aggression innebär stereotypa beteendemönster som övergång från det ena till det andra på ett statistiskt tillförlitligt sätt 1,17. Några av de beteendemönster som observerats är könsspecifika medan andra observeras i kampensi båda könen. Man slagsmål gå till högre intensitet än kvinnliga slagsmål och resulterar i bildandet av dominansrelationer med tydliga "vinnare" och "förlorare". För närvarande har många laboratorier börjat undersöka biokemiska 18, neurala 7,19-21, och genetiska 22 grunderna för aggression. Tyvärr har en metaanalys av studier få inblick i kampen dynamik och bildning och underhåll av dominansrelationer är problematisk på grund av användningen av ett flertal experimentella förfaranden i olika laboratorier. Väsentligen alla de tekniker som beskrivits i litteraturen innebär hantering och manipulering av flugor att introducera dem i arenor 19,23,24 och under beteende experimentet 3,4 att överföra flugor av arenor. Gentle strävan är det vanligaste sättet att manipulera flugor 3,4,23-25, men kallt eller CO 2 anestesi används också 9,26, även om previous studier redan har rapporterat att dessa förfaranden har skadliga effekter på fluga beteende 27,28. En period om minst 24 timmar rekommenderas efter användning av bedövningsmedel för att minimera deras effekter på beteende 29,30.
Flugor lära av tidigare striderna erfarenhet och ändra deras beteendemönster användning i nya situationer, vilket tyder på att inlärning och minne åtfölja och är en följd av agonistiska möten. I den meningen, flyga slagsmål liknar till operant conditioning inlärningssituationer där flyger lära sig att en strategi har fungerat och sedan använda det mer och oftare under kommande möten. Flugor ändrar sina stridsstrategier efter dominansförhållanden har fastställts under slagsmål, med vinnare lunging mer och mer och förlorare mindre och mindre. Efter en period av separation, tidigare förlorare visar mycket mer undergivet beteende och är mycket sannolikt att förlora 2: a kämpar när det paras ihop med naiva fltalet eller tidigare vinnare 3,4. Däremot har frånvaron av en experimentell förfarande som utesluter hantering av flugor gjort detaljerade studier av "loser" effekter svårt. I en nyligen genomförd studie jämförde vi två experimentella procedurer som rutinmässigt används i laboratorier (aspiration och kall anestesi) att införa flugor i beteende kammare till det nya förfarandet som eliminerar hantering. Resultaten visade att kall anestesi hade långt större negativa effekter på aggression än aspiration, men även aspiration minskat graden av aggressivitet av flugor. Aspiration gjorde dock orsaka mycket betydande effekter på inlärning och minne som följer aggression. Efter identiska protokoll med två experimentella procedurer (aspiration och ingen hantering), en robust "förlorare" effekt observerades endast när hanteringen av flugor eliminerades från experimentet 5,6.
Helst studier av Drosophila aggression i laborier bör omfatta miljö situationer som normalt flyger möter i naturen (konkurrens om resurser, territorium för att försvara och utrymme att fly). Dessutom bör experimentella betingelser optimeras för att på ett tillförlitligt sätt framkalla, observera och tolka beteende under tentamen (försöka minimera djurhantering, begränsa användningen av CO2 som bedövningsmedel och standardisera experimentella procedurer). I ett försök att ta itu med de flesta eller alla av dessa frågor har vi utformat en ny beteende apparat som eliminerar hantering av flugor före, under och efter att införa dem till beteende arenor. Med dessa apparater, flugor använder sina inneboende negativa geotaxis att flyttas och överförs till och från kampen kamrarna. Genom att eliminera hantering av flugor, syftar protokollet till: (a) minska beteendevariationsrikedomen bland individer; (b) minska den tid som krävs för flugor att samverka och skapa tydliga dominansrelationer (män); och (c) på ett tillförlitligt sätt framkalla stark nog behavioRAL förändringar för att möjliggöra bildandet av "förlorare" effekter.
Detta protokoll beskriver en ny experimentell anordning och ett stegvis förfarande för att analysera aggression och att tillåta bildandet av en stark "förlorare" effekt i D. melanogaster. Vi förväntar oss att detta beteende apparat kan enkelt anpassas för att studera andra sociala beteenden som uppvisas av fruktflugor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: Följande är en steg-för-steg-anvisningar för experimentella protokoll som vi använder för att tillåta tillförlitlig utlösning av aggression mellan par av manliga fruktflugor (D. melanogaster). Denna procedur inducerar bildandet av en "förlorare" effekt. Med hjälp av detta protokoll, en kortsiktig "vinnare" effekten också har nyligen rapporterat 5,6. Figur 1 visar tidslinjen för beteendeexperiment.
Figur 1. Tidslinje aggression experiment. På dag 1, är sent skede manliga puppor (när vingarna blir svart) isolerad på nylagade isoleringsflaskor. 5 dagar efter framstår som vuxna, är fyra dagar gamla manliga flugor bedövades med CO2 och målade med olika färger för identifiering. På dag 7, mat koppar och kämpar kamrarna ärberedd att ställa upp beteendeexperiment. Två 6-7 dagsgamla vuxna män laddas in i kamrarna och kan interagera. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
1. Dag 1: Social Isolering av Puppor
- Höj och upprätthålla flygalager på ett miljömässigt kontrollerat 12 timmar ljus / 12 h mörker-cykel inkubator vid 25 ° C och 50% relativ fuktighet.
- Förbered isoleringsinjektionsflaskor: Värm färsk fluga mat tills smält. Med användning av en Pasteur-pipett cirka 1,5 ml smält fluga mat till enstaka tomma provrör (1,6 x 10 cm). Låt maten stelna.
- Isolera puppor: Med en fin pensel, försiktigt bort ett sent skede manliga puppa (när vingarna blir svart) från aktieflaskan och placera den på sidan av en nygjord mat som innehåller provrör. Stäng isoleringsinjektionsflaskor med bomull (Figur 2).
Figur 2. social isolering. Ett sent skede manliga puppa är placerad på sidan på en nygjord isoleringsflaskan. Isolerings ampuller innehållande puppa placeras i 12 timmar ljus / 12 timmar mörker inkubator vid 25 ° C och 50% relativ fuktighet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
2. Dag 5: Måla Flugor för enskilda identifiering
- Utför detta steg i dag 5 med 4 dagar gamla manliga flugor och två dagar före beteende experiment för att minimera de negativa effekterna av CO 2 anestesi.
- Söva flyga med CO2. Med en fin tandpetare, placera en liten prick av akrylfärg på bröstkorgen. Undvik att placera färg på huvudet, vingar, mage eller ben (Figur 3).
- Låt färgen torka för cirka 10 sekunder, och försiktigt föra flugor tillbaka till sina ursprungliga isoleringsflaskor.
- Återgå isolerings ampuller till 12 timmar ljus / 12 h mörk inkubator vid 25 ° C och 50% relativ fuktighet.
Figur 3. Individuell identifiering. Efter anesthetizing en fluga med CO2, en liten droppe av akrylfärg appliceras på bröstkorgen. Individuell identifiering ändamål är olika färger används (vitt och blått här). Se avsnittet nedan angående användning av CO2 i detta steg. Klicka Vänligen här för att se en större version av denna Figure.
3. Dag 7: Förbereda Apparatus
- Laga mat Cups:
- Värm färsk fluga mat, tills den smälter.
- Med användning av en Pasteur-pipett cirka 0,8 ml mat till locket på en skruvkork flaska (1,5 cm i diameter, 1 cm höjd) och låt svalna. Undvika luftbubblor.
- Gör färsk jäst pasta genom att blanda torrjäst med några droppar vatten. När tjock, applicera en liten droppe av jäst pasta till mitten av maten koppen ytan med en tandpetare (Figur 4).
Figur 4. Förbereda maten koppen. En livsmedels kopp beredd med färsk fluga mat. Efter maten stelnar, är en punkt av jäst pasta placeras i mitten av maten cup ytan. Klicka här för att visa b en större version av denna figur.
- Förbered Individuella Fighting Chambers:
- Tvätta apparaten och individuella kampkammare med vatten före användning varje gång. Torka med hushållspapper före användning.
- Placera en livsmedels kopp i mitten av varje kämpar kammare och fäst på plats med en droppe av spackel.
- Täck strids kammare med locket apparaten (Figur 5).
- Placera anordningen in i en hög luftfuktighet (60%) vid 25 ° C.
- Placera en ljuskälla ovanför apparaten för att belysa de stridande kamrarna och ställa in en videokamera för inspelning från ovan.
Figur 5. Förbereda enskilda striderna kammaren. Den nylagad mat kopp med en prick av jäst klistra på ytan är fast i tvättas individuella fighting kamrar. Chambers är stängda med den tvådelade lock möjliggör införande av en ogenomskinlig plastavdelaren i enskilda strids kammare. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
4. Dag 7: Behavioral Experiment
- Utför beteendeförsök med 6-7 dagar gamla manliga flugor.
- För in plast delarna i varje bekämpa kammaren.
- Avlägsna bomullsplugg från isoleringsröret och placera röret nedanför ett öppet hål på sidan av apparaten.
- Låt flugan komma in i stridskammaren av negativa geotaxis, vanligtvis inom några få sekunder.
- Stäng skjut väggen efter flugan har lämnat röret och in i kammaren.
- Upprepa proceduren för att införa den andra flyga in i striden kammaren på den andra sidan av apparaten.
- Placera apparaten tillbaka i det belysta videotaping position.
- Börja videoinspelning och ta bort plastavdelare att tillåta flugor att interagera.
- För Aggression Experiment:
- I dessa experiment bekämpar registret under åtminstone 20 min för att säkerställa bildningen av starka dominansrelationer.
- Efter önskad tid, stoppar videoinspelning.
- Ta bort flugor från striderna kamrarna genom att vända det förfarande som beskrivs ovan.
- Noggrant tvätta beteendeapparat med milt rengöringsmedel och vatten efter varje användning och skölj.
- För "Loser" Effekt Experiment:
Obs: I dessa försök är första slagsmål betraktas som konditioneringsfasen och den andra slagsmål som testfasen. Den viloperiod mellan slagsmål kan variera men 10 min tillåter bildandet av en stark "förlorare" effekt.- Följ anvisningarna ovan för att utföra en första slagsmål.
- Kritiskt steg: För att inducera bildandet av en "förlorare" mentalitet, eNsure att de första slagsmål är minst 20 minuter lång för att etablera starka dominans relationer. Efter 20 minuter, sätt tillbaka plastavdelaren i striderna kammare för att separera flugorna.
- Efter en 10 minuters period av vila, försiktigt bort plastavdelare att tillåta flugor att samverka för andra slagsmål.
- I slutet av den andra 20 min kamp, stoppa videoinspelningen.
- Ta bort flugor från beteende kammare enligt ovan.
- Än en gång, rengör beteendeapparaten.
- För Aggression Experiment:
5. Beteendeanalys
- Överföra filmer
- Anslut kameror till datorn.
- Konvertera flugor MTS att .mov flugor och gå filmer klipp tillsammans, med hjälp av video konvertering programvara och alternativet "join markerade klipp".
- Observera och analysera varje film med videoläsarprogram.
- Scoring Beteende
Obs! Detta kan göras manuellt eller ossing beteendeanalys mjukvaruprogram om det finns. Bilden nedan beskriver en möjlig manuell analys för en "loser" effekt.- Betyg tiden för det första mötet mellan flugorna på livsmedel cup (möten är växelverkan mellan par av flugor som varar minst 2 sek) och tidpunkten för uppkomsten av den första utfall (ett beteendemönster där en fluga stiger högt upp på sin bakbenen och snäpper ner på och försöker att greppa motståndaren). Därefter, poäng latensen att utfall (intervallet mellan det första mötet och den första utfall).
- Räkna det totala antalet möten och utfall under ett slagsmål.
Obs: Om så önskas, man också kan göra mål andra beteendemönster, som ving hot, boxning, fäktning, reträtt eller antalet möten före första utfall, till exempel. - Betyg tidpunkten för upprättandet av en dominerande ställning (tiden mellan första mötet och den tidpunkt då man flyga reträtter för tre gånger i följd av maten cup akterer mottagande utfall). Sedel som flyger är vinnaren och som förlorare i kampen.
- Beräkning av en "förlorare" Effect
- Dividera antalet slagsmål där tidigare förlorare förlorar 2: a slagsmål (förlorare som förlorar: LL) av det totala antalet slagsmål, och multiplicera med 100. Andelen erhållna representerar "förloraren" effekt:
[(# Flyger LL) / (# total kamp)] x 100 - Använd en Chi-kvadrattest för att jämföra huruvida "förlorare" effekt är statistiskt skilt från det förväntade värdet av 50%.
- Dividera antalet slagsmål där tidigare förlorare förlorar 2: a slagsmål (förlorare som förlorar: LL) av det totala antalet slagsmål, och multiplicera med 100. Andelen erhållna representerar "förloraren" effekt:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I detta avsnitt presenteras utformningen av beteende kammaren och analys av en typisk uppsättning av beteendeförsök efter protokollet som beskrivs ovan att mäta aggression och bildandet av en "loser" effekt. Illustrerade är också exempel på andra beteenden som kan mätas med hjälp av denna apparat.
Figur 6 visar en schematisk representation av den nya anordningen. Anordningen består av tre cylindriska brunnar (mått: 22,86 mm diameter, 17 mm höjd) som är stridskamrarna. Den tvådelade locket stänger striderna kamrarna på toppen och tillåter införande av en tunn opak plastavdelare som delar kamrarna i två lika stora delar. På varje sida av apparaten, skjutväggar med tre hål (15,88 mm diameter) medger laddning av flugor i striderna kamrarna med negativa geotaxis direkt från sina isoleringsflaskor. Efter flugor in i striderna kamrarna, skjut väggarna är användningend för att stänga på sidorna av alla kammare. Vid denna punkt är de två flugor är inom kampen arenor men kan inte interagera på grund av delarna. Genom att ta bort dessa, flugorna är fria att interagera och de efterföljande beteendemönster kan observeras och registreras.
Aggression experiment: 38 slagsmål mellan par av vild typ CS män utfördes. Olika beteendeparametrar bedömdes medan flugor var på livsmedels koppar och dynamiken i slagsmål analyserades (tabell 1). I genomsnitt 24 möten (korta möten mellan flugor), 54 utfall (en indikator av högre intensitet striderna) observerades under en 20 min period, med den 1: a utfall brukar levereras under 2: a mötet. I genomsnitt har 1: a möte, den 1: a utfall och tid att etablera dominans sett 2, 4 och 8 minuter efter påbörjad inspelning. I de flesta fall, de sista 12 min av slagsmål består av repetitiva sekvenser av hög intensitet Encounters med underordnade djur närmar sig, attackeras och att dra sig tillbaka, förstärka den dominans eller undergiven status för varje djur.
"Förlorare" effekt experiment: För att söka efter bildandet av en "loser" -effekt, 21 1 st slagsmål av 20 min varaktighet genomfördes mellan par av vild typ CS män. Kammaren glidande avdelare sedan infördes för att separera flugorna. Efter 10 minuter var 2: a 20 min slagsmål utförs mellan (a) tidigare förlorare och bekanta vinnare eller (b) tidigare förlorare och okända vinnare och dessa analyserades enligt ovan (Figur 7). I båda villkor, 20 tidigare förlorare förlorat sina 2: a slagsmål (95,5%), vilket visar en robust "förlorare" effekt. Kampen utfall jämfördes med det förväntade värdet av 50 till 50 med en två-tailed Chi-kvadratanalys och en starkt signifikant "förlorare" effekt påträffades. Andra beteendeförändringar observerades i att förlora individermellan den 1: a och 2: a kämpar åtföljer bildandet av "förloraren" -effekten 5.
Andra beteenden än aggression kan studeras i apparaten: att illustrera var frieri och locomotion experiment (T kunna 2). För uppvaktning, var manliga och kvinnliga flugor belastas med negativa geotaxis i beteende kamrarna har avdelare bort och beteende uppvaktning mönster räknades. 34 experiment utfördes och de latenser till domstol (tid mellan den 1: a mötet och den 1: a parningsbeteende = 7 sek) och att kopulera (tiden mellan den 1: a mötet och parning = 4 min) analyserades. Endast två hanar lyckades inte copulating under 15 min tiden för observation. Den Uppvaktningen Vigör index (den fraktion av tiden som hannar spend courting honor under en 15 minuters period efter det 1:a uppvaktning beteendemönster) poängsattes vid 75% (tabell 2). För transport antingen syndGLE flugor eller en grupp av 10 flugor infördes i kamrarna och det totala antalet av mittlinjekorsningar under 5 minuter räknades. Enstaka flugor korsa mittlinjen av kammaren i genomsnitt 73 gånger under 5 min, medan enskilda flugor i grupp över mittlinjen i genomsnitt 45 gånger / 5 min (tabell 2). Denna minskning observerades när flugor är i grupp kan förklaras av den minskade utrymmet per fluga och när de stannar och interagerar med varandra i stället för att utforska området.
Figur 6. Schematisk representation av den beteendekammaren. (A) från sidan av anordningen. Den nya apparaten består av tre separata delar: (a) en plastblock med tre personer kämpar kammare; (b) två skjutväggar med tre hål (15,88 mm diameter) i vardera; och (c) två-bit locket ovanpå. (B) Toppvy av anordningen. Dimensionerna av plastblocket (a) är 36,83 mm x 123.19 mm. Varje enskild slåss kammaren har en diameter på 22,86 mm och en höjd av 17 mm. Hål på den sida som tillåter lastning av flugorna har en diameter på 15,88 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7. Bildandet av en robust "förlorare" effekt. En betydande "förlorare" -effekt (procentandel av förlorare som förlorar 2: a kämpar observeras när tidigare förlorare parades (a) med välbekanta vinnarna (n = 21, *** p <0,0001) eller (b) med okända vinnare för sina 2: a slagsmål (n = 21, *** p <0,0001) (Lose: 95,5%, Win:. 4,5%, ingen drar) Pllätta klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Beteendeparametrar | Enhet | Tid (sek) | n |
| Möten | 24 ± 2 | 38 | |
| Utfall | 54 ± 6 | 38 | |
| Antal möten före den 1 utfall | 2 ± 0,3 | 38 | |
| Tid för 1: a mötet | 145 ± 20 | 38 | |
| Tid för 1: a utfall | 229 ± 26 | 38 | |
| Tid för dominans | 475 ± 56 | 34 | |
| Latens till utfall | 87 ± 20 | 38 | |
| Latens dominans | 342 ± 51 | 34 |
Tabell 1:. Dynamics av agonistiska interaktioner mellan par av manliga flugor Medelvärden ± SEM beräknas för varje parameter gjorde som indikatorer på aggressivitet. Det totala antalet möten och utfall, och antaletav möten före den 1 utfall bedömdes. Tider på 1: a mötet, 1st utfall och dominans, och latenser till utfall och dominans presenteras i sek ± SEM (n> 34).
| Beteendeparametrar | Tid (sek) | Enhet | (%) | n |
| Parningsbeteende | ||||
| Latens till domstol | 7 ± 3 | 34 | ||
| Latens att kopulera | 273 ± 62 </ td> | 32 | ||
| Uppvaktningen Vigor index | 75 ± 0,05 | 34 | ||
| Förflyttning | ||||
| Totalt mittlinjen korsar (enda fluga) | 73 ± 4 | 48 | ||
| Totalt mittlinjen kors (grupp av flugor) | 45 ± 3 | 20 |
Tabell 2:. Analys av parningsbeteende och rörelse Medelvärden ± SEM beräknas för latenser till domstol och kopulera (i sek). En uppvaktning vigör Index(i% av tiden som upptas courting efter 1:e uppvaktning display) poängsattes efter hanar och honor laddades i beteende kamrar av negativa geotaxis (n> 32). Rörelseorgan, när enstaka flugor eller grupper av 10 flugor laddades i kammare, poängsattes genom att räkna det totala antalet mittlinjekorsningar under 5 min (n = 48 och 20).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den moderna eran av att använda Drosophila med sin kraftfulla genetiska metoder som modellorganism för studier av aggression började omkring ett dussin år sedan med införandet av nya försöks arenor där tillförlitlig kämpar beteende kan erhållas med enstaka par av flugor 1,7, 8,17,19. Dessa arenor ingår önskade resurser (ett livsmedel cup, potentiella kompisar) och ett utrymme för förlorare flyger till retirera in. När resultat som erhållits med dessa arenor sattes till tidigare kunskap om bananfluga kampen beteende, var Drosophila melanogaster etablerat som en mycket önskvärd modellsystem för att pröva en komplex beteende som aggressivitet och används i många laboratorier. De summerade erhållna resultaten visade att: (a) flyger uppvisar aggression i konkurrensen om föda, tillgång till kompisar eller försvara territorium 14,15; (b) slagsmål är sammansatta av en sekventiell serie av stereotypa beteendemönster 1; (c)manliga och kvinnliga flugor slåss i samkönade ligaspel (vissa mönster är män specifika, vissa är kvinnliga specifika och vissa är delas av båda könen) 17; (d) endast manliga slagsmål gå till höga intensitetsnivåer och resulterar i bildandet av hierarkiska relationer med tydlig «vinnare» och «förlorare» flugor 17; (e) en enda gen fruktlösa, för könsbestämning hierarkin, avgör om flugor slåss som män eller kvinnor 16 och (f) flera hormonella ämnen inklusive aminer och peptider påverkar aggression i fruktflugor 7,8,19,20.
Här är ett nytt tillvägagångssätt som beskrivits för studier av fruktflugan aggressivitet i vilken hantering av flugor under experimenten elimineras. Detta ger en betydande förbättring i den experimentella protokollet som alla beteende mätningar förbättras 5,6, ny information om beteendet har gjorts och inlärning och minne som medföljerMale flyg slagsmål förbättras avsevärt. För att illustrera, har endast två tidigare studier rapporterade bildandet av "förlorare" effekter i detta modellsystem 3,4. I båda dessa ades större kammare än de som beskrivs i detta protokoll som används, flugor överfördes till och från fight arenor genom aspiration, och längre kämpa tider och intervalltider mellan slagsmål var nödvändigt att ta fram tydliga "förlorare" effekter. Vår senaste undersökning visade att eliminera hantering av det experimentella protokollet, tydliga dominansrelationer mellan par av D. melanogaster manliga flugor observeras efter bara 20 minuter av interaktion. Denna tid är tillräcklig för att inducera betydande förändringar i striderna strategier i båda flugor under 1 st slagsmål och att på ett tillförlitligt sätt observera bildandet av starka "förlorare" effekter i 2: a slagsmål. Dessutom, för första gången, klart kortsiktiga "vinnare" effekter även observerades under 2 ndbekämpar 5,6.
För framgång med detta protokoll, en del kritiska punkter måste noteras. För att inducera och observera robusta aggressiva beteendemönster vi rekommenderar att du använder 6-7 dagar gamla manliga flugor som har hållits i social isolering sedan slutet puppstadium. I allmänhet, tillgången till resurser som flyger är villiga att konkurrera över (mat, kamrater) är mycket önskvärt för att uppnå en stark slåss beteende och etablering av dominansrelationer. Under detta protokoll, är flugor målas efter anestesi med hjälp av CO 2, och som kan vara av intresse som vår nyligen publicerad studie visar att anesthetizing flugor allvarligt stör efterföljande beteende 5. Möjliga sätt att undvika anestesi kan vara att inte måla djur om det inte är viktigt att hålla koll på individer. Om målning är dock nödvändigt, anestesi ska användas 48 timmar innan djuren används för experiment, eller alternativa metoder för att identifieraindivider också kan användas 31. För att inducera stark "förlorare" och "vinnare" effekter, är det viktigt att flugor etablera och upprätthålla en dominans relation under första slagsmål. I protokollet presenteras här, med hjälp av vildtyp CS-stammen vid 25 ° C, är tillräcklig för att generera tydliga "vinnare" och "förlorare" och observera förändringar i kampen strategier både individer 20 min av interaktion. I experiment som utförts vid olika temperaturer än 25 ° C eller med andra genotyper än CS kan dock den genomsnittliga tiden för att upprätta en robust dominans relation vara annorlunda. Följaktligen bör stridsperioden justeras genom att utföra uppsättningar av preliminära experiment. Slutligen, hur par av flugor separeras efter deras första slagsmål kan vara viktigt för att bevara minnet av kampen utfall. Det är förmodligen viktigt att minska rörelse hos anordningen och att vara mild under införandet av plastavdelaren förför att minimera störningen av djuren.
Utformningen av apparaten och den tvådelade lock möjliggör separation av de beteende kamrarna i två lika avdelningar, gör det enkelt att separera de två flugor efter första slagsmål och att införa nya motståndare i 2: a slagsmål. Dessutom, såsom visas i tabell 2, med små justeringar av det experimentella protokollet, samma apparat kan användas för att studera uppvaktning, förflyttning eller faktiskt de flesta fruktflugor beteenden i vad som borde vara mindre påfrestande förhållanden för försöksdjur. Eventuella ytterligare förbättringar om förfarandet kan vara att införa någon form av termostatreglering i apparaten (piezoelektriska element eller en spole att cirkulera temperaturreglerad vätska) för att möjliggöra enkel användning av temperaturkänsliga reagens (shibire ts1, dTRPA1 kanal).
Sammanfattningsvis har vi utarbetat en ny apparat som ger en ny strategi för studiet av aggression in fruktflugor där hantering av flugor före, under och efter experiment blev utslagen. Alla beteende åtgärder förbättras med den nya apparaten jämfört med flera andra vanliga sätt att hantera flugor. Kanske en mer allmän kommentar att göra är att i stort sett alla beteendeförsök i laboratoriemiljöer innebär praktiker plockar upp eller på annat sätt, hanterar djur. Trots ansträngningar att vara försiktig i denna hantering, är detta sannolikt att vara stressande för djuren. Det kan vara lämpligt att utforma metoder för att eliminera denna hantering när det är möjligt, så att djur kan observeras under något mer normala förhållanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Denna forskning har finansierats med bidrag från National Institute of General Medical Sciences (GM099883 och GM074675) att EAK Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet. Vi tackar folket från vår verkstad vid Harvard Medical School för utformningen av beteendeapparaten (kontakt: http://mikesmachine.com).
Författare bidrag: ST, BC utformat beteendeapparaten. ST utformade och optimerade försöksprotokoll. ST och BC utföras och analyserade experiment. ST, EAK och BC skrev tidningen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila melanogaster pupa | Bloomington Stock Center | ||
| Standard fly food | Fabricated in-house. | ||
| Behavioral chambers | Mike machine | Fabricated in-house. Directly contact the compagny for more informations. | |
| Borosilicate glass vials | VWR International | 47729-576 | 16 x 10 mm |
| Cotton | Fisherbrand | 22-456-881 | Any brand can be used |
| Pasteur pipettes | VWR International | 53300-567 | |
| Paintbrush | Blick Art Material | 06157-7030 | Round , Size 3/0 |
| Toothpick | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Acrylic paint (blue/white) | Blick Art Material | 01637-5172/01637-1022 | Any brand can be used |
| Dry active yeast | Sigma | YSC2-500G | |
| Srew cap tube | VWR International | 10011-394 | 15 mm diameter, 10 mm height |
| Eppendorf | VWR International | 22363212 | |
| Tape | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Plastic slices | Electron Microscopy Sciences | 70329-40 | 22 x 40 x 0.25 mm Thickness |
| Light source (bulb) | VWR International | 500003-418 | Any brand can be used |
| Timer | VWR International | 62344-641 | Any brand can be used |
| Incubator | Percival | Directly contact the constructor for more informations. | |
| Carbon Dioxide Dry (CO2) | Medical-Technical Gases, Inc | 14H31 | |
| Binocular | Nikon | SMZ-745 | Any brand can be used |
| Camera (SONY Handycam HDR-CX330) | B&H | SOHDRCX330B | Any brand can be used |
| Computer | With a minimum of 1.4 Ghz Processor, running Microsoft Windows or Machintosh HD | ||
| ClipWrap | Download online | Any importing software can be used | |
| QuickTime Player | Download online | Any reading software can be used | |
| GraphPad Software | Online | Any statistical software can be used |
References
- Chen, S., Lee, A. Y., Bowens, N. M., Huber, R., Kravitz, E. A. Fighting fruit flies: a model system for the study of aggression. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 5664-5668 (2002).
- Hsu, Y., Earley, R. L., Wolf, L. L. Modulation of aggressive behaviour by fighting experience: mechanisms and contest outcomes. Biol Rev Camb Philos Soc. 81, 33-74 (2006).
- Yurkovic, A., Wang, O., Basu, A. C., Kravitz, E. A. Learning and memory associated with aggression in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17519-17524 (2006).
- Penn, J. K., Zito, M. F., Kravitz, E. A. A single social defeat reduces aggression in a highly aggressive strain of Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 12682-12686 (2010).
- Trannoy, S., Chowdhury, B., Kravitz, E. A. Handling alters aggression and 'loser' effect formation in Drosophila melanogaster. Learn Mem. 22, 64-68 (2015).
- Trannoy, S., Kravitz, E. A. Learning and memory during aggression in Drosophila: handling affects aggression and the formation of a ''loser'' effect. Journal of Nature and Science. 1 (3), e56 (2015).
- Alekseyenko, O. V., Chan, Y. B., Li, R., Kravitz, E. A. Single dopaminergic neurons that modulate aggression in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 6151-6156 (2013).
- Dierick, H. A., Greenspan, R. J. Serotonin and neuropeptide F have opposite modulatory effects on fly aggression. Nat Genet. 39, 678-682 (2007).
- Williams, M. J., et al. Regulation of aggression by obesity-linked genes TfAP-2 and Twz through octopamine signaling in Drosophila. Genetics. 196, 349-362 (2014).
- Chase, I. D., Bartolomeo, C., Dugatkin, L. A. Aggressive interactions and inter-contest interval: how long do winners keep winning? Anim. Behav. 48, 393-400 (1994).
- Goessmann, C., Hemelrijk, C., Huber, R. The formation and maintenance of crayfish hierarchies: behavioral and self-structuring properties. Behav Ecol Sociobiol. 48, 418-428 (2000).
- Sturtevant, A. H. Experiments on sex recognition and the problem of sexual selection in Drosophila. J Animal Behav. 5, 351-366 (1915).
- Jacobs, M. E. Influence of light on mating of Drosophila melanogaster. Ecology. 41, 182-188 (1960).
- Dow, M. A., von Schilcher, F. Aggression and mating success in Drosophila melanogaster. Nature. 254, 511-512 (1975).
- Hoffmann, A. A laboratory study of male territoriality in the sibling species Drosophila melanogaster and D. simulans. Anim. Behav. 35, 807-818 (1987).
- Vrontou, E., Nilsen, S. P., Demir, E., Kravitz, E. A., Dickson, B. J. fruitless regulates aggression and dominance in Drosophila. Nat Neurosci. 9, 1469-1471 (2006).
- Nilsen, S. P., Chan, Y. B., Huber, R., Kravitz, E. A. Gender-selective patterns of aggressive behavior in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 12342-12347 (2004).
- Fernandez, M. P., Kravitz, E. A. Aggression and courtship in Drosophila: pheromonal communication and sex recognition. J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 199, 1065-1076 (2013).
- Alekseyenko, O. V., et al. Single serotonergic neurons that modulate aggression in Drosophila. Current biology : CB. 24, 2700-2707 (2014).
- Asahina, K., et al. Tachykinin-expressing neurons control male-specific aggressive arousal in Drosophila. Cell. 156, 221-235 (2014).
- Andrews, J. C., et al. Octopamine neuromodulation regulates Gr32a-linked aggression and courtship pathways in Drosophila males. PLoS genetics. 10, e1004356 (2014).
- Zwarts, L., et al. Complex genetic architecture of Drosophila aggressive behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 17070-17075 (2011).
- Dierick, H. A. A method for quantifying aggression in male Drosophila melanogaster. Nat Protoc. 2, 2712-2718 (2007).
- Wang, L., et al. Hierarchical chemosensory regulation of male-male social interactions in Drosophila. Nat Neurosci. 14, 757-762 (2011).
- Davis, S. M., Thomas, A. L., Nomie, K. J., Huang, L., Dierick, H. A. Tailless and Atrophin control Drosophila aggression by regulating neuropeptide signalling in the pars intercerebralis. Nat Commun. 5, 3177 (2014).
- Yuan, Q., Song, Y., Yang, C. H., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Female contact modulates male aggression via a sexually dimorphic GABAergic circuit in Drosophila. Nat Neurosci. 17, 81-88 (2014).
- Perron, J. M., Huot, L., Corrivault, G. W., Chawla, S. S. Effects of carbon dioxide anaesthesia on Drosophila melanogaster. J Insect Physiol. 18, 1869-1874 (1972).
- Joachim, D., Curtsinger, J. W. Genotype and anesthetic determine mate choice in Drosophila melanogaster. Behav Genet. 20, 73-79 (1990).
- Barron, A. B. Anaesthetising Drosophila for behavioural studies. J Insect Physiol. 46, 439-442 (2000).
- Greenspan, R. J. Fly Pushing: The theory and Practice of Drosophila Genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. (1997).
- Cabral, L. G., Foley, B. R., Nuzhdin, S. V. Does sex trade with violence among genotypes in Drosophila melanogaster? PLoS One. 3 (4), e1986 (2008).
