成像细胞器及其他亚细胞结构的动态行为 体内 可以揭示它们在生理和疾病状态下的功能。本文介绍了对两种细胞器——中心体和线粒体——进行遗传标记的方法，并利用宽场显微镜和共聚焦显微镜对活体斑马鱼胚胎中这些细胞器的动态行为进行成像。
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本文内容
摘要
摘要
体内 成像技术为研究细胞及亚细胞结构在其天然环境中的动态行为提供了前所未有的机会。在哺乳动物等高等脊椎动物中开展此类成像实验通常需要通过外科手术进入目标系统。而斑马鱼胚胎和幼鱼具有良好的光学通透性，可避免此类侵入性操作，实现对完整生物体的成像。事实上，斑马鱼现已成为利用活体成像技术可视化动态细胞行为的成熟模型 体内 显微镜技术在从增殖到迁移和分化的多种发育过程中得到广泛应用。近年来，斑马鱼越来越多地被用于研究亚细胞事件，包括线粒体运输和中心体动态。利用荧光蛋白对这些亚细胞结构进行遗传标记的相对简便性，以及采用光学显微技术对其进行成像，正在将斑马鱼转变为一个 体内 细胞生物学模型。本文描述了构建荧光标记细胞器的遗传载体的方法，以线粒体和中心体作为具体示例。我们采用双组分Gal4-UAS系统，在多种配置中限制基因在特定细胞类型中的表达，并提供了构建瞬时表达和稳定转基因鱼的实验方案。最后，我们给出了选择最适合观察亚细胞动态的光学显微镜方法的指导原则。
引言
体内成像可在最接近生理状态的环境中直接观察细胞行为。斑马鱼胚胎具有透明性、发育迅速且为体外发育，加之拥有丰富的遗传工具可用于荧光标记，这些优势共同推动了体内显微镜技术在揭示关键发育过程动态机制中的广泛应用。例如，利用斑马鱼开展的神经系统发育成像研究极大地拓展了我们对神经前体细胞行为及其子代细胞命运的认识，包括这些细胞随后的迁移、分化以及神经环路整合过程1-8。
现在可以开始研究这些细胞行为背后的亚细胞动态机制。事实上，斑马鱼已被用作研究工具 体内 细胞生物学。现在可以对线粒体进行可视化观察9-11中心体2,8,12-14，高尔基体15微管4 和肌动蛋白16 细胞骨架，内体17 顶膜复合体的组分1,18，以及其他斑马鱼胚胎中的亚细胞结构 体内到目前为止，关于这些细胞器功能的大部分认识都来源于对培养细胞中其行为的研究。然而 体外 研究已为细胞生物学提供了巨大洞见，但培养条件下的细胞并不能完全代表生物体内细胞的复杂性 体内 因此不能必然反映细胞器亚结构的功能与动态变化 体内斑马鱼胚胎提供了一种可行的 体内 研究亚细胞动态的替代方法。
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方案
所有动物实验均按照德国上巴伐利亚州政府的当地法规进行。
1. 细胞器及其他亚细胞结构的标记
注意： 此处描述了可荧光标记中心体、线粒体和细胞膜的遗传报告基因构建体。
- 采用常规克隆方法29构建可荧光标记中心体和线粒体的融合蛋白。将斑马鱼centrin4（cetn4）的编码序列与荧光蛋白2（FP）（如黄色荧光蛋白）同框克隆，以生成cetn4-YFP。将细胞色素c氧化酶亚基VIII的线粒体靶向序列与荧光蛋白（如青色荧光蛋白）同框克隆，以生成mitoCFP9-11。
- 为将融合蛋白（cetn4-YFP或mitoCFP）的表达限制在斑马鱼胚胎的特定细胞中（例如神经元或肌细胞），使用双组分Gal4-UAS表达系统26,27。首先构建UAS报告载体。使用常规方法将融合蛋白序列克隆至UAS表达载体中，位于Gal4结合位点UAS盒（变体范围为1x至14x UAS，参见讨论部分）26,27,30和最小启动子（来自鲤鱼βactin基因的E1b基础启动子）下游，从而构建UAS:cetn4-YFP和UAS:mitoCFP。
注意：若需为建立稳定转基因品系而制备UAS报告载体，则还需克隆额外元件（见下文<....
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结果
此处直接比较并对比了宽场显微镜与共聚焦显微镜在活体斑马鱼胚胎中对线粒体和中心体成像的应用。根据待观察细胞器动态变化的细胞所在位置以及特定亚细胞事件的固有频率，通常选择宽场显微镜或共聚焦显微镜更为合适。我们对位于胚胎表面的RB神经元以及位置更深的视网膜细胞中的细胞器进行了成像。由于RB神经元位置表浅且具有二维几何结构，因此适合采用宽场显微镜和共聚焦显微镜进行成像图 2）。然而，使用共聚焦显微镜获取图像的速度显著较慢，可能导致对特定亚细胞事件动态变化的低估（例如， 线粒体的运动， 图2C,D）。通过宽场显微镜获取的视网膜细胞图像由于来自大体积组织的荧光信号干扰，导致焦平面内的细节对比度较差。而共聚焦显微镜的光学切片能力显著提高了图像对比度（图3).
为了实现细胞器与细胞膜.......
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讨论
在此，我们展示了Gal4-UAS表达系统在斑马鱼胚胎体内对特定细胞类型的线粒体、中心体以及细胞膜进行荧光标记的多功能性。in vivo 许多用于标记其他细胞器或亚细胞结构的荧光融合蛋白已在已发表的文献中报道，可从相应实验室、商业来源或非营利性质粒库（例如 Addgene）获得。设计新的荧光融合蛋白时，需考虑多个参数，包括选择何种荧光蛋白（FP），以及将FP融合至目标蛋白的氨基末端还是羧基末端。关于荧光融合蛋白构建的更深入讨论，读者可参考该主题的详细综述文章49-51。
我们强调了三种利用UAS驱动的转基因实现融合蛋白共表达的策略。使用多个独立的UAS报告基因构建体，可以在无需额外克隆的情况下组合不同的现有报告基因构建体，且报告基因的表达水平也可独立调节。然而，当在单个构建体中使用多个UAS表达盒或双向UAS表达盒时，可实现更高水平的共表达。由于荧光蛋白（FPs）被用作标签，因此验证共表达相对容易。需要注意的是，其他多顺反子表达方法也存在，包括使用内部核糖体进入位点（IRES）。40 和病毒2A肽
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
P.E. 受德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，DFG）研究培训组1373和慕尼黑工业大学研究生院（TUM-GS）资助。G.P. 受慕尼黑工业大学研究生院（TUM-GS）资助。L.T. 受欧洲分子生物学组织（EMBO）奖学金（EMBO ALTF 108-2013）资助。D.P. 在斑马鱼方面的研究受德国研究基金会（DFG）通过“神经退行性疾病的分子机制”特别研究领域（SFB 596）、整合蛋白质科学中心（慕尼黑）以及欧洲共同体第七框架计划（FP7/2007-2013）资助，项目编号为200611（MEMOSAD）。他目前是纽约干细胞基金会-德鲁肯米勒研究员，此前曾获得德国利奥波第那科学院（Leopoldina）的奖学金支持。L.G. 受德国研究基金会（DFG）通过SFB 870“神经环路的组装与功能”项目A11的经费支持。
我们感谢Kristina Wullimann对斑马鱼养殖设施的维护，感谢Yvonne Hufnagel提供的技术支持，以及感谢Thomas Misgeld对本文手稿的评论。我们感谢R. Köster（布伦瑞克工业大学）提供了M1 Medusa载体（pSKmemmRFP:5xUAS:H2B-CFP:5xUAS:Centrin2-YFP），我们从中克隆出Centrin-YFP；同时感谢S.C. Suzuki和T. Yoshimatsu（华盛顿大学）提供了14xUAS:MA-cerulean表达盒，我们利用该元件构建了....
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 琼脂糖（2-羟乙基琼脂糖） | Sigma-Aldrich | A4018-10G | 低凝胶温度VII型 |
| 加热块 | Eppendorf | Thermomixer compact | |
| Ca(NO3)2 硝酸钙水合物，99.996% | Aldrich | 202967-50g | 制备30倍浓度的Danieau溶液 |
| CCD相机 | Qimaging | Retiga Exi Fast 1394 | |
| 陶瓷涂层杜蒙特#5镊子 | 杜蒙特 - 精密科学工具 | 11252-50 | #5 镊子 |
| 共聚焦激光扫描显微镜 | Olympus | FV1000 Fluoview | |
| 培养皿加热器 | Warner Instrument Corporation | DH-35 | 加热环 |
| 三氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐 | PharmaQ | Tricaine PharmaQ-25g | 三卡因（麻醉剂） |
| 荧光解剖显微镜 | Leica | M205 FA | |
| GeneClean试剂盒 | MP Biomedicals | 111001200 | |
| 玻璃底培养皿 | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | 35 mm 培养皿，14 mm 微孔，No. 0 盖玻片 |
| 玻璃针 | World Precision Instruments Inc. | TW100F-4 | 用于显微注射 |
| HEPES | Sigma | H3375-250g | 制备30倍浓度的Danieau溶液 |
| 高真空润滑脂 | 道康宁 | DCC000001242 150克 | 二氧化硅油脂 |
| KCl 99% | Sigma-Aldrich | S7643-5kg | 制备30倍浓度的Danieau溶液 |
| MgSO₄4.7H2O 七水合硫酸镁 98+% A.C.S 试剂 | Sigma-Aldrich | 230291-500g | 制备30倍浓度的Danieau溶液 |
| 显微注射仪 | Eppendorf | FemtoJet | |
| 显微注射尖端 | Eppendorf | 930001007 | 0.5-20 μl |
| 显微操作仪 | Maerzhaeuser Wetzlar | MM33 Rechts/00-42-101-0000/M3301R | |
| 微移液管夹持器 | 细胞内 | P/N 50-00XX-130-1 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 体外转录试剂盒 | Ambion | AM1340 | 转录 PCS-转座酶 |
| NaCl BioXtra >99.5% | Sigma-Aldrich | P9541-1kg | 制备30倍浓度的Danieau溶液 |
| Nano分光光度计 | 测量 DNA/RNA 浓度 | ||
| 拉针仪 | Sutter Instrument | P-1000 | 弗莱明/布朗 |
| NIR Apo 40x/0.80W | 尼康 | 水浸锥形物镜 | |
| N-苯基硫脲 Ⅰ级，约98% | Sigma | P7629-10G | PTU（抑制色素形成） |
| 培养皿 | Sarstedt AG | 821472 | 92 x 16mm |
| 塑料模具 | 自适应科学工具 | TU-1 | 用于显微注射 |
| 有机玻璃盖板（带孔） | 定制 | Plexiglas 盖板上的孔应比水浸锥形物镜的直径大 3 mm | |
| 茶漏（塑料） | 收集斑马鱼卵 | ||
| 温度控制器 | Warner Instrument Corporation | TC-344B | 双自动温度控制器 |
| 移液管 | Sarstedt AG | 86.1171 | 3.5 mL 塑料移液管 |
| UMPlanFI 100x/1.00W | Olympus | 水浸锥形物镜 | |
| UMPlanFLN 20x/0.50W | 奥林巴斯 | 水浸锥形物镜 | |
| 宽场显微镜 | Olympus | BX51WI | |
| PTU（50倍浓缩液） | 将76 mg PTU溶解于50 ml蒸馏水中 室温下剧烈搅拌 -20℃保存 oC，每份1 ml分装 以1倍工作液浓度使用 | ||
| Tricaine（20倍浓缩液） | 将200 mg Tricaine溶于48 ml蒸馏水中 加入 2 ml 1 M Tris 碱（pH 9） 调节至 pH 7 -20℃保存 oC，每份1 ml分装 以1倍工作液浓度使用 | ||
| Danieau's 溶液（30倍浓缩液） | 1,740 mM NaCl 21 mM KCl 12 mM MgSO₄4.7H2O 18 mM Ca(NO₃)₂3)2 150 mM HEPES缓冲液 蒸馏水加至 1 L 4°C 保存 oC 使用0.3倍工作浓度的溶液 |
参考文献
- Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube. Nat Neurosci. 13 (6), 673-679 (2010).
- Distel, M., Hocking, J. C., Volkmann, K., Koster, R. W.
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重印与许可
