La produzione su scala di laboratorio di proteine eucariotiche con appropriate modifiche post-traduzionali rappresenta un ostacolo significativo. Ecco un protocollo robusto con rapida instaurazione e inversione di tendenza per l'espressione proteica utilizzando un sistema di espressione nei mammiferi. Questo sistema supporta la selettività degli amminoacidi, la marcatura selettiva delle proteine e i modulatori di piccole molecole della composizione dei glicani.
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Articolo metodologico
High Yield Espressione di proteine ricombinanti umane con il Transient Trasfezione delle cellule HEK293 in sospensione
In questo articolo
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Sommario
Abstract
L'arte di produrre proteine ricombinanti con complesse modificazioni post-traslazionali rappresenta una sfida importante per gli studi di struttura e funzione. L'istituzione rapida ed elevata recupero da linee cellulari di mammiferi transiente transfettate indirizzi questa barriera ed è un mezzo efficace per esprimere le proteine che sono naturalmente incanalati attraverso l'ER e Golgi-mediata via secretoria. Qui è un protocollo per l'espressione della proteina con il HEK293F umano e linee cellulari HEK293S transfettate con un vettore di espressione di mammifero progettato per rese elevate di proteine. L'applicabilità di questo sistema è dimostrata utilizzando tre glicoproteine rappresentative che hanno espresso con rese tra 95-120 mg di proteina purificata recuperato per litro di cultura. Queste proteine sono la FcγRIIIa umana e sialyltransferase α2-6 ratto, ST6GalI, sia espressa con una fusione GFP N-terminale, così come la immunoglobulina umana non modificato G1 Fc. Questo robusto sistema utilizes un mezzo privo di siero che è adattabile per l'espressione di proteine e carboidrati per studi strutturali mediante spettrometria di massa e spettroscopia di risonanza magnetica nucleare isotopicamente arricchiti. Inoltre, la composizione della N-glicani può essere regolato aggiungendo una piccola molecola di evitare talune modifiche glicani in modo che non riduca la resa.
Introduzione
Produrre rese elevate di proteine umane opportunamente piegati e post-traduzionali modificati per l'analisi dettagliata della struttura e della funzione rimane una sfida significativa. Un gran numero di sistemi di espressione sono disponibili che producono proteine ricombinanti con funzione e il comportamento di tipo nativo. Sistemi di espressione batterici, prevalentemente ceppi Escherichia coli, rappresentano gli strumenti più accessibili e più comunemente utilizzati in ambito di ricerca, grazie alla semplicità di questi sistemi di espressione, però lieviti, piante, insetti e mammiferi sono anche descritti 1-4. Tuttavia, la maggior parte....
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Protocollo
Questo protocollo è sufficiente per l'espressione utilizzando HEK293F o cellule HEK293S.
1. Istituzione cellulare
- Cultura Inoculazione
Nota: Tutte le procedure di coltura di manipolazione devono essere effettuate in una struttura BSL-2 ed ogni articolo portato nel cabinet biosicurezza devono essere sterilizzati a spruzzo con etanolo al 70% in soluzione acquosa.- Azionare l'agitatore incubatore a 135 giri al minuto, l'80% di umidità e al 8,0% di CO 2 e 37 ° C. Turn "on" la lampada UV del cabinet biosicurezza, almeno 1 ora prima di lavorare. Preriscaldare le bottiglie sigillate Piano A e Piano B in un bagno d'....
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Risultati
Espressione della proteina ad alto livello e la purezza
Questo sistema di espressione ottimizzato generato un alto rendimento di proteine glicosilate. Un modello tipico è mostrato nell'espressione di IgG1-Fc (Figura 1). In questo caso, Giorno 0 è il giorno trasfezione seguito da Day 1 (diluizione) e nei giorni successivi della cultura fino al giorno 5. espressione della proteina viene analizzata utilizza.......
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Discussione
Questo protocollo illustra l'espressione della proteina tramite la trasfezione transiente di cellule HEK293F o S. Le condizioni ottimali di trasfezione stabilite nei laboratori Barb e Moremen utilizzano una combinazione critica di concentrazioni di densità delle cellule e reagenti per ottenere un'elevata efficienza di trasfezione. Considerazioni critiche in sede di attuazione di questo protocollo sono: il mantenimento di una cultura stabile prima di trasfezione (con la cultura coerente tempi raddoppio); trasfezi.......
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Dichiarazioni
Tutti gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti in questo manoscritto.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dalle sovvenzioni K22AI099165 (AWB), P41GM103390 (KWM) e P01GM107012 (KWM) dal National Institutes of Health, e da fondi del Roy J. Carver Dipartimento di Biochimica, Biofisica e Biologia Molecolare presso la Iowa State University . Il contenuto di questo lavoro è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale della NIH.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Armadio di biosicurezza | NuAire, Inc. | CellGard ES NU-S475-400 | Classe II, Tipo A2 Agitatore di incubazione per cabina di sicurezza biologica |
| INFORS HT | Multitron Cell | ||
| Medium A: Espressione FreeStyle Medium | Life Technologies | 12338-018 | |
| Medium B: ExCell 293 Terreno senza siero | SIGMA | 14571C | |
| 125 Erlenmeyer Flask con tappo ventilato | Corning Incorporated/Life Sciences | 431143 | |
| 250 Erlenmeyer Flask con tappo ventilato | Corning Incorporated/Life Sciences | 431144 | |
| FreeStyle HEK 293F Cells | Life Technologies | R790-07 | |
| 1 ml Pipetta sierologica monouso | Fisher Scietific | 13-676-10B | |
| 10 ml Pipetta sierologica monouso | Fisher Scietific | 13-676-10J | |
| 25 ml Pipetta sierologica monouso | Fisher Scietific | 13-676-10K | |
| Pipettor (Pipet-Aid XP) | Drummond Scientific | 161263 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Scientific | SV30084.01 | |
| Conteggio dei vetrini | Bio-Rad | 145-0011 | |
| TC20 Contatore di celle automatizzato | Bio-Rad | 145-0102 | |
| Polietilenimmina (PEI) | Polysciences Inc. | 23966 | Preparare la soluzione madre alla concentrazione di 1 mg/ml in un tampone contenente 25 mM di acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonico (HEPES) e 150 mM di NaCl (pH 7,5). Sciogliere completamente il PEI; sterilizzare fino a 0,22 μ M filtrare e conservare a -20 °C. |
| Acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanosolfonico (HEPES) | EMD Chemicals Inc. | 7365-45-9 | |
| Filtro per siringa da 25 mm, 0,22 &; M | Fisher Scietific | 09-719A | |
| Trisaminomethane (Tris base) | Fisher Scietific | BP152-1 | |
| XL1-Blue | Stratagene | 222249 | |
| Trypton | Fisher Scietific | BP1421-2 | |
| Estratto di lievito | Fluka Analytical | 92144 | |
| Cloruro di sodio | BDH sostanze chimiche | BDH8014 | |
| Kit di purificazione plasmidico | QIAGEN | 12145 | |
| Valproic (VPA) | SIGMA | P4543 | Preparare una soluzione madre di 220 mM in acqua, sterilizzare per passaggio attraverso un filtro sterile da 0,22 mm e conservare a -20 ° C |
| Centrifuga | Thermo Scientific | EW-17707-65 | |
| Proteina A-Sefarosio | colonna SIGMA | P9424 | |
| Ni-NTA superflow | QIAGEN | 30430 | |
| 3-(N-morfolino)acido propansolfofonico (MOPS) | Fisher Scietific | BP308-500 | |
| Glicina | Fisher Scietific | BP381-500 | |
| 10 kDa cut-off del peso molecolare Amicon® Filtri ultra centrifughi | Millipore | UFC901096 | |
| Sodio dodecil solfato | ALDRICH | L3771 | |
| Beta-mercaptoetanolo | ALDRICH | M6250 | |
| Glicerolo | SIGMA | G5516 | |
| Precision Plus Protein All Blue Standards | Bio-Rad | 161-0373 | |
| Acido acetico, glaciale | Fisher Scietific | 64-19-7 | |
| coomassie blu brillante | Bio-Rad | 161-0406 | |
| MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO | Applied Biosystems | ||
| 15N marcato L-tirosina | ALDRICH | 332151 | |
| 15N marcato L-lisina | ALDRICH | 592900 | |
| Non marcato L-Fenilalanina | SIGMA-ALDRICH | P2126 | |
| 13C6-Glucosio | ALDRICH | 389374 | |
| 2- deossi-2-fluoro-l-fucosio | SANTA CRUZ Biotecnologia | sc-283123 |
Riferimenti
- Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl Microbiol Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).
- Sorensen, H. P., Mortensen, K. K.
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Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension
Posted by JoVE Editors on 9/08/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension. The Authors section was updated. from:
Ganesh P. Subedi1
Roy W. Johnson2
Heather A. Moniz2
Kelley W. Moremen2
Adam Barb1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia
to
Ganesh P. Subedi1
Roy W. Johnson2
Heather A. Moniz2
Kelley W. Moremen2
Adam W. Barb1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia
