本文介绍了一种通过特异性siRNA介导的mRNA耗竭，随后进行免疫荧光分析，以评估小鼠卵母细胞中减数分裂纺锤体组装与结构的实验方案。该方案适用于 体外 卵母细胞中不同纺锤体和/或微管组织中心相关因子的转录本耗竭及其功能评估
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本文内容
摘要
摘要
配子减数分裂过程中染色体分离的错误可导致非整倍体，受精后会将这种异常传递给胚胎。发育中胚胎出现的非整倍体现象被认为是妊娠丢失和先天性出生缺陷（如唐氏综合征）的主要原因。染色体的准确分离在很大程度上依赖于微管纺锤体结构的形成，然而该过程在哺乳动物卵母细胞中仍知之甚少。引人注目的是，减数分裂纺锤体的组装机制不同于有丝分裂，并且至少部分受到独特的微管组织中心（MTOC）调控。对MTOC相关蛋白的评估可为调控减数分裂纺锤体形成与组织的分子机制提供重要见解。本文中，我们描述了分离小鼠卵母细胞并利用siRNA介导的方法耗竭MTOC相关蛋白以检测其功能的技术流程。此外，我们还介绍了卵母细胞固定及免疫荧光分析的实验条件，用于评估减数分裂纺锤体的形成与组织状态。
引言
减数分裂是一种独特的分裂过程，发生在配子（卵母细胞和精子）中，包括两次连续的分裂，其间不发生DNA合成，分别在减数分裂I和减数分裂II中分离同源染色体和姐妹染色单体1。卵母细胞减数分裂过程中染色体分离错误可导致非整倍体，这种异常会在受精时遗传给胚胎。值得注意的是，随着母亲年龄的增长，发育中胚胎的非整倍体发生率增加，这是女性先天性出生缺陷和妊娠丢失的主要原因1,2，因此凸显了深入理解减数分裂过程中非整倍体分子基础的重要需求。
细胞分裂过程中，染色体的正确分离高度依赖于微管纺锤体结构的组装以及染色体与微管之间稳定相互作用的建立，以确保染色体正确连接至纺锤体的两极。重要的是，哺乳动物卵母细胞中的减数分裂纺锤体形成不同于体细胞的有丝分裂，其由缺乏中心粒的独特微管组织中心（MTOC）所调控3,4。对于微管成核和组织至关重要的蛋白质定位于卵母细胞的MTOC，其中包括催化微管组装的γ-微管蛋白。此外，pericentrin作为一种关键的支架蛋白，在MTOC处结合并锚定γ-微管蛋白及其他相关因子5。值得注意的是，我们的研究表明，关键MTOC相关蛋白的缺失会破坏卵母细胞中减数分裂纺锤体的正常组织，并导致染色体分离错误，而此类错误无法被纺锤体组装检验点（SAC）完全识别和纠正6,7。因此，那些不足以触发减数分裂阻滞的纺锤体稳定性缺陷，仍会显著增加非整倍体发生的风险。尽管MTOC在纺锤体组....
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方案
本方案已获得乔治亚大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。
1. 准备工作
- 进行卵母细胞培养时，购买或新鲜配制最低必需培养基（MEM），并按照表1所述添加3 mg/ml牛血清白蛋白（BSA）。将一个聚苯乙烯瓶置于电子天平上（去皮归零），按顺序加入除BSA外的所有试剂，并通过称重用MQ水定容至总重量250 g。随后加入BSA，待其完全溶解后过滤除菌。
注意：上述MEM培养基需在含5% CO2、5% O2和90% N2的医用气体混合物环境中平衡，并用于细胞培养。然而，也可使用其他培养基（例如 CZB），可在大气条件下以5% CO2进行细胞培养。 - 进行卵母细胞显微注射时，购买或配制M2培养基。
- 将孕马血清促性腺激素（PMSG）配制为5 IU/100 µl的浓度。
- 购买siRNA原液并重悬至1 µM的工作浓度。
2. 小鼠卵母细胞的收集
- 第1天： 为促进卵巢卵泡发育并增加排卵前卵泡数量，在采集卵母细胞前48小时，对雌性小鼠腹腔注射5 IU的PMSG。
- 第3天： 用于....
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结果
将siRNA显微注射到卵母细胞中，可有效降解mRNA并导致相应蛋白质的耗竭，从而实现对不同靶因子进行高效且高度特异的功能检测 in vitro。随后，通过免疫荧光染色对siRNA注射卵母细胞中的特定表型进行分析，并验证蛋白质的耗竭效果。在本示例中，利用DAPI对单个卵母细胞进行荧光标记，并结合抗微管蛋白（anti-tubulin）和抗中心粒周围蛋白（anti-pericentrin）抗体，实现了：（i）确认中心粒周围蛋白（pericentrin）的耗竭；以及（ii）对对照组和PCNT-耗竭卵母细胞中染色质和减数分裂纺锤体构型的全面评估。
在图27中展示了显微注射非特异性对照或Pcnt siRNA的卵母细胞的代表性免疫荧光图像。经过17小时培养后，大多数对照组卵母细胞发育至减数分裂II期，其纺锤体结构有序，染色体排列整齐，且在纺锤体两极可见明亮的中心粒周围蛋白（pericentrin）标记信号（图2A）。值得注意的是，在注射Pcnt<.......
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讨论
尽管存在多种将外源核酸导入体细胞的方法，例如电穿孔和转染，显微注射仍是将RNA分子递送至转录静息态小鼠卵母细胞的最优方法。本方案提供了一种有效的操作流程 体外 通过耗竭特定mRNA，可对卵母细胞中与纺锤体和/或微管组织中心（MTOC）相关因子进行功能测试。该方法可实现高效的转录本耗竭，且具有高度可适性。尽管本研究使用siRNA特异性靶向 Pcnt 转录本，类似条件可用于靶向几乎所有目的基因。
该方案的多个环节，包括卵母细胞的收集、培养和操作，均需经过练习和积累经验，以维持卵母细胞质量并避免技术性假象。操作过程中应迅速而谨慎，避免培养基pH值和/或温度发生波动。对少量卵母细胞进行显微注射，并使用配备加热载物台的显微注射系统，有助于减少不利的温度变化。建议使用预先验证过的siRNA，且高效的靶蛋白敲低效果需通过免疫荧光或Western blotting加以确认。针对不同的目的基因，部分步骤可能需要调整。例如，在含米力农的培养基中推荐采用24小时的“维持期”，该时长适用于多种siRNA。然而，对于丰度较高的mRNA和/或半衰期特别长的靶蛋白，该时间可能.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露
致谢
本研究部分得到了佐治亚大学以及美国国立卫生研究院向 MMV 提供的基金（HD071330）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| 孕马血清促性腺激素（PMSG） | EMD Biosciences | 367222 | |
| 最低必需培养基（MEM） | *配方见表1 | ||
| Earle's 平衡盐溶液（10倍浓度） | Sigma | E-7510 | |
| 碳酸氢钠 | Sigma | S-5761 | |
| 丙酮酸钠盐 | Sigma | P-5280 | |
| 青霉素G钾盐 | Sigma | P-7794 | |
| 硫酸链霉素 | Sigma | S-9137 | |
| L-谷氨酰胺 | Sigma | G-8540 | |
| EDTA二钠盐二水合物 | Sigma | E-4884 | |
| 必需氨基酸（50倍浓度） | Gibco | 11130-051 | |
| MEM维生素混合物（100倍浓度） | Sigma | M-6895 | |
| 酚红溶液 | Sigma | P-0290 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma | A1470 | |
| 米力农 | Sigma | M4659 | |
| 胎牛血清（FBS） | Hyclone | SH30070.01 | |
| 含 Hepes 的 EmbryoMax M2 培养基 | EMD Millipore | MR-015-D | |
| 靶向 Pericentrin 的 siRNA | Qiagen | GS18541 | |
| 阴性对照 siRNA | Qiagen | SI03650318 | |
| 多聚甲醛（16% 溶液） | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton-X | Sigma | T-8787 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Hyclone | SH30028.02 | |
| 抗 Pericentrin 抗体（兔源） | Covance | PRB-432C | |
| 抗乙酰化 α-微管蛋白抗体（鼠源） | Sigma | T-6793 | |
| Alexa Fluor 488 标记山羊抗兔抗体 | Invitrogen | A-21430 | |
| Alexa Fluor 555 标记山羊抗鼠抗体 | Invitrogen | A-11017 | |
| 主要设备 | |||
| 体视显微镜（SMZ 800） | Nikon | ||
| 正置荧光显微镜 | Leica Microsystems | ||
| 倒置显微镜 | Nikon | ||
| Femtojet 显微注射系统 | Eppenforf | ||
| 显微操作器 | Eppendorf | ||
| 显微注射针（femtotips） | Eppendorf | 930000035 | |
| 持卵管（VacuTip） | Eppendorf | 930001015 | |
| 塑料器皿 | |||
| 35 mm 培养皿 | Corning Life Sciences | 351008 | |
| 4 孔板 | Thermo Scientific | 176740 | |
| 96 孔板 | Corning Life Sciences | 3367 | |
| 0.45 mm CA 滤器系统 | Corning Life Sciences | 430768 |
参考文献
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
- Hassold, T. J., Hunt, P. A. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet.
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重印与许可
