Introduction
Arenavirus er en familie af kappeklædte, enkeltstrengede RNA-vira, der vedligeholdes primært i gnavere i naturen 1-3. Mens disse vira typisk etablere en asymptomatisk, vedvarende infektion i gnavere reservoirer 1,2, kan de forårsage alvorlig sygdom hos mennesker 3. Vigtige patogene arter omfatter den nye verden Junin virus (JUNV) 4 og den gamle verden Lassa virus 5, som er de ætiologiske agenter for argentinsk hæmoragisk feber i Sydamerika og Lassa feber i Afrika, hhv. Lymfocytisk choriomeningitis virus (LCMV), det prototypiske virus af familien 6, har en verdensomspændende distribution og er ansvarlig for en række sygdomstilstande, herunder aseptisk meningitis hos immunkompetente individer 6, alvorlige fødselsdefekter i det udviklende foster 7, eller høj dødelighed hos immunsupprimerede individer efter fast organtransplantation 8,9. Manglen på USAFood and Drug Administration (FDA) -godkendte vacciner eller effektive antivirale midler til at bekæmpe disse vira fremhæver det kritiske behov for at udvikle nye strategier til terapeutisk målrettet disse nye / re-nye patogener.
Den arenavirus genomet består af to enkeltstrengede RNA-segmenter, den store (L) (~ 7.2 kb) og lille (S) (~ 3,6 kb) segmenter 10. S-segmentet koder for den virale nukleoprotein (NP) og kappeglycoprotein (GP), mens L-segmentet koder for den virale polymerase (L) og matrix protein (Z). S genomiske RNA-segmenter (vRNA'er) L og er pakket i virioner 10-12. Det indledende trin af arenavirus infektion er binding af virale partikler til værtsceller via en interaktion mellem det virale GP og dens tilsvarende værtscellereceptorer som for JUNV, indbefatter den humane transferrin-receptor 1 (hTfR1) 13,14. Efter fastgørelse bliver JUNV partikler suges ind i cellen via clathrin endocytose 15.Partikler derefter trafikdata til den sene endosom, hvor den lave pH af dette rum udløser aktiveringen af GP 16,17. Når den er aktiveret, GP-kodet fusionspeptiddele indsatserne i den endosomale membran, indledning fusion mellem de virale og endosomale membraner. Vellykket fusion resulterer i frigivelse af virion-emballerede vRNA'er ind i cytoplasmaet, hvor de tjener som templates for genomisk replikation og transkription. Når tilstrækkelige mængder af virale strukturelle proteiner og vRNA'er genereres, nye partikler samle og knop fra den inficerede celle for at fuldføre livscyklus 18.
For at lette opdagelsen af nye strategier til terapeutisk målrette patogene arenavirus har vores gruppe fokuseret på identifikation af værten faktorer, der er afgørende for virus formering, men undværes for værten. I denne forbindelse definerer den præcise fase (r) af den virale livscyklus kontrolleres af sådanne vært faktorer er nødvendige for at styreudvikling af antivirale strategier. Heri beskriver vi en kvantitativ (q) RT-PCR-baseret assay, der kan anvendes til at måle arenavirus-cellebinding til at identificere, om udvalgte værtsproteiner og / eller antivirale molekyler påvirke denne indledende fase af viral indtrængen 19. Alternative metoder til at måle arenavirus-cellebinding har featured virioner mærket med biotin 20, fluorescerende farvestoffer 21, eller radioaktive isotoper 22. Ulemper ved disse fremgangsmåder kan indbefatte kravet om store mængder input-virus (f.eks høje infektionsmultipliciteter (MOI)), anvendelse af radioaktivitet, og / eller yderligere håndteringstrin at forberede input virus (fx koncentration og / eller mærkning af virus) . Især brugen af høje MOI gør det vanskeligt at skelne produktiv versus uproduktive vedhæftede begivenheder 15,23. Det QRT-PCR-baseret assay er beskrevet her, kan detektere vedhæftede begivenheder bruge så få som 20 plak forMing enheder (PFU) af virus, hvilket svarer til en MOI på 0,0004 for en 48-brønds plade. Derfor er den stærke følsomheden af analysen overvinder kravet om højt MOI samt eventuelle virus mærkning eller koncentrering. Endvidere kan assayet være i) indrettet til at måle virion endocytose samt frigivelse af virus-genomet ind i cytoplasmaet efter fusion og ii) skræddersyet til anvendelse med andre virus gennem udvikling af virusspecifikke QRT-PCR-reagenser (for eksempler, se 24-27).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: Det er afgørende, at den beskrevne protokol udføres med streng præ-PCR-teknik (se 28 for en fremragende overblik over, hvordan at oprette en præ-PCR laboratorium og hvordan man udføre eksperimenter ved hjælp god pre-PCR-teknik). Det er bydende nødvendigt, at alle reagenser og udstyr er fri for amplificeret DNA, der indeholder qPCR målsekvensen og at passende kontroller er på plads til at opdage en sådan forurening. En oversigt over protokollen er vist i figur 1.
1. Forbered Medier og Seed Celler i 48-brønds plader
- Forbered 500 ml komplet Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) indeholdende 10% føtalt bovint serum, 1% penicillin-streptomycin og 1% HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazin-N-2-ethansulfonsyre) bufferopløsning ved tilsætning af 50 ml af varmeinaktiveret føtalt bovint serum og 5 ml af hver af en 100x penicillin-streptomycin og 100x HEPES bufferopløsning til en 500 ml flaske DMEM. Dette reagens kan opbevares ved 476; C i flere måneder.
- Seed 2,5 x 10 4 Vero E6 celler per brønd i en 48-brønds vævskulturplade i et endeligt volumen på 500 pi af komplet DMEM. Inkubér pladen ved 37 ° C i en fugtig inkubator indeholdende 5% CO2 i 10 til 18 timer.
- Seed pladen ved afslutningen af arbejdsdagen. Test hver virus prøve i enten to eller tre gange brønde.
Bemærk: Mens en 48-brønd-baseret platform for dette assay er beskrevet, bør det være muligt at skalere assayet ned til anvendelse i 96- eller 384-brønds plader.
- Seed pladen ved afslutningen af arbejdsdagen. Test hver virus prøve i enten to eller tre gange brønde.
2. Carry Out Virus-cellebinding
Bemærk: Den virus, som benyttes i denne protokol, JUNV stammen Candid # 1 (C # 1), er blevet anvendt som en levende svækket vaccine til forebyggelse af JUNV sygdom 29. JUNV C # 1 blev afledt fra den virulente stamme JUNV XJ via seriel passage både in vivo og in vitro og adskiller sig fra den parentale XJ stamme ved 12 aminosyrer 30. because JUNV C # 1 er et bio-niveau (BSL) -2-rated patogen, skal beskrives for denne sektion arbejde udføres ved hjælp af passende BSL-2 praksis 31. Dette omfatter brug af personlige værnemidler (f.eks øjenbeskyttelse, laboratoriekittel, dobbelt handsker), en klasse II biosikkerhed kabinet, og sikre, at alt personale har modtaget den institutionelle uddannelse og godkendelser, der kræves til sikkert at håndtere denne organisme.
- Fortynd JUNV C # 1 prøve (r), der skal testes til den ønskede PFU eller fokusere danner enheder i iskold komplet DMEM og gemme på is indtil klar til at tilføje til hver brønd.
Bemærk: Som et alternativ til at gennemføre de bindende studier med virus fortyndet i komplet DMEM, bruge et minimalt medium, der indeholder PBS med en reduceret serumkoncentration (2%) og en passende buffer, om serum kan forårsage interferens med virus vedhæftet fil. Lignende tilbehør protokoller for alternative vira har rapporteret anvendelse af RPMI 1640 medium uden bicarbonate indeholdende 0,2% bovint serumalbumin, 10 mM (2- (morpholino) ethansulfonsyre) og 10 mM HEPES, pH 6,8 32. Denne binding medier kan være overlegen til at forhindre pH-ændringer, der kan opstå, når mediet fjernes fra CO 2 -Miljø af inkubatoren.- Inokulering brønde med PFU i området fra 200 til 2.000 begrænse uproduktive vedhæftede begivenheder. Som vist i figur 2, dette assay kan detektere binding under anvendelse så få som 20 PFU (eller så mange som 2 x 10 6 PFU).
- Opret en master mix af virus til podning på celler. Hvert virus prøve vil blive podet på dobbelte brønde i et volumen på 50 pi per brønd. Derfor, hvis der ønskes tilsætning af 2.000 PFU'er af virus per brønd, fortyndet 4.800 PFU'er i et totalvolumen på 120 pi iskold fuldføre DMEM.
- For at kontrollere for specificiteten af analysen, bruge en matchede par kinesisk hamster ovarie cellelinier, der enten ikke udtrykker TfR1 (TRVb) eller express hTfR1 (TRVb-1) som JUNV tilknytning til disse celler bør enten reduceres eller ikke, henholdsvis 13,33. Alternativt behandle celler med en protease, såsom proteinase K for at forhindre arenavirus fastgørelse 34 eller post 35. Opløselig hTfR1 eller monoklonalt antistof ch128.1, som er specifik for hTfR1, kunne også betragtes som de er kendt for at blokere adgang for JUNV i celler 13,36. Derudover kan forbehandling af celler med fri mannose 14 eller inkubering af partikler med JUNV-specifikke neutraliserende antistoffer 37 inhiberer virus post.
- Bemærk dog, at disse sidstnævnte reagenser og tilgange trods blokere JUNV indrejse, ikke er blevet bekræftet til at blokere vedhæftet fil, selv om dette er en sandsynlig forklaring. Den her beskrevne protokol kan bruges til formelt at afgøre, om disse forskellige tilgange indvirkning virion vedhæftet fil.
- Fjern pladerne fra 37 ° C inkubator ogsted enten i et 4 ° C køleskab eller på is i 15 minutter for at inhibere evnen hos de udpladede celler til at udføre endocytose.
- Dernæst aspireres den komplette DMEM fra hver brønd og hurtigt vaske hver brønd to gange med 100 pi iskold PBS (phosphatpufret saltvand) pH 7,4. Derefter tilsættes 50 pi af præ-fortyndet virus prøver (forberedt i trin 2.1) til de relevante brønde.
- Wrap pladen i plastfolie og straks placere enten tilbage på is eller i et 4 ° C køleskab i 1 til 1,5 timer for at tillade virus binding at forekomme. Hold pladen, vaskebuffer, og virus prøver kold ved 4 ° C i hele dette trin.
- Efter afslutningen af C inkubation 4 °, opsug virusinokulum og vask hver brønd 3 gange med 200 pi iskold PBS.
3. Viral RNA-ekstraktion
- Oprens viralt RNA fra JUNV C # 1-partikler knyttet til monolagene ved hjælp af kommercielt kit (f.eks RNeasy Mini kit) according med producentens protokol. Konkret følge "rensning af total RNA fra dyreceller ved hjælp af spin-teknologi protokol" på side 23-28 i RNeasy Mini-håndbogen (4 th udgave, april 2006) med de ændringer, der er anført nedenfor.
- Lysere cellerne som instrueret i trin 1B ved tilsætning 350 pi lysisbuffer RLT direkte til hver brønd. Bland bufferen flere gange for at sikre cellelyse. Bemærk, at celler let lysere i denne buffer og fuldstændig lyse kan verificeres ved at se brønde under et omvendt mikroskop.
- Overfør den resulterende cellelysat til kittet søjle (trin 3a) og følge resten af protokollen som beskrevet. På dette tidspunkt, er viruset blevet neutraliseret af lysepuffer så kan gøres de resterende trin i protokollen uden for klasse II-biosikkerhed kabinet billede kit rørene blev ikke kontamineret med infektiøst virus.
- Indbefatter det valgfrie trin 9 fra fabrikantens protokol, som er en additional centrifugering af spin-søjle for at fjerne enhver mulig overførsel af Buffer RPE.
- I det sidste trin producentens protokol (trin 10) elueres det oprensede RNA fra spin-søjle under anvendelse af 30 pi nuclease-free Hedeselskabet 2 O. Store RNA ved -80 ° C på dette tidspunkt, eller anvendes direkte i QRT-PCR assay. For at forhindre nedbrydning af oprensede virale RNA-prøver af nukleaser, bruge nuklease-fri reagenser og udstyr og holde optøede RNA-prøver på is.
Bemærk: Buffere RLT og RW1 indeholder guanidin salt og bør ikke blandes med blegemiddel. Buffer RW1 indeholder ethanol.
4. QRT-PCR Måling af virale genom
- At konvertere JUNV C # 1 S segment RNA til cDNA til efterfølgende qPCR, underkaste det virale RNA (genereret i trin 3.1.4) til stuetemperatur i et totalt volumen på 50 pi.
- For at opsætte RT-reaktionen, først oprette en master mix indeholder hver af de følgende reagenser pr reaktion: 6,75 ul nuklease-fri Hedeselskabet 2 O, 5 pi af en 2 pM bestand af RT-primeren S 2098- til 2075- (5'-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3 '), som er komplementær til NP-regionen af S-segmentet genomiske RNA, 5 pi 10X PCR-buffer II, 11 pi af en 25 mM MgCl2-opløsning, 1,25 pi (62,5 enheder) af RT-enzym, 1 pi (0,4 enheder) af RNase inhibitor, og 10 pi af en 500 uM bestand af dNTP'er.
Bemærk: Under arenavirus replikation, er 4 virale S segment RNA-arter genereret: en fuld længde genomisk RNA (vRNA), et fuldlængde antigenomisk RNA (vcRNA) (dvs. det omvendte komplement af vRNA), og to subgenomiske mRNA'er koder for NP- og GP-gener hhv. RT-primeren vist her er specifikt for kun S-segmentet vRNA, men ikke den vcRNA, NP mRNA eller GP-mRNA. - Bland forsigtigt RT mastermix og derefter udportionerer 40 pi i individuelle 0,2 ml PCR-rør. Tilsæt 10 pi viralt RNA til hvert rør. Omfatte i) et ikke skabelonkontrol rør (f.eks. Tilføje 10 pi nukleasefri Hedeselskabet 2 O til 40 pi af master mix) og ii) en ingen RT enzymkontrol (f.eks tilsæt 10 pi af en kendt-viral-positiv RNA-prøve til 40 pi store blanding, der ikke modtog enhver RT enzym) at screene for kontaminering af RT reagenser med amplificeret DNA indeholdende det virale målsekvens. Indbefatter RNA ekstraheret fra ikke-inficerede celler med den fulde RT masterblanding at styre til assay specificitet i nærvær af cellulært RNA.
- Derudover omfatter en kendt-viral-positiv RNA-prøve til den fulde masterblandingen at kontrollere kvaliteten af RT reagenser. Bemærk, at mængden af RT-reaktionen kan reduceres til 25 pi om nødvendigt.
- For at opsætte RT-reaktionen, først oprette en master mix indeholder hver af de følgende reagenser pr reaktion: 6,75 ul nuklease-fri Hedeselskabet 2 O, 5 pi af en 2 pM bestand af RT-primeren S 2098- til 2075- (5'-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3 '), som er komplementær til NP-regionen af S-segmentet genomiske RNA, 5 pi 10X PCR-buffer II, 11 pi af en 25 mM MgCl2-opløsning, 1,25 pi (62,5 enheder) af RT-enzym, 1 pi (0,4 enheder) af RNase inhibitor, og 10 pi af en 500 uM bestand af dNTP'er.
- Underkaste RT rør til følgende cykliseringsbetingelser: 25 ° C i 10 minutter, 48 ° C i 30 minutter, og 95 ° C i 5 min. Bemærk, at prøver kan opbevares ved -20 ° C på dette tidspunkt eller venstre natten over i thermocycler ved tilsætning af en 4 ° C trin.
- Perform qPCR i et samlet volumen på 25 pi.
- Lav en qPCR Master mix ved at kombinere følgende: 2,5 pi (af en 9 uM bestand) for hver forward PCR-primer S1937 + til 1958+ (5'-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3 ') og reverse PCR-primer S 2001- til 1982- (5 '-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3'), 2,5 pi (af en 2 uM stamopløsning) af qPCR proben S 1960+ til 1975+ (5'-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3 '), og 12,5 pi af 2X universelle qPCR mester blande. Bemærk, at den fremadrettede primer rapporteret her, som er specifik for JUNV C # 1, afviger med 1 nt fra den oprindeligt rapporterede primersekvens 38, som er rettet mod den virulente JUNV stamme Romero.
- Forsigtigt blande opløsningen og derefter tilsættes 20 pi til hver qPCR brønd. Tilsæt 5 pi af hver RT-reaktionen til de passende qPCR brønde. Udføre qPCR i tre eksemplarer for hver undersøgt prøve. Bemærk, at PCR-reaktionen volumen kan reduceres til så lidt som 12,5 pi, hvis nødvendigt.
Bemærk: Softwaren er forbundet medqPCR maskinen vil generere absolutte kopiantal af JUNV C # 1 S segment genomisk RNA ved sammenligning af værdien af hver ukendt prøve til en serie af standard fortyndinger af plasmid koder for JUNV C # 1 NP-genet, som er målet for qPCR primeren og probe sæt. Den qPCR assay kan kun give kvantificering for værdier, der falder inden for området af standardkurven. Af denne grund indbefatter følgende mængder plasmid (i tredobbelte brønde): 5, 50, 5 x 10 3, 5 x 10 5 og 5 x 10 7 kopier per brønd.
- Indlæse qPCR pladen ind i thermocycler og kør følgende reaktionsbetingelser: 95 ° C i 10 minutter og 40 cykler ved 95 ° C i 15 sek og 60 ° C i 1 min.
- Indsamling og analyse af data for at bestemme mængden af virus-RNA til stede i hver prøve ifølge producentens protokol.
- At etablere en standardkurve ved hjælp af en nyligt renset prøve af plasmid indeholdende qPCR tjærefå sekvens, først afgøre plasmidet kopi nummer i denne løsning.
- Beregn molekylvægten af plasmidet. Hvis sekvensen af hele plasmidet er kendt, beregnes dette ved hjælp af følgende formel: MW = ([A * 312,2] + [G * 328,2] + [C * 288,2] + [T * 303.2] - 61.13). Husk at inkludere det samlede antal af en bestemt nukleotid findes på hver streng af det dobbeltstrengede plasmid.
- Hvis størrelsen af plasmidet er kendt, men dens nøjagtige sekvens ikke, beregne MW under den antagelse, at hver dsDNA basepar har en MW på 600.
Bemærk: pCAGGS-JUNV C # 1 NP-plasmid bruges her har en MW på 4,2 x 10 6. - Når MW af plasmidet er blevet bestemt, beregne, hvor mange kopier pr pi er til stede i bestanden plasmidopløsning.
- Først beregne den samlede pg plasmid i opløsningen, derefter konvertere denne til mol plasmid (fx hvis 69 ug plasmid er indeholdt i 300 pi vand, derefter 6,9 x 10 -5 g plasmid * 1 mol / 4,2 x 10 6 g plasmid = 1,6 x 10 -11 mol plasmid), som kan omdannes til at kopiere nummer (f.eks 1,6 x 10 -11 mol plasmid * 6,022 x 10 23 molekyler / mol = 9,8 x 10 12 molekyler (eller kopier)).
- Opdel samlede kopier af plasmidet i plasmidet løsning ved den mængde af denne løsning for at få kopier pr pi (f.eks 9,8 x 10 12 kopier / 300 pi = 3.28 x 10 10 kopier).
- Opløsningen fortyndes passende således at 5 pi volumener kan indlæses på PCR-plade til at levere forskellige kopiantal nødvendige for at indføre standardkurven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at demonstrere følsomhed og dynamiske område af qPCR assay blev kendte mængder af et plasmid, der koder for NP-genet af JUNV C # 1 (interval 5-5 x 10 7 kopier) udsat for qPCR, som beskrevet i afsnit 4 i protokollen. Assayet er følsomt og kan detektere så få som 5 kopier af målnucleinsyren (figur 2). Endvidere dynamisk område for analysen er stort og, som vist i figur 2, kan omfatte mindst 7 logfiler over skabelonen. Mens ikke er vist, har vi opdaget så mange som 5 x 10 9 kopier af nukleinsyre.
For at illustrere anvendeligheden af assayet til måling af JUNV C # 1 partikel binding blev forskellige mængder JUNV C # 1 præbundet til Vero E6-celler som beskrevet i protokollen. Efter afvaskning af ubundne partikler blev celler lyseret til RNA oprensning og de resulterende RNA-prøver blev underkastet QRT-PCR. Som vist i figur 3, kan assayet detektere virale vedhæftede begivenheder hjælp så få som 20 eller så mange som 2 x 10 6 PFU, hvilket svarer til MOI af 0,0004 og 40, henholdsvis.
Som vist i figur 4, er det muligt at modificere protokollen til ikke kun måle viral vedhæftning, men også hastigheden for amplifikation af genomet indeholdt i de indkommende virale partikler over tid. Denne modificerede fremgangsmåde kan anvendes som surrogat for at afgøre, om yderligere defekter i de resterende trin af viral entry (f.eks partikel endocytose og / eller fusion og frigivelse af virale genom ind i cytoplasmaet) kunne opstå. Interessant, mængden af virale genom synes at falde i første 6 timer efter binding, hvilket antyder, at en del af det indkommende virale genom nedbrydes. Dette kunne ske for partikler, der ikke skal tages i cellen og nedbrydes i extracellular plads eller måske på grund af nedbrydning i endolysosomal netværk. De viste data viser, at 12 eller 18 timer efter infektion vil være optimale tidspunkter at screene for aktiv genomreplikation.
Figur 1:. Afbildning af protokol arbejdsgang De primære trin i virus-celle-vedhæftning assay er 1) inkubation af viruspartikler med celler ved 4 ° C for at tillade virus-cellebinding at forekomme efterfulgt af vaskninger for at fjerne ubundet virus, 2) oprensning af virus-RNA fra cellerne, 3) revers transkription (RT) til at konvertere JUNV S segment genomisk RNA (vRNA) til cDNA, og 4) qPCR at optælle kopier af JUNV S vRNA som et mål for virus-celle vedhæftet fil. klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:. QPCR assay til påvisning af JUNV S segment genom er følsom og kan bruges over et stort dynamikområde The JUNV S segment qPCR primer-probe sæt blev testet for dets evne til nøjagtigt at måle kendte mængder (5, 16,6, 50, 5 x 10 3, 5 x 10 5 eller 5 x 10 7 kopier) af et DNA standardstyringsfunktioner plasmid koder målsekvensen. Afbildet er de forstærkning plots (A) og standard kurve fit linjer (B). R2, korrelationskoefficient på primer-probe sæt. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: JUNV-cellebinding assay pålideligt foranstaltningerpartikel binding under anvendelse så få som 20 PFU. Vero E6 celler blev forudgående bundet med kendte mængder af JUNV C # 1 (2 x 10 1, 2 x 10 2, 2 x 10 3, 2 x 10 4, 2 x 10 5, eller 2 x 10 6 PFU) i 1,5 timer ved 4 ° C. Ubundne partikler blev fjernet ved vask blev celler lyseret til RNA-ekstraktion, og de resulterende RNA-prøver blev underkastet QRT-PCR til påvisning JUNV C # 1 S segment vRNA som et mål for partikel binding til Vero E6 celler. Dataene repræsenterer gennemsnittet kopiantal pr brønd fra dobbelte brønde ± SEM.
Figur 4:. Kinetik af JUNV C # 1 genomreplikation efter infektion Vero E6 celler blev inkuberet med 2 x 10 3 PFU JUNV C # 1 (MOI på 0,04) i 1,5 timer ved 4 ° C. Efter flere vaske i iskold PBS, blev cellerne enten høstet straks (0 HR tidspunkt)eller opvarmet til 37 ° C i de angivne tidsrum før samling. I hvert tilfælde blev totalt RNA ekstraheret fra celler og underkastet QRT-PCR til påvisning JUNV C # 1 S segment vRNA. Værdierne er anført som middelværdier kopier pr brønd fra dobbelte brønde ± SEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskriver vi er ligetil og robust forudsat følgende kritiske overvejelser overholdes. For det første skal en streng pre-PCR-teknik anvendes (se 28 for en fremragende anmeldelse). Det er bydende nødvendigt, at alle reagenser og udstyr er fri for amplificeret DNA, der indeholder qPCR målsekvensen og at passende kontroller er på plads til at opdage en sådan forurening. For det andet, for at virus-cellebinding del af protokollen, virus, celler, og medierne skal holdes på 4 ° C for at forhindre endocytose af overflade-bundne virioner. For det tredje skal den mængde celler opsamlet til RNA-ekstraktion ikke overstige det RNA-bindende kapacitet af RNA oprensning filter. Fjerde, rensede virale RNA-prøver skal beskyttes mod ribonuklease-medieret nedbrydning ved brug af nuklease-fri reagenser og udstyr og ved at holde dem på is når optøet. Femte, rækken af standardkurven indgår i qPCR analysen skal være tilstrækkeligt stortat indfange alle værdier observeret fra de ukendte prøver. For det sjette skal tekniske replikater inkluderes for både virus-cellebinding del af assayet samt qPCR af individuelle RNA-prøver. Syvende, kontroller (f.eks cellelinier, som udtrykker hTfR1 eller ej) kan indbefattes for at kontrollere for specificiteten af assayet. Endelig skal alle medarbejdere have passende biosikkerhed uddannelse og institutionel godkendelse til at håndtere smitsomme JUNV C # 1 eller andre patogene arenavirus.
Den qPCR del af protokollen kræver en qPCR sonde primært for at sikre specificitet det produkt, der forstærkes i hvert trin i PCR-reaktionen. Omkostningerne ved assayet kunne reduceres imidlertid ved at eliminere denne qPCR probe til fordel for en anden qPCR kemi, der ikke kræver en probe (fx anvendelse af den asymmetriske farvestof SYBR Green I 25) og / eller ved at reducere volumenet af qPCR reaktionsblanding anvendes. Hvis en probe-uafhængig qPCR appskalle bruges, vil det være vigtigt at kontrollere, at reaktionsbetingelserne er strenge nok til at sikre specificiteten af qPCR primere. Det er også vigtigt at være opmærksom på, at arenavirus RNA, enten ekstraheret fra celler eller virioner, kan ikke-specifikt primet til dannelse cDNA under RT i fravær af en virus-specifik RT-primer 12. Derfor kopiere numre detekteres ved hjælp af et vRNA-specifik RT primer ikke strengt afspejler bare vRNA arter er omfattet af RT primeren. Hvis specificitet for genom eller antigenom er påkrævet, har vi rapporteret et middel til at omgå dette uspecifik priming fænomen gennem anvendelse af biotinylerede RT-primere og streptavidinkugler 12.
En vigtig styrke for denne test er dets ekstreme følsomhed. Andre arenavirus-cellevedhæftningsfaktorer assays featuring radioaktivt mærkede 22, biotinyleret 20 eller fluorescens-mærkede 21 partikler har krævet MOI'er på 0,2, 100 eller 1000, respektively. Mens anvendelsen af radioaktivt mærkede partikler medfører god følsomhed, det nødvendiggør anvendelsen af radioaktivitet, hvilket øger de logistiske kompleksitet og sikkerhedsaspekter i forbindelse med denne særlige assay. QPCR-baserede her beskrevne fremgangsmåde kræver så lidt som 20 PFU (MOI på ~ 0,0004 i en 48-brønds plade) og kan detektere fastgørelse over et stort dynamikområde MOI (f.eks MOI'er fra 0,0004 til mindst 40) (figur 3 ). Den stærke følsomhed denne analyse gør det muligt at bruge lav MOI for mere præcis måling af produktive bindende begivenheder ved standard smitsom virus. Den høje følsomhed også reducerer mængden af virus er nødvendig for assayet, og derved begrænser yderligere håndteringstrin, der kan påvirke kvaliteten af virioner anvendes i assayet (f.eks polyethylenglycol-baserede udfældning af virioner, mærkning virioner med fluorophorer eller radioaktive isotoper og / eller saccharose-banding af virions). Derudover qPCR analysen selv er ligetil at udføre såvel som meget præcis og reproducerbar.
Celle-vedhæftning assayet beskrevet kan modificeres til at måle supplerende etaper af viral entry herunder viruspartikel endocytose samt det sidste trin i virus-fusion, som er frigivelse af virale genom ind i cytoplasmaet. For at måle partikel endocytose, vil de samme trin i fastgørelsen protokollen følges gennem trin 2.5, som er binding af partikler til celler ved 4 ° C. Celler vil derefter blive opvarmet for at tillade virale partikler, der skal endocytose, efterfulgt af behandling med en protease for at strippe enhver eksternt bundne virioner, der ikke blev endocytoseret som beskrevet 22,24. §§ 3 og 4 i denne protokol vil så blive fulgt at udtrække viralt RNA og kvantificere kopier af viralt genomisk RNA som et mål for endocytose. For at måle genom uncoating efter fusion af virale og endosomale membraner, ville celler blive præbundet medvirus ved 4 ° C, opvarmes (for at tillade endocytose og fusion) og strippet for eksterne partikler, og derefter opsamlet til analyse. I en fremgangsmåde kan celler lyseres i en isotonisk puffer til at bevare intracellulære vesikler, og derefter opdelt i 2 fraktioner: en, der ville blive behandlet med en cocktail af RNaser (uovertrukket virale RNA er modtagelig for nedbrydning) og den anden, der ikke ville 39 . Alternativt kan celler adskilles i cytosoliske eller endosomale fraktionerne 40. I begge tilfælde ville QRT-PCR anvendes til at kvantificere virale genom i cytoplasmaet som et mål for viral genom uncoating. Endelig kan QRT-PCR assay let modificeres til at studere virus vedhæftet fil, endocytose eller sammenlægning for andre vira, der er fastsat i RT-PCR-reagenser er skræddersyet til den nye virus af interesse (for eksempler se 24-27).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker Markus Thali, Nathan Roy, Christopher Ziegler, Emily Bruce, og Benjamin konge for nyttige diskussioner og National Institutes of Health til støtte for disse undersøgelser gennem tilskud T32 AI055402 (JK), R21 AI088059 (JB), og P20RR021905 (JB) .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies | 11965-118 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | 100x |
| HEPES Buffer Solution | Life Technologies | 15630-130 | 100x |
| PBS pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | 1x |
| Vero E6 cells | American Type Culture Collection | CRL-1586 | |
| Costar 48-well plate | Corning | 3548 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | do not mix buffers RLT or RW1 with bleach |
| QIAshredder homogenizer | Qiagen | 79654 | |
| Taqman Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4326614 | |
| Multiscribe Reverse Transcriptase (50U/µl) | Life Technologies | 4311235 | |
| dNTP Mixture (10 mM; 2.5 mM each dNTP) | Life Technologies | N808-0260 | |
| GeneAmp 10X PCR Buffer II and 25 mM MgCl2 solution | Life Technologies | N808-0010 | |
| RNase Inhibitor (5000U/100 µl) | Life Technologies | N808-0119 | |
| RT primer 5’-AAGGGTTTAAAAAT GGTAGCAGAC-3’ |
Integrated DNA Technologies | 250 nmol DNA oligo | standard desalting |
| Forward qPCR primer 5’-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3’ | Life Technologies | 4304971 | standard desalting |
| Reverse qPCR primer 5’-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3’ | Life Technologies | 4304971 | standard desalting |
| TaqMan Probe 5’-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3’ | Life Technologies | 4316033 | HPLC purified |
| MicroAmp Fast Optical 96-well reaction plate (0.1 mL) | Life Technologies | 4346906 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Life Technologies | 4376598 | or other qPCR instrument |
References
- Childs, J. C., Peters, C. J. The Arenaviridae. Salvato, M. S. , Plenum Press. 331-373 (1993).
- Salazar-Bravo, J., Ruedas, L. A., Yates, T. L. Mammalian reservoirs of arenaviruses. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 25-63 (2002).
- Buchmeier, M. J., de la Torre, J. C., Peters, C. J., et al. Ch. 50. Fields Virology. Knipe, D. M. 2, Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins. 1791-1827 (2007).
- Parodi, A. S., et al. Sobre la etiologia del brote epidemico de Junin (Nota previa). Dia Medico. 30, (1958).
- Frame, J. D., Baldwin, J. M., Gocke, D. J., Troup, J. M. Lassa fever, a new virus disease of man from West Africa. I. Clinical description and pathological findings. Am. J. Trop. Med. Hyg. 19, 670-676 (1970).
- Buchmeier, M. J., Zajac, A. J. Lymphocytic Choriomenigitis Virus. , John Wiley & Sons Ltd. (1999).
- Barton, L. L., Mets, M. B., Beauchamp, C. L. Lymphocytic choriomeningitis virus: emerging fetal teratogen. Am. J. Obstet. Gynecol. 187, 1715-1716 (2002).
- Fischer, S. A., et al. Transmission of lymphocytic choriomeningitis virus by organ transplantation. N. Engl. J. Med. 354, 2235-2249 (2006).
- Palacios, G., et al. A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases. N. Engl. J. Med. 358, 991-998 (2008).
- Meyer, B. J., de la Torre, J. C., Southern, P. J. Arenaviruses: genomic RNAs, transcription, and replication. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 139-157 (2002).
- Meyer, B. J., Southern, P. J. Sequence heterogeneity in the termini of lymphocytic choriomeningitis virus genomic and antigenomic RNAs. J. Virol. 68, 7659-7664 (1994).
- Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs. PLoS One. 10, e0120043 (2015).
- Radoshitzky, S. R., et al. Transferrin receptor 1 is a cellular receptor for New World haemorrhagic fever arenaviruses. Nature. 446, 92-96 (2007).
- Martinez, M. G., et al. Utilization of human DC-SIGN and L-SIGN for entry and infection of host cells by the New World arenavirus, Junin virus. Biochem. Biophys. Res. Commun. 441, 612-617 (2013).
- Martinez, M. G., Cordo, S. M., Candurra, N. A. Characterization of Junin arenavirus cell entry. J. Gen. Virol. 88, 1776-1784 (2007).
- Martinez, M. G., Forlenza, M. B., Candurra, N. A. Involvement of cellular proteins in Junin arenavirus entry. Biotechnol J. 4, 866-870 (2009).
- Nunberg, J. H., York, J. The Curious Case of Arenavirus Entry, and Its Inhibition. Viruses. 4, 83-101 (2012).
- Botten, J., King, B., Klaus, J., Zielger, C. Viral Hemorrhagic Fevers. , CRC Press. 233-260 (2013).
- Klaus, J. P., et al. The intracellular cargo receptor ERGIC-53 is required for the production of infectious arenavirus, coronavirus, and filovirus particles. Cell Host Microbe. 14, 522-534 (2013).
- Rojek, J. M., Perez, M., Kunz, S. Cellular entry of lymphocytic choriomeningitis virus. J. Virol. 82, 1505-1517 (2008).
- Lavanya, M., Cuevas, C. D., Thomas, M., Cherry, S., Ross, S. R. siRNA screen for genes that affect Junin virus entry uncovers voltage-gated calcium channels as a therapeutic target. Sci Transl Med. 5, 204ra131 (2013).
- Ellenberg, P., Edreira, M., Scolaro, L. Resistance to superinfection of Vero cells persistently infected with Junin virus. Arch. Virol. 149, 507-522 (2004).
- Brandenburg, B., et al. Imaging poliovirus entry in live cells. PLoS Biol. 5, e183 (2007).
- Petersen, J., et al. The Major Cellular Sterol Regulatory Pathway Is Required for Andes Virus Infection. PLoS pathogens. 10, e1003911 (2014).
- Jonsson, N., Gullberg, M., Israelsson, S., Lindberg, A. M. A rapid and efficient method for studies of virus interaction at the host cell surface using enteroviruses and real-time PCR. Virol J. 6, 217 (2009).
- Jiang, J., et al. Hepatitis C virus attachment mediated by apolipoprotein E binding to cell surface heparan sulfate. J. Virol. 86, 7256-7267 (2012).
- Shannon-Lowe, C., et al. Epstein-Barr virus-induced B-cell transformation: quantitating events from virus binding to cell outgrowth. J. Gen. Virol. 86, 3009-3019 (2005).
- Mifflin, T. E. Setting up a PCR laboratory. CSH Protoc. 2007, pdb top14 (2007).
- Maiztegui, J. I., et al. Protective efficacy of a live attenuated vaccine against Argentine hemorrhagic fever. AHF Study Group. J. Infect. Dis. 177, 277-283 (1998).
- Goni, S. E., et al. Genomic features of attenuated Junin virus vaccine strain candidate. Virus Genes. 32, 37-41 (2006).
- Chosewood, L. C., Wilson, D. E. Centers for Disease Control and Prevention (U.S.). Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. , 5th edn, U.S. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service, Centers for Disease Control and Prevention, National Institutes of Health. (2009).
- White, J., Matlin, K., Helenius, A. Cell fusion by Semliki Forest, influenza, and vesicular stomatitis viruses. J. Cell Biol. 89, 674-679 (1981).
- McGraw, T. E., Greenfield, L., Maxfield, F. R. Functional expression of the human transferrin receptor cDNA in Chinese hamster ovary cells deficient in endogenous transferrin receptor. J. Cell Biol. 105, 207-214 (1987).
- Borrow, P., Oldstone, M. B. Characterization of lymphocytic choriomeningitis virus-binding protein(s): a candidate cellular receptor for the virus. J. Virol. 66, 7270-7281 (1992).
- Rojek, J. M., Spiropoulou, C. F., Kunz, S. Characterization of the cellular receptors for the South American hemorrhagic fever viruses Junin, Guanarito, and Machupo. 346. , 476-491 (2006).
- Helguera, G., et al. An antibody recognizing the apical domain of human transferrin receptor 1 efficiently inhibits the entry of all new world hemorrhagic Fever arenaviruses. J. Virol. 86, 4024-4028 (2012).
- Sanchez, A., et al. Junin virus monoclonal antibodies: characterization and cross-reactivity with other arenaviruses. J. Gen. Virol. 70, 1125-1132 (1989).
- Trombley, A. R., et al. Comprehensive panel of real-time TaqMan polymerase chain reaction assays for detection and absolute quantification of filoviruses, arenaviruses, and New World hantaviruses. Am. J. Trop. Med. Hyg. 82, 954-960 (2010).
- Helenius, A., Marsh, M., White, J. Inhibition of Semliki forest virus penetration by lysosomotropic weak bases. J. Gen. Virol. 58 (Pt 1), 47-61 (1982).
- Nour, A. M., Li, Y., Wolenski, J., Modis, Y. Viral membrane fusion and nucleocapsid delivery into the cytoplasm are distinct events in some flaviviruses. PLoS pathogens. 9, e1003585 (2013).
