本实验方案旨在描述一种功能缺失和功能获得的方法，可用于鉴定新生素（neogenin）作为植入前小鼠胚胎中滋养外胚层和内细胞团分化的阶段特异性受体。
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摘要
摘要
基因沉默和过表达技术对于鉴定参与胚胎发育的基因至关重要。在植入前胚胎中直接对靶基因进行修饰，为研究参与例如滋养外胚层（TE）和内细胞团（ICM）细胞分化的相关基因的潜在机制提供了手段。本文描述了一种研究新发现蛋白（neogenin）作为植入前小鼠胚胎早期细胞命运决定真实受体作用的实验方案。首先，我们讨论了通过显微注射neogenin cDNA和shRNA实现neogenin功能获得和缺失的实验操作；该方法的有效性通过红色荧光蛋白（RFP）或绿色荧光蛋白（GFP）的成对表达水平与免疫细胞化学定量检测的neogenin表达水平之间高度相关性得以验证。其次，在植入前小鼠胚胎中过表达neogenin可支持正常的ICM发育，而neogenin表达下调则导致ICM发育异常，提示neogenin可能是传递胞外信号以驱动卵裂球向早期细胞命运分化的受体。鉴于该详细方案在研究一种新型胚胎发育阶段特异性受体功能上的成功，我们提出该方法有望促进胚胎发生过程中其他阶段特异性基因的探索与鉴定。
引言
胚胎着床前发育可分为若干明显阶段，从单细胞阶段经桑葚胚至囊胚阶段。大量证据表明，极性与位置信号在早期细胞命运决定分化为滋养外胚层（TE）和内细胞团（ICM）的过程中发挥重要作用。然而，这些信号的本质、它们如何被转导为细胞内信号，以及此类信号在何种生理环境下能够启动细胞谱系分化，目前仍不清楚。这些已分化的细胞随后进一步特化，开始形成胚胎本体构建及胎盘发育所必需的特定结构与功能1-3。
植入前胚胎特别适合通过直接注射修饰的遗传物质（如siRNA或目的cDNA）进行操作，因此可用于研究特定靶分子。目前越来越认识到，对脊椎动物胚胎进行遗传学分析对于深入理解胚胎发育过程至关重要4。在适当的时间窗口内将野生型基因或突变型基因精确导入胚胎，以实现基因的获得或缺失功能，极大地促进了对发育调控基因的研究。由于早期非哺乳类和哺乳类胚胎体积较大且易于接受外源物质，通过显微注射将遗传物质导入单个胚胎以实现功能获得或缺失相对简便5。显微注射通常使用非病毒载体进行。相比病毒载体和转基因技术，非病毒载体具有操作简便的显著优势。目前已建立一种在小鼠胚胎中快速实现基因功能获得或缺失的表达系统，使我们能够解析并理解脊椎动物胚胎学中基因的功能6,7。
对胚胎进行荧光标记将极大地方便筛选显微注射或基因操作后的胚胎，同时可根据荧光强度间接定量评估显微注射的siRNA或cDNA....
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方案
注意：所有动物繁育和护理操作均依照韩国首尔善明大学动物护理与使用委员会（IACUC ）的规定进行。
1. 超数排卵、配种与输卵管分离
- 将近交系 C57BL/6 小鼠饲养在以下条件下：22 ± 3 °C，相对湿度约 60%，12 小时光照/黑暗循环，自由饮水和进食。
- 对 3–5 周龄的雌性小鼠进行超数排卵诱导：每只腹腔注射 5 IU 孕马血清促性腺激素（PMSG），剂量为 0.1 ml/只；48 小时后，再腹腔注射 5 IU 人绒毛膜促性腺激素（hCG），剂量为 0.1 ml/只。
- 在注射 hCG 后立即与同品系性成熟的雄性小鼠合笼过夜，以进行交配。
- 次日早晨，通过检查雌性小鼠生殖道是否存在交配栓或阴道栓来确认交配是否成功。
- 在注射 hCG 后 18–20 小时，采用 CO2 窒息法处死怀孕雌鼠，随后进行颈椎脱臼以确保安乐死。
- 使用精细剪刀剪开皮肤，再剪开腹膜层，暴露腹腔。
- 用精细镊子夹住子宫角，轻柔地将子宫、输卵管、卵巢及脂肪垫从体腔中分离并拉出。
- 用精细剪刀剪断输卵管与卵巢之间的连接区域；重新放置镊子，再在靠近输卵管处剪断子宫，保留至少 1 cm 的子宫上段与输卵管相连。
- 将输卵管壶腹部转移至含有 M16 培养基的 35 mm 培养皿中，室温下保存。可将多只小鼠的输卵管置于同一培养皿中。 <....
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结果
我们发现，新生素（neogenin）在小鼠胚胎着床前早期发育阶段呈 transient 表达，最早在2细胞阶段出现，持续至早期桑葚胚阶段，但在晚期桑葚胚和囊胚阶段则表达缺失（图 2A）。此外，新生素的空间分布主要局限于外层细胞。RT-PCR 分析结果与新生素表达的早期性和 transient 特征一致，在4细胞阶段达到峰值，而在16细胞阶段或更晚阶段则完全检测不到（图 2B）。相比之下，F-actin 并未表现出类似的 transient 和极性表达模式。
接下来，我们通过向2-细胞期受精卵显微注射neogenin cDNA载体（neogenin过表达）或携带靶向neogenin的shRNA载体（neogenin缺失），探究neogenin水平是否可被调控。为直观区分neogenin过表达与neogenin缺失，同时共表达RFP和GFP作为指示标记图3.......
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讨论
在本实验方案中，我们展示了将遗传物质（包括 cDNA 或 shRNA）显微注射到 2-原核期小鼠胚胎中的新方法，以研究新生素（neogenin）在小鼠胚胎发生过程中早期细胞分化的作用。对植入前胚胎进行遗传修饰是一种强大的技术，可用于揭示诸如首次细胞谱系决定等过程背后的关键分子机制。遗传修饰是确定基因功能最常用的方法之一。由于 2-原核期胚胎对外源性遗传物质具有相对较高的接受能力，并且可实现将 cDNA 和 shRNA 显微注射入 2-原核期胚胎，因此该胚胎操作技术可在对胚胎造成最小物理干扰的情况下实施，更不用说这种遗传操作本身所具有的内在互补性。
考虑到细胞质注射比核注射更容易且对存活的影响更小，但核注射通常能实现外源DNA的更高表达，因此应强调的一种改进方法是在对细胞核进行显微注射前，利用离心法将原核定位。其中技术上最复杂且要求最高的步骤是将外源DNA显微注射到受精卵的原核中。该步骤至关重要，需要较高的技术水平以及大量训练才能熟练掌握显微注射操作。然而一旦掌握此项技能，技术上的变异性和操作误差将降至最低。在我机构中，显微注射后胚胎的常规存活率为80–90%。
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披露
作者声明无竞争性财务利益。
致谢
作者还感谢佐治亚健康科学大学Xiong博士的研究团队制备并分享了neogenin cDNA和shRNA载体的构建体。本研究得到了韩国研究基金会资助的基础科学研究中心项目（2013R1A1A4A01012572）以及沙姆尤克大学研究基金的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| M16 培养基 | Gibco BRL (美国纽约州格兰德岛) | M7292 批号：11A832 | |
| 山羊血清 | Dako (丹麦格洛斯楚普) | X0907 | |
| PMSG | Folligon，Intervet，荷兰 | G4877-1000IU 批号：SLBD0719V | |
| 矿物油 | Sigma Aldrich | CG5-1VL 批号：SLBC6783V | |
| 人绒毛膜促性腺激素和孕马血清促性腺激素 | (Intervet，荷兰) | (Invitrogen，15596-026) | |
| SuperScript® III 逆转录酶 | LifeTechnologies | 18080-044 | |
| PCR 预混液 | (Bioneer，韩国大田) | GenDEPOT，A0224-050 | |
| 琼脂糖（分子级） | BioRad | 161-3101 | |
| 4% 多聚甲醛 PBS 溶液 | Affymetrix 美国 | 19943 | |
| 兔多克隆抗新生素抗体 | Santa Cruz Biotechnology，美国 | SC-15337 | |
| Alexa Fluor 488 标记的抗兔抗体 | Molecular Probes (Invitrogen，美国) | A-11094 | |
| Alexa Fluor 555 标记的抗兔抗体 | Molecular Probes (Invitrogen，美国) | A-21428 | |
| Alexa Fluor® 555 Phalloidin | Molecular Probes (Invitrogen，美国) | A34055 | |
| DAPI (4',6-二脒基-2-苯基吲哚，盐酸盐) | Invitrogen，美国 | D1306 | |
| 重组人 RGM-C/血幼素 | R&D Systems | 3720-RG | |
| 所有质粒构建体 | 由佐治亚健康科学大学（美国佐治亚州奥古斯塔）熊文成教授提供 | 本研究中所使用的质粒构建体由 慷慨提供 | |
| Neon® 转染系统 | LifeTech | MPK10096 | |
| 体视显微镜 | Nikon | SMZ1000 | |
| 配备 Nikon 的显微操作系统 | Nikon | Narishige ONM-1 | |
| 显微注射器 | Nikon Narishige | GASTIGHT #1750 | |
| 持针器 | Nikon Narishige | Narishige IM 16 | |
| 微量离心机 | Nikon Narishige | Narishige MF-900 | |
| 磨针仪 | Narishige | EG400 | |
| 拉针仪 | Sutter Instrument 公司 | P-97 | |
| CO2 培养箱 | Thermo Scientific Forma | EW-39320-16 | |
| Veriti® 384 孔 PCR 仪 | LifeTechnologies | 4388444 |
参考文献
- Yamanaka, Y., Ralston, A., Stephenson, R. O., Rossant, J. Cell and molecular regulation of the mouse blastocyst. Dev. Dyn. 235 (9), 2301-2314 (2006).
- Sasaki, H. Mechanisms of trophectoderm fate specification in preimplantation mouse development. Dev. Growth Differ. ....
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重印与许可
