Abstract
肌动蛋白丝状蛋白（F-肌动蛋白）起着spinogenesis，突触可塑性，突触稳定的重大作用。树突状F-肌动蛋白丰富的结构变化表明突触的完整性和连通性的改变。在这里，我们为主要培养大鼠皮层神经元，鬼笔环肽染色F-肌动蛋白泪点，和随后的量化技术的详细协议。首先，E18大鼠胚胎的额叶皮层解离成低密度细胞培养，然后在体外生长至少12-14天的神经元。以下实验性治疗，皮质神经元染色AlexaFluor 488鬼笔环肽（标记树枝状F-肌动蛋白泪点）和微管相关蛋白2（MAP2;验证神经元细胞和树突完整性）。最后，专门的软件，用于分析和量化随机选择的神经元树突。 F-肌动蛋白丰富的结构被确定二阶树突分支（长度范围25-75＆＃181;米），连续MAP2免疫。这里介绍的协议将是调查到实验处理后续树突突触结构的变化的有用方法。
Introduction
本研究的主要目标是开发测量（估计）的神经元的树突状网络的突触完整性的可靠方法。在这里，我们描述了使用鬼笔环肽染色和使用专门的（NIS元素）软件与后续分析树突免疫细胞化学（ICC）检测结合原代大鼠神经细胞培养F-肌动蛋白泪点的定量。
标毒肽对大型和小型丝（F-肌动蛋白）相似的亲和力，但不绑定到单体球状肌动蛋白（G-actin的），不像有些肌动蛋白抗体，1。鬼笔环肽非特异性结合是微不足道的，因此，细胞成像过程中提供最小的背景。鬼笔环肽是比通常被用于标记细胞蛋白为荧光显微镜，其允许由鬼笔环肽F-肌动蛋白的更强烈标记抗体小得多。因此，在神经元F-肌动蛋白本地化的详细图像可以通过使用标记的鬼笔环肽而获得的。
毒伞素（F-肌动蛋白），神经元树突染色产生离散的“热点”或明亮的“泪点”，它代表了各种树状结构，包括成熟的刺，无刺的突触2和不成熟的刺。未成熟的棘包括薄丝状伪足和某些形式的贴剂的形态，并且可以代表spinogenesis 3的启动。未成熟的刺和非多刺补丁缺乏PSD95 4。从而在生产F-肌动蛋白导致不仅刺后续变化，而 且还附加树枝状结构的变化，使得鬼笔环肽进行调查synaptodendritic完整性5-7的重要工具。一般情况下，鬼笔环肽阳性（F-肌动蛋白）泪点的数字反映了积极的突触之间的平衡（兴奋和抑制），肌动蛋白和突触的稳定性8。
虽然研究特异性T是非常重要的突触（即，兴奋性刺）的ypes，当治疗的靶标是未知有必要首先估计各种树枝状结构的总体完整性。由于F-肌动蛋白是树突棘和其它结构，包括抑制性突触，改变的数目F-肌动蛋白泪点的可指示synaptopathy的主要组成部分。这synaptopathy然后可用于更具体的变化进一步调查。我们的检测多种类型的突触/结构的量化方法产生的树突突触的改变（增加和减少）以下的各种实验性治疗的总体估计。
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Protocol
所有动物方案进行了审查，并经动物护理和使用委员会在南卡罗来纳大学（保证号码：A3049-01）的批准。
1.低密度胚胎神经文化
- 初级皮层神经元文化的制备
- 解决方案：
- 由5毫克多聚L-赖氨酸溶解在10毫升硼酸盐缓冲液制备聚-L-赖氨酸原液。
- 制备通过在49毫升硼酸缓冲液稀释1毫升聚L-赖氨酸库存工作溶液。
- 通过395毫升卫生署2 O开始，然后添加的所有成分（1.24克硼酸+1.9克硼砂）准备硼酸盐缓冲液，pH值8.4。为1M NaOH调节pH值至8.4。调整至400毫升，并引擎盖下的0.2微米尼龙滤网过滤。
- 通过445毫升卫生署2 O开始，添加所有其他配料准备HBSS液，pH值7.2（50毫升10X HBSS股票+1.2克HEPES）。由1N盐酸，BRI调节pH至7.2纳克至500ml，并与发动机罩下的0.2微米尼龙滤网过滤。
- 准备电镀培养基：DMEM / F12，用10％的胎牛血清。与引擎盖下的0.2微米的尼龙膜滤膜过滤。
- 准备完全生长培养基：向50ml Neurobasal培养基中添加添加剂（500微升GLUTAMAX（100X）+ 500微升葡萄糖+1毫升B-27（50X）+ 500微升抗生素抗真菌溶液（100倍）+ 100微升7.5％小苏打与引擎盖下的0.2微米的尼龙膜滤膜过滤。
- 文化前两天：
- 外套1235毫米玻璃底菜用2ml聚L-赖氨酸的工作溶液，并保持罩O / N下。
- 文化前一天：
- 从培养皿空涂层剂并用的DDH 2 O冲洗允许碗碟干燥发动机机罩下一个小时。
- 制备电镀培养基（DMEM / F12，用10％胎牛血清（总溶液的10％）。加入2毫升培养基成每道菜和孵育O / N 在 37℃，5％ 的 CO 2。
注意：培养时，为了避免塑料培养皿是很重要的。玻璃底菜（适用于倒置显微镜）或盖玻片（适用于正置显微镜）的使用产生锐利和清晰的图像。相比于塑料底皿中，在玻璃底培养皿荧光显微镜中避免了不必要的色调或眩光。
- 解决方案：
- 细胞培养协议：
- 放冷藏的HBSS缓冲液（100-150毫升），100 25mm培养皿，镊子，剪刀，50ml试管，并在UV光下15ml试管中罩。
- 安乐死有5％的七氟烷吸入致死孕鼠引擎盖下培养室之外。
- 用70％乙醇，帐幕使用镊子而从尾部上腹部cavity.Open用剪刀以暴露胎盘子宫的中间切割下腹部的皮肤消毒。
- 删除8-10 E18胎儿。解放军CE含HBSS液的培养皿8-10胎儿。
- 握住钳子胎儿的后脑勺，然后用剪刀从身体切断头。将其放置在另一个培养皿中充满了5-7毫升的HBSS。转移菜罩。
- 装满冷的HBSS两个额外百毫米培养皿。
- 皮尔一边头骨和大脑舀到一个新的培养皿中充满了HBSS。
- 用锋利弯钳，独立的小脑和脑干脑，大脑再冷HBSS中转移到一个新的培养皿。
- 用镊子固定，半球用弯钳分离。删除脑膜;隔离额叶皮层和传输块放入标有15ml离心管中。
- 用新鲜2毫升HBSS填充15ml试管中，加入20微升胰蛋白酶EDTA（10倍与0.5％胰蛋白酶和5.3毫米EDTA。浓缩的混合物），以每次15毫升管。
- 孵育10-15分钟在室温。轻轻旋转管每隔几分钟，不允许沉降。
- 房颤之三10-15分钟，用玻璃吸管移除旧的HBSS，并与新的HBSS冲洗两次。
- 浸入胰蛋白酶抑制剂（1毫克/毫升，2毫克胰蛋白酶在2毫升HBSS抑制剂），拌匀，让它坐5分钟。用新鲜的HBSS洗两次。
- 使用玻璃吸管与橡胶球，磨碎脑件10-15倍非常缓慢，以避免bubbles.Triturate再次使用校准的移液管和一个无菌尖端具有减小尖端直径非常缓慢直至均匀。
- 转移解离细胞以所需密度预先制备涂布培养皿（50个细胞/平方毫米）。孵育O / N在37℃，5％CO2。
- 24小时后，用新鲜的完全生长的无血清Neurobasal培养基替代DMEM / F12培养基。
- 保持在任何时候都将细胞在5％的CO 2/95％的室内空气加湿培养箱用于实验前至少12-14天。补充细胞每5-6天用新鲜的Neurobasal培养基更换旧培养基的约50％。
2.荧光标记和免疫组化
注：原代皮质细胞培养物的免疫荧光标记是在玻璃底部35 MM细胞培养皿进行与1毫升工作体积。
- 用磷酸盐缓冲盐水pH值7.4（PBS）洗玻璃底皿两次。
- 用4％多聚甲醛的细胞在室温15分钟。
- 用PBS洗涤细胞两次并在PBS中与0.1％的Triton X-100通透5分钟。
- 处理细胞在室温20分钟用F-肌动蛋白特异性染色，AlexaFluor 488鬼笔环肽（1:40，25微升鬼笔环肽的在1毫升PBS）中。
- 冲洗细胞两次，用PBS，并在室温，用10％正常山羊血清阻断1-2小时。
- 稀释的鸡多克隆抗MAP2抗体（1：2,500）在PBS中的2％正常山羊血清，并在4℃孵育O / N
- 温育后，冲洗在PBS两次。
- 稀释二级抗体（Alexa的 - [RED 594缀合的山羊抗鸡IgG（1：500），用2％正常山羊血清和在室温下孵育2小时。
- 用PBS冲洗，加10微升/赫司特染料菜。
- 孵育3分钟在室温下，并用PBS洗两次。
注：现在标记的细胞准备第3步（F-actin的泪点计数）。 - 保持细胞样品用100微升抗淬灭剂作为盖片剂，并保持在 4℃在黑暗中长时间存放。
注意：鬼笔环肽是在PBS中在长达1周和荧光能与抗褪色盖片的试剂保留在黑暗+4℃下相对稳定。不过，最佳的图像是从染色后1-3天获得自鬼笔环肽可以开始扩展存储扩散出去。
3. F-肌动蛋白泪点计数
- 打开荧光显微镜，并切换到20倍的目标。打开显微镜软件，并设置方案在1280×960像素的图像尺寸，以及0.1在1倍变焦7微米/像素的图像分辨率。
- 根据获取绿色（495纳米）/红（613 nm）的荧光渠道共标记F-肌动蛋白/微管相关蛋白神经元的图像。
- 选择5格林（F-肌动蛋白）/红（MAP2）免疫标记/蓝（赫司特）有明确界定的树突状乔木单个神经元的荧光图像。
- 确定二阶树突段（长度范围25-75微米）连续MAP2免疫的F-肌动蛋白丰富的结构。
- 图像的所选区域旋转到水平位置。复制和粘贴为新的图像。
- 减去的图像的背景，使用为每个菜一致的调整。
- 算上亮绿色F-肌动蛋白泪点和手动由训练有素的独立观察员跟踪选定的树突状段的长度。将数据导出到电子表格文件。
- 计算由长度（L）的MAP2标记树突将总F-肌动蛋白标记的泪点（N）的密度。 Express数据为F-AC的数每10微米枝蔓锡泪点
注意：泪点F-肌动蛋白荧光与在树突轴染色的平均强度以上的至少50％的峰强度的（大小≤1.5微米）包括在每个所选树突段。
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Representative Results
在本发明的方法，我们首先培养的大鼠密度低35毫米的玻璃底菜，这使我们能够识别单个神经元的树突皮层神经元。在图1中，微分干涉对比（DIC）图像显示在天4，6，10，14， 在体外 21和27显影胎大鼠皮质神经元的形态学变化。注意，长度和树突的数量与培养的大鼠原代神经元的成熟增加。神经元在实验中只后14天成熟使用。
为了检测树突及突触的变化，我们与MAP2抗体检测树突结合鬼笔环肽F-肌动蛋白标记。由于F-肌动蛋白的鬼笔环肽标记是非常快速（20-30分钟），就可以在视觉上估计与ICC抗体标记（图2继续之前synaptodendritic网络的完整性
接下来，我们获得共同标记的鬼笔环肽（F-肌动蛋白）/ MAP2神经元的高分辨率图像和分析随机选择的神经元。细丝状伪足，脊柱突起，以及F-肌动蛋白斑块被认为F-肌动蛋白丰富的结构和被包括在我们的研究中（图3）。被选定为F-肌动蛋白泪点密度的分析二阶树突（MAP2阳性）的片段。 MAP2阳性染色用于确认所述F-肌动蛋白泪点的神经元定位。计算机辅助检测和鬼笔环肽（F-肌动蛋白）标记（绿色荧光通道）的计数突触泪点是通过使用专门的软件来执行。有图 4中一步步详细的协议2 = 0.97）。
以前，我们使用的F-肌动蛋白泪点的定量评估从HIV-1的Tat诱导synaptopathy 10诱发HIV-1达9和恢复synaptodendritic伤害。在图5中，大鼠皮质神经元共标记后的HIV-1的Tat治疗50nM的与鬼笔环肽和MAP2抗体。 MAP2染色显示更少的树突分支和减少F-肌动蛋白以下HIV-1的Tat-治疗。
我们发现，F-肌动蛋白泪点可以增加或减少响应于实验处理。 在图6中，培养的神经元与第治疗Ë缺乏竞争力NMDA受体拮抗剂美金刚，显著增加F-肌动蛋白阳性泪点。与此相反，甲基苯丙胺+ HIV-1 Tat的组合治疗导致F-肌动蛋白泪点的显著损失。
图1.胎儿大鼠皮质神经元中的细胞培养 4之间胎大鼠皮质神经元的微分干涉对比（DIC）图像- 体外 27天（20X）。神经元出现在体外 14天成熟。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.鬼笔环肽/ MAP2共同标记大鼠皮质神经元。标有MAP培养的神经元2抗体（红色）和鬼笔环肽（绿色）。合并的图像允许的鬼笔环肽染色定位于神经元树突（20X）的决心。 请点击此处查看该图的放大版本。
大鼠皮层神经元的图3 F-肌动蛋白的突触结构。 （A）左 - F-肌动蛋白阳性标记鬼笔环肽（60X）的结构。的箭头指示F-肌动蛋白标记的结构包括蘑菇棘（紫色），贴片样形态（蓝色）和长丝状伪足（橙色）。中东 - 合并后的图像表明这些F-肌动蛋白的结构定位于树突（20X）。右键-框右下角显示选择分析（20X）二阶树突分支（B）鬼笔环肽（F-肌动蛋白）（绿色）/ MAP2的树突状段。 （红色）共标记的皮质神经元（20X）被用于验证F-肌动蛋白泪点的神经元的原点。绿色只有图像（鬼笔环肽/ F-肌动蛋白）被进一步处理。选择用于泪点数量3树突段（C）的鬼笔环肽/ F-肌动蛋白（绿色）图像。密度除以N / L来确定。 N =泪点，L =树突状段长度的数量。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4.演示软件包：分步说明 请点击此处查看该图的放大版本。
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图5. HIV-1介导康达伤synaptodendritic大鼠皮层神经元，细胞培养物共染色HIV-1 Tat蛋白治疗（50nM的）后，F-肌动蛋白和微管相关蛋白。上panels-未经处理的神经元呈现强大的F-肌动蛋白，复杂的分支模式和广泛的精细神经元突起。较低的面板 - HIV-1 Tat蛋白治疗神经元减少的F-actin和减少树突分枝。 （20X） 点击此处查看该图的放大版本。
图6.在大鼠皮质神经元F-肌动蛋白泪点：由美金刚与甲基苯丙胺+ TAT处理产生不同的影响未处理培养的神经元的照片（20X），与美金刚（10μM）处理的神经元，以及神经元Methamph处理纱罗（20μM）+10纳米达纳米（10纳米）的。美金刚治疗增加了F-肌动蛋白染色，而甲基苯丙胺+ HIV-1治疗康达减少F-肌动蛋白染色和减少树突分枝。美金刚治疗显著增加F-肌动蛋白泪点密度，相对于未处理的对照培养物。相比之下，甲基苯丙胺+的HIV-1的Tat处理显著F-肌动蛋白泪点密度，相对于未处理的对照培养物降低。平均值+ SEM，* P <0.05。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
在这个协议中，我们描述了在35毫米的玻璃底菜低密度这使我们能够识别单个神经元树突培养大鼠皮层神经元。接下来，我们使用鬼笔环肽和MAP2染色检测树枝状的改变。然后，我们使用专门的软件来量化在F-肌动蛋白泪点的变化。
为了确定F-肌动蛋白泪点的个体神经元的神经全网络必须是清晰可见的变化，这使得从单个神经元适当二阶树突段的选择。低密度电镀是为了既可视单个神经元，以及尽量减少神经胶质细胞的存在至关重要。星形胶质细胞也含有F-肌动蛋白和无神经元标记，可能混淆F-肌动蛋白阳性泪点的分析。低密度培养物和用Neurobasal培养基的是在细胞培养物中降低星形细胞增殖有帮助的。然而，考虑到需要注意的是，F-肌动蛋白蛋白不特定于神经元，特定的神经元蛋白标记物，如MAP2，应用鬼笔环肽一起使用。其他蛋白的抗体也可与鬼笔环肽，如TH（酪氨酸羟化酶），用于在培养的特定神经元群体的鉴定结合使用。
为研究突触和突触形态的一个普遍的方法是免疫细胞化学（ICC）。 IC卡是受欢迎，因为对于突触蛋白许多抗体是容易获得的，包括的PSD 95，NMDA受体（突触后）以及突触素，巴松管和突触蛋白I（突触前）11。然而 ，某些结构不能由IC卡（如检测到薄丝状伪足），但与抗体检测（或与两个不同的抗体双标记F-肌动蛋白鬼笔环肽标记的组合）可以允许突触亚群和不同的反应，以实验性治疗的特定和复杂的调查。
F-肌动蛋白泪点可以是partic实验治疗ularly敏感。我们最近报道，HIV-1的Tat蛋白处理产生在F-肌动蛋白泪点（24小时）之前，为明显的神经元死亡（48小时）10任何证据的降低。这是需要注意的是试验性治疗可能增加也（美金刚）或降低（甲基苯丙胺+ HIV-1 TAT）F-肌动蛋白泪点的。我们还发现，F-肌动蛋白泪点损失是以下具体实验处理10的可逆反应。这样，F-肌动蛋白泪点量化是监视不仅急性synaptopathy，同时也为研究突触恢复和实验神经复原过程的有价值的工具。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm Glass Bottom Dishes No. 1.5 coverglass | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Boric acid | Sigma | B0252 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| ProLong Gold | Life Technologies | P36930 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Cover glass | VWR | 631-0137 | |
| AlexaFluor 488 Phalloidin | Life Technologies | A12379 | |
| Normal horse serum | Life Technologies | 26050-070 | |
| Chicken polyclonal anti-MAP2 | abcam | Ab92434 | |
| Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgG | Life Technologies | A11042 | |
| NucBlue Live cell stain ReadyProbes Reagent Hoescht 33342 | Life Technologies | R37605 | |
| NIS-Elements software package | Nikon Instruments | ||
| Nikon Eclipse TE2000-E inverted fluorescent computer-controlled microscope | Nikon Instruments | ||
| 0.2 μm Nalgene nylon membrane filter | Fishersci | 151-4020 |
References
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