Abstract
हाल ही में, ड्रोसोफिला के अंडे बिछाने वरीयता सरल निर्णय लेने की प्रक्रिया के तंत्रिका आधार अध्ययन करने के लिए एक आनुवंशिक रूप से विनयशील मॉडल के रूप में उभरा है। जब साइटों का चयन अपने अंडे जमा करने के लिए, मादा मक्खियों उनके विकल्प के रिश्तेदार आकर्षण रैंकिंग और चुनने के लिए सक्षम हैं "अधिक से अधिक के दो माल।" हालांकि, ज्यादातर अंडे बिछाने वरीयता assays अगर एक सर्किट आधार इस सरल निर्णय लेने की प्रक्रिया अंतर्निहित के लिए खोज करने के लिए एक व्यवस्थित आनुवंशिक स्क्रीनिंग दृष्टिकोण लेने के लिए, के रूप में वे जनसंख्या के आधार पर और स्थापित करने के लिए श्रमसाध्य हैं चाहता व्यावहारिक नहीं हैं। एकल महिलाओं के अंडे बिछाने वरीयताओं का अध्ययन करने के throughput बढ़ाने के लिए, हम चाहते हैं कि अप करने के लिए तीस व्यक्ति के प्रत्येक कर सकते हैं एक साथ परख अंडे बिछाने वरीयताओं को एक प्रोटोकॉल सुनिश्चित करता है कि प्रत्येक महिला एक उच्च अंडे बिछाने दर है और साथ ही मक्खियों कस्टम कक्षों विकसित (ताकि उनकी वरीयता आसानी से discernable और अधिक ठोस है कि)। हमारा दृष्टिकोण पर अमल करने के लिए सरल हैऔर बहुत अनुरूप परिणाम पैदा करता है। इसके अतिरिक्त, इन कक्षों वीडियो अंडे बिछाने जानवरों की रिकॉर्डिंग और optogenetics अध्ययन के लिए प्रकाश देने के लिए अनुमति देने के लिए विभिन्न अनुलग्नकों के साथ सुसज्जित किया जा सकता। यह लेख मक्खियों इन कक्षों में यत्न किया जा करने के लिए तैयार करने के लिए इन कक्षों और प्रक्रिया fabricating के लिए ब्लूप्रिंट प्रदान करता है।
Protocol
1. मक्खियों तैयारी यत्न किया जा करने के लिए
- / इनक्यूबेटर में cornmeal मीडिया 25 डिग्री सेल्सियस और 65% आर्द्रता पर सेट संस्कृति मानक गुड़ पर मक्खियों। शीशियों पल्ला झुकना नहीं करने के लिए ध्यान रखना। उदाहरण के लिए, एक संकीर्ण भोजन शीशी में 8 महिलाओं और 6 पुरुषों डाल दिया।
नोट: "संकीर्ण भोजन शीशी" यहां इस्तेमाल किया 2.3 सेमी की एक आंतरिक व्यास की है। हम आम तौर पर प्रत्येक शीशी में मक्खी भोजन के बारे में 10 मिलीलीटर तिरस्कृत। मक्खी भोजन नुस्खा हम इस्तेमाल यहाँ वर्णित है: http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/molassesfood.html। - 2 - 3 दिनों महिलाओं eclosion के बाद, ताजा खमीर पेस्ट के साथ शीशियों के रूप में चित्र में दिखाया गया है 1E तैयार करते हैं। 0.5% proprionic एसिड के 10 मिलीलीटर के साथ सक्रिय खमीर की 6 ग्राम मिश्रण से ताजा खमीर पेस्ट बना लें। खाद्य शीशियों के sidewall पर खमीर पेस्ट लागू करने के लिए एक रंग का प्रयोग करें। शीशियों में 25 पुरुषों - 20 के साथ 35 eclosed महिलाओं को एक साथ - 30 लीजिए।
- सामान्य तौर पर, एक ही शीशियों जहां महिलाओं से एकत्र कर रहे पुरुषों के लिए इकट्ठा(इतनी के रूप में समय और प्रयास को बचाने के लिए)। हालांकि, अगर वहाँ पुरुषों की प्रजनन क्षमता के बारे में चिंता का विषय है, बजाय गुम्मट पुरुषों का उपयोग करें। इसके अलावा, खमीर पेस्ट अंडा उत्पादन उत्तेजक के लिए महत्वपूर्ण है इसलिए यह ताजा दैनिक तैयार करते हैं।
- 25 डिग्री सेल्सियस, 65% आर्द्रता पर एकत्र महिलाओं / पुरुषों को बनाए रखें जब तक कि मक्खियों के तापमान के प्रति संवेदनशील हैं।
- ~ 4 के बाद - 5 दिन, अगर महिलाओं अंडे बिछाने के प्रयोगों के लिए तैयार कर रहे हैं देखने के लिए शीशियों की जाँच करें। वे तैयार हैं जब भोजन माध्यम की सतह लार्वा सक्रिय रूप से भोजन में बिल खोदने से गीला है (देखें चित्र 1E - एफ)।
नोट: महिलाओं को आम तौर पर बिछाने अंडे रोक एक बार भोजन सतह गीला और लार्वा से भर रही हो जाता है। यह कदम यह सुनिश्चित करता है कि महिलाओं में कई अंडे देना करने के लिए जब वे वांछित बनावट के साथ substrates मुठभेड़ के लिए तैयार हो सकता है (उदाहरण के लिए।, ~ 1% agarose)।
2. चैंबर निर्माण, विधानसभा, परख सेटअप
- एक मशीन की दुकान एक्रिलिक अंडे बिछाने कक्षों का निर्माण (फाई हैआंकड़ा 1 ए - डी)। विभिन्न टुकड़ों के इंजीनियरिंग ड्राइंग अनुपूरक चित्र 1 में दिखाया गया है -। 3 उच्च संकल्प चित्रों को भी यहां पाया जा सकता है (http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber%20design.pdf)।
- के रूप में चित्रा 1C में दिखाया लोड हो रहा है (ऊपर) चैम्बर के टुकड़े में प्लास्टिक की चादरें डालें। यह लोड करते हुए अलग-अलग अंडे बिछाने एरेनास में मक्खियों नीचे की सतह के रूप में कार्य करता है।
- सीओ 2 पैड पर महिलाओं anesthetize और उन्हें एक अंडे बिछाने के मैदान में व्यक्तिगत रूप से लोड। मक्खियों सीओ 2 से उबरने के लिए और नए माहौल को आदत बनने के लिए ~ 30 मिनट की अनुमति दें।
- agarose substrates तैयार करें।
- सुविधा के लिए, एक 55 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में पिघल 1% agarose की एक premade बोतल रखें।
- एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में शेयर सूक्रोज समाधान (2 एम) के वांछित राशि जोड़ें और agarose की उचित राशि के साथ मिश्रण। उदाहरण के लिए, 150 मिमी सुक्रोज सब्सट्रेट, पीएलए तैयार करने के लिएसीई ट्यूब में 2 एम sucrose के समाधान के 750 μl और फिर 10 एमएल निशान agarose के साथ ट्यूब भरें।
- एक ही तरीके से सादे सब्सट्रेट तैयार है, लेकिन sucrose के समाधान के बजाय आसुत जल जोड़ें।
नोट: इस प्रोटोकॉल में agarose के अंतिम एकाग्रता थोड़ा 1% से कम है। हमारे अनुभव में, agarose की सटीक एकाग्रता इतने लंबे समय कोई फर्क नहीं पड़ता, क्योंकि यह ~ 0.9 के भीतर होना करने के लिए नियंत्रित किया जाता है - 1.1% और कहा कि दो substrates ही agarose एकाग्रता के हैं।
- के रूप में चित्रा 1 डी में देखा प्रत्येक गर्त में चैम्बर और पिपेट agarose सब्सट्रेट के 1,000 μl के सब्सट्रेट (नीचे) टुकड़ा ले लो।
- agarose ~ 30 मिनट के लिए जमना करने की अनुमति दें।
- एक बार agarose substrates और मक्खियों के लिए तैयार कर रहे हैं, अंडे बिछाने चैम्बर के सभी तीन टुकड़े इकट्ठा और फिर प्लास्टिक शीट बाहर ले।
- मक्खी इन्क्यूबेटरों में कक्षों रखें।
नोट: अंडे बिछाने के प्रयोगों की लंबाई अनुभव के आधार पर भिन्न हो सकते हैंrimental की जरूरत है। (- 16 घंटा 14) हम आम तौर पर प्रयोग हे / एन चलाते हैं। इसके अलावा, अंडे बिछाने वरीयताओं पर circadian समय का कोई महत्वपूर्ण प्रभाव मनाया गया। - कक्ष में सीओ 2 इंजेक्शन द्वारा महिलाओं anesthetize। चैम्बर जुदा, मक्खी मुर्दाघर में anesthetized मक्खियों त्यागने (यानी।, एक खाली कॉफी कुछ मकई तेल से भरा जा सकता है)। रिकॉर्ड रखने के लिए परिणाम की तस्वीरें ले लो (चित्रा 2 देखें)।
- अंडे की संख्या मैन्युअल गणना और विश्लेषण के लिए वरीयता सूचकांक की गणना। के रूप में वरीयता सूचकांक की गणना (एन ए - एन बी) / (एन ए + एन ख) एन ए और बी एन क्रमशः साइट पर अंडे की संख्या का प्रतिनिधित्व करते हैं एक बनाम साइट बी।
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Representative Results
अंडे बिछाने कक्षों कई टुकड़ों से बना रहे हैं: एक सब्सट्रेट (नीचे) टुकड़ा, एक विभक्त (मध्य) टुकड़ा, एक लोडिंग (ऊपर) टुकड़ा है, और 2 फिसलने दरवाजे (चित्रा 1 ए - डी)। इन टुकड़ों को स्वतंत्र रूप से सेटअप मक्खियों और substrates से पहले अंडे बिछाने प्रयोगों के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। चित्रा 1F चलता शीशियों जब मादा मक्खियों अंडे बिछाने के लिए तैयार कर रहे हैं कैसे देखना चाहिए। मक्खियों एक सादे सब्सट्रेट और एक सूक्रोज युक्त सब्सट्रेट के बीच एक विकल्प दिया जाता है, महिलाओं के मजबूती के साथ अंडे बिछाने के रूप में चित्रा 2 में दिखाया गया के लिए सादे सब्सट्रेट को प्राथमिकता दी।
चित्रा 1. अंडे बिछाने मंडलों और अंडे बिछाने प्रोटोकॉल। (ए) पूरी तरह से इकट्ठे अंडा चैम्बर -laying। (बी) disassembled टुकड़े। एक: लोड हो रहा है टुकड़ा (ऊपर), बी:विभक्त टुकड़ा (मध्य), C: सब्सट्रेट (नीचे) टुकड़ा। (सी) चैम्बर की लोडिंग टुकड़ा 3 - इन टुकड़ों के इंजीनियरिंग ड्राइंग अनुपूरक चित्र 1 में दिखाया गया है।। एक ': दरवाजे, एक "रपट:।। रेल प्लास्टिक शीट लोड हो रहा है टुकड़ा में डाला जाता है एक मंजिल जगह में भरी हुई मक्खियों रखने के रूप में सेवा करने के लिए हम आम तौर पर प्लास्टिक शीट (लाल तीर) के किनारे पर रंग टेप डाल दिया। (डी) सब्सट्रेट (नीचे) और विभक्त (मध्य) चैम्बर के टुकड़े। Agarose ई अंडे बिछाने substrates (तीर) के रूप में सेवा करने के लिए अलग-अलग नली में जमा है। चतुर्भुज एक मक्खी के लिए अंडे बिछाने के मैदान की रूपरेखा। ( ) एकत्र महिलाओं / एक yeasted शीशी में पुरुषों के दिन 0 (एफ) दिवस 4 -।। 5 एकत्र महिलाओं / एक yeasted शीशी में पुरुषों के ध्यान दें कि लार्वा और वयस्क महिलाओं खमीर और भोजन की सतह का सबसे खाया है बन गया है लार्वा के कब्जे में। गीली सतह लार्वा के साथ रेंगने भोजन शीशी में अधिक अंडे बिछाने से महिलाओं को रोकता है। (G) योजनाबद्ध अंडे बिछाने व्यवहार प्रयोगों की स्थापना के लिए प्रोटोकॉल का चित्रण है। (यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें)
चित्रा 2. प्रतिनिधि अंडे बिछाने सुक्रोज और सादा substrates के बीच का चयन मक्खियों के लिए परिणाम। (ए) जंगली प्रकार के अंडे बिछाने परिणामों के साइड देखें गुज़र जाता है जब वे सुक्रोज (150 मिमी) और सादे substrates के बीच एक विकल्प दिया गया था। व्हाइट बॉक्स एक मक्खी के लिए एक अंडे बिछाने के मैदान की रूपरेखा। (बी) के अंडे बिछाने परिणामों के शीर्ष दृश्य। व्हाइट बॉक्स एक मक्खी के लिए एक अंडे बिछाने के मैदान की रूपरेखा। (सी) वरीयता सूचकांक ( जंगली प्रकार के पीआई) गुज़र जाता है जब एक सूक्रोज युक्त सब्सट्रेट और एक सादे सब्सट्रेट के बीच चयन करने के लिए कहा। - अंडे का / की कुल संख्या (सादा substrates पर अंडे की संख्या सुक्रोज सब्सट्रेट पर अंडे की संख्या): प्रत्येक महिला के लिए पीआई के रूप में गणना की जाती है। त्रुटि बार SEM इंगित करता है। (यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें)
पूरक चित्रा एस 1 विभक्त और चैंबर के सब्सट्रेट टुकड़ा के लिए इंजीनियरिंग चित्र।। (एक - एक ") चैम्बर के सब्सट्रेट टुकड़ा के विभिन्न विचारों। (बी - बी ') चैम्बर के बीच विभक्त टुकड़ा के विभिन्न विचारों।डी / 53716 / Supplemental1.jpg "शैली =" font-size: 14px; रेखा से ऊंचाई: 28px; "लक्ष्य =" _blank "> (इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें)
पूरक चित्रा S2 चैंबर का टुकड़ा लोड हो रहा है के लिए इंजीनियरिंग चित्र।। (ए - ए ') चैम्बर की लोडिंग टुकड़ा की ऊपरी परत के विभिन्न विचारों। । (बी - बी ') चैम्बर की लोडिंग टुकड़ा के नीचे की परत के विभिन्न विचारों (इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें)
पूरक चित्रा S3।
पूरक चित्रा एस 4। सहायक उपकरण और अनुकूलन अंडे बिछाने मंडलों की। (ए) अंडे बिछाने कक्षों वीडियो रिकॉर्ड करने के कैमरों से लैस अंडे बिछाने प्रयोगों 13 के दौरान मक्खियों। विस्तार के साथ 12 Ctrax 14 मक्खियों और कस्टम MATLAB कोड प्रक्षेप पथ साजिश करने के लिए प्रयोग किया जाता है ट्रैक करने के लिए प्रयोग किया जाता है। (बी) सेटअप लाल ligh के साथ अंडे बिछाने substrates रोशन करने के लिए टी। एल ई डी (1) एक एलईडी ड्राइवर (2) से जुड़े हैं। एलईडी तीव्रता microcontroller द्वारा नियंत्रित किया जाता है (3)। असामान्य प्रकाश व्यवस्था की स्थिति में कैमरे के बारे में अधिक जानकारी के लिए, प्रकाश वितरण प्रणाली और ट्रैकिंग जानवरों के लिए, झू एट अल देखें। और स्टर्न एट अल। (सी) लाल एल ई डी (बंद प्रकाश) अंडे बिछाने कक्षों के ऊपर से जुड़ी। (डी) लाल एल ई डी (पर प्रकाश) अंडे बिछाने कक्षों के ऊपर से जुड़ी। जब CsChrimson 15 न्यूरॉन्स सक्रिय करने के लिए प्रयोग किया जाता है 10 μW / मिमी - लाल एल ई डी के एलईडी तीव्रता आम तौर पर लगभग 7 होना तय है। (ई) अंडे बिछाने लाल बत्ती (बंद प्रकाश) के साथ प्रयोगों के दौरान कैमरा और वीडियो रिकॉर्ड करने के लिए मक्खियों एल ई डी के साथ सुसज्जित कक्षों। (एफ) अंडे बिछाने कक्षों लाल बत्ती (पर प्रकाश) के साथ प्रयोगों के दौरान कैमरा और वीडियो रिकॉर्ड करने के लिए मक्खियों एल ई डी के साथ सुसज्जित। (टी: 28px; "लक्ष्य =" _blank "> इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें)
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Discussion
कक्षों और यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल पिछले अंडे बिछाने assays पर कई सुधार किया है। पहला, वे काफी एकल जानवरों की वरीयताओं को परख करने की क्रिया के throughput वृद्धि हुई है। प्रत्येक कक्ष में 30 एकल महिलाओं परख सकते हैं और एक घंटे की स्थापना करने की तुलना में यह कम समय लेता है। दूसरा, वे पिछले तरीकों पर अंडे बिछाने वरीयताओं की स्थिरता को बढ़ाने के। क्षेत्र के आयामों के मानकीकरण, substrates के बीच अंडे बिछाने substrates के आकार और दूरी के लिए यह आसान विभिन्न प्रयोगात्मक दिनों के बीच और विभिन्न अनुसंधान समूहों से परिणामों की तुलना करने के लिए बनाता है। तीसरा, कक्षों अतिरिक्त विश्लेषण एक (पूरक चित्रा 4) को आगे बढ़ाने के लिए करना चाहता है समायोजित करने के लिए अनुलग्नकों के साथ फिट किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, व्यवहार विश्लेषण के लिए, वीडियो कैमरा मक्खियों 7,11-13 रिकॉर्ड करने के लिए कक्ष के ऊपर से जुड़ा जा सकता है। सबसे महत्वपूर्ण बात, इस दृष्टिकोण स्केलेबल है। इन कक्षों अपेक्षाकृत INEX हैंएक मशीन की दुकान की मदद से निर्माण करने के लिए चिंताग्रस्त। इसके अलावा, यह आम तौर पर एक कुशल कामगार कम से कम 2 घंटे 5 कक्षों (150 एकल महिलाओं) अंडे बिछाने assays के लायक स्थापित करने के लिए ले जाता है।
सबसे महत्वपूर्ण कारक है जब एकल महिलाओं के अंडे बिछाने वरीयता का अध्ययन करने से एक यह सुनिश्चित करें कि प्रत्येक महिला में कई अंडे बिछाने के लिए primed है है। ( "50 बनाम 0 अंडा" एक वरीयता ज्यादा "1 बनाम 0 अंडा 'की एक प्राथमिकता से अधिक कायल है)। इस प्रोटोकॉल, जब ठीक से मार डाला, नियमित रूप से जंगली प्रकार मक्खियों (गुआंगज़ौ एस और w1118) कम से कम 50 अंडे देना / प्रति महिला हे / एन की अनुमति चाहिए। कई कारकों उच्च अंडे बिछाने दर के साथ महिलाओं के उत्पादन के लिए योगदान करते हैं। सबसे पहले, एक ख्याल रखना जब महिलाओं संवर्धन यत्न किए जाने की शीशियों / बोतलें overpopulate नहीं करना चाहिए। भीड़भाड़ अक्सर छोटे लार्वा, जो छोटे महिलाओं है कि कम अंडे देते हैं के रूप में विकसित होगा पैदा करता है। दूसरा, एक है कि महिलाओं assayed हो खमीर पेस्ट के बहुत सारे के लिए उपयोग जब एक साथ बुद्धि मिलाया है सुनिश्चित करना चाहिएखाद्य शीशियों में ज पुरुष थे। यह सिफारिश की है कि 0.5% proprionic के बजाय एसिड पानी क्योंकि proprionic एसिड न केवल अंडे बिछाने बढ़ जाती है, लेकिन यह भी शीशियों में फंगल संक्रमण को कम कर देता खमीर पेस्ट तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। तीसरा, एक भोजन शीशियों के चित्र चित्रा 1F में दिखाया गया है की तरह लग रही के लार्वा / खाद्य सतह तक महिलाओं परख नहीं करना चाहिए; यदि पर्याप्त अंडे बिछाने नहीं वंचित, महिलाओं के रूप में कई अंडे जब कक्षों में यत्न करना नहीं होता। यह भी ध्यान रखें कि भोजन का यहां इस्तेमाल किया शीशियों "संकीर्ण शीशियों" कर रहे हैं। 5 दिन - एक बड़ा व्यास के साथ शीशियों का उपयोग करता है, एक महिलाओं / पुरुषों की संख्या शीशी में रखा जाना करने के लिए वृद्धि करने के लिए इतना है कि महिलाओं के 4 में यत्न किया जा करने के लिए तैयार हो जाएगा की जरूरत है।
प्रोटोकॉल यहाँ विशेष रूप से वर्णित महिलाओं की जांच पर केंद्रित है, जबकि अन्य की स्थिति में वरीयता 'सुक्रोज और सादे substrates के बीच वरीयताओं, यह महिलाओं का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता।' उदाहरण के लिए, इन कक्षों Assa करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताY 'मक्खियों वरीयता जब substrates कि अन्य chemosensory संकेतों में मतभेद के रूप में कठिन है और नरम agarose के बीच चुनने (जैसे।, 1% बनाम 1.5% agarose), साथ ही (जैसे।, 3% एसिटिक एसिड)। अगर ढक्कन कि एक या दोनों substrates रोशन करने के लिए एलईडी शामिल है के साथ सज्जित, चैम्बर भी optogenetic स्टडीज (अनुपूरक चित्रा 4) का संचालन करने के लिए एक कुशल मंच प्रदान कर सकता है।
अंत में, यह ध्यान देने योग्य बात है कि हालांकि इस सेटअप ड्रोसोफिला के अंडे बिछाने वरीयताओं का विश्लेषण करने के लिए उच्च throughput की अनुमति देता है, यह कुछ महत्वपूर्ण सीमाएं हैं लायक है। सबसे पहले, कक्षों की अचल आयाम व्यवहार परख के लचीलेपन को सीमित करता है। उदाहरण के लिए, एक आदेश कैसे अन्य मानकों (जैसे।, Substrates के बीच दूरी) मक्खियों के अंडे बिछाने वरीयताओं को प्रभावित कर सकता है परीक्षण करने के लिए नए कक्षों बनाने की आवश्यकता होगी। इसके अलावा, इस प्रणाली के जंगलों में जटिल माहौल ड्रोसोफिला मुठभेड़ कब्जा नहीं करता। यह मक्खियों कि एक शुद्ध सुक्रोज सब्सट्रेट बनाम प्रकृति में अंडे बिछाने के लिए एक शुद्ध सादा सब्सट्रेट के बीच फैसला करना होगा बहुत दुर्लभ है। इस प्रकार, जबकि हमारे परख एक सरल फैसला कार्य के तंत्रिका आधार का अध्ययन करने में कुशल है, एक पता है कि विशिष्ट "निर्णय" महिलाओं के हमारे कक्षों में बनाने ethologically प्रासंगिक नहीं हो सकता है की जरूरत है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Water bath | Fisher | 15-462-6Q | |
| LifeCam Cinema webcam | Microsoft | H5D-00013 | |
| Red LEDs | Cree | C503B-RAN-CA0B0AA1 | |
| Egg-laying chambers | Custom Built | ||
| Camera holders | Custom Built | ||
| LED holders | Custom Built | ||
| Fly vials (narrow) | Genesee | 32-116BC |
References
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