Abstract
Intracerebrale parenkymceller arterioler (PAS), som inkluderer parenkymatøs arterioler, gjennomtrengende arterioler og pre-kapillær arterioler, er høy motstand blodkar forgrening ut fra pial arterier og arterioler og dykke inn i hjernen parenchyma. Individuell PA perfuse en diskret sylindrisk territorium parenchyma og nervecellene som finnes. Disse arterioler er en sentral aktør i reguleringen av cerebral blodstrøm både globalt (cerebrovaskulær autoregulation) og lokalt (funksjonell hyperemia). PAs er en del av neurovascular enhet, en struktur som tilsvarer regionale blodstrømmen til metabolsk aktivitet i hjernen og omfatter også nevroner, interneuroner og astrocytter. Perfusjon gjennom PAs er direkte knyttet til aktiviteten av neuroner i det aktuelle område og økning i nevronal metabolisme fører til en styrking i lokal perfusjon forårsaket av utvidelse av foret PA. Regulering av PAs skiller seg fra bedre-pregetpial arterier. Pressure-indusert vasokonstriksjon er større i PAS og vasodilaterende mekanismer variere. I tillegg trenger PAs ikke får ytre innervasjon fra perivaskulær nerver - innervasjon er egenverdi og indirekte i naturen gjennom kontakt med astrocytic endfeet. Dermed data om kontraktile regulering akkumulert av studier med pial arterier ikke direkte oversette til å forstå PA funksjon. Videre er det fortsatt ikke avklart hvordan patologiske tilstander som høyt blodtrykk og diabetes, påvirker PA struktur og reaktivitet. Dette kunnskapsgapet er delvis en konsekvens av tekniske problemer knyttet til PA isolasjon og kanylering. I dette manuskriptet presenterer vi en protokoll for isolasjon og kanylering av gnager PAS. Videre viser vi eksempler på forsøk som kan utføres med disse arterioler, inkludert agonist-indusert konstriksjon og myogenisk reaktivitet. Selv om fokus for dette manuskriptet er på PA kanylering og trykk myography, isolert PAs kan også benyttes for biokjemiske, biofysiske, molekylære, og avbildningsstudier.
Introduction
Den cerebral sirkulasjon er unikt organisert for å understøtte de metabolske kravene til sentralnerveceller, celler som har begrenset energilager, og er følgelig meget følsomme for endringer i oksygentrykk og tilførsel av nødvendige næringsstoffer. Som spesielle nerve subpopulasjoner blir aktive når bestemte oppgaver utføres, fremmer blodkar et sterkt lokalisert økning i perfusjon å hindre lokal hypoksi og utarming av næringsstoffer 1. Dette er en form for funksjonell hyperemia kjent som neurovaskulær kopling, og er avhengig av riktig drift av neurovascular enhet, som består av aktive neuroner, astrocytter og cerebrale arterier 2. Intracerebrale parenchymale arterioler, en gruppe av blodkar som omfatter parenkymal, gjennomtrengende og pre-kapillære arterioler, er sentralt viktig for denne reaksjon, og det er da viktig å studere dem enkeltvis for å undersøke neurovascular kopling 3.
<p class = "jove_content"> parenchymale arterioler er små (20-70 nm indre diameter) med høy motstand blodkar som perfuse distinkte neuronpopulasjoner i hjernen. Forgrening ut fra pial arterier på overflaten, parenchymale arterioler trenge inn i hjernen parenchyma ved en nesten 90 ᵒ vinkel til mate undergrunnen mikrosirkulasjon (figur 1). Disse arterioler spille en avgjørende rolle i å opprettholde passende perfusjonstrykk som de er de mest distale glatte muskel-oppbevaringsbeholdere som beskytter kapillærer. I motsetning til overflaten pial sirkulasjon, parenchymale arterioler mangler sikkerhet grener og anastomoser, og følgelig er "flaskehalser" av cerebral sirkulasjon 4. Som et resultat av dysfunksjon av parenchymale arterioler bidrar til utvikling av cerebrovaskulære sykdommer så som vaskulær demens og små iskemisk slag (også kjent som tause eller lakunære slag). studier .indikatorere at parenchymal arterioler dysfunksjon kan induseres ved essensiell hypertensjon 5, kronisk stress 6, og er en tidlig begivenhet i småkarssykdom genetisk musemodell 7. Videre er eksperimentelt-indusert okklusjon av enkle penetrerende arterioler i rotter er tilstrekkelig til å forårsake små iskemisk slag som er sylindrisk i form, tilsvarende det som ble observert hos eldre mennesker 8.I tillegg til disse anatomiske forskjeller, mekanismer som regulerer kontraktile funksjon varierer mellom pial arterier og parenkymatøs arterioler. Myogenisk vasokonstriksjon er større i parenchymale arterioler 9, muligens på grunn av den manglende ytre innervasjon 10, distinkte måter mechanotransduction 11, og forskjeller i intracellulær Ca2 + signale 12,13 i vaskulære glatte muskelceller. Tyder på at endotel-avhengig vasodilaterende mekanismer også variere mellom disse vascuLar segmenter, med parenkymceller arterier stiller større avhengighet av mekanismer som involverer Ca 2+-aktivert K + -kanaler og electrotonic kommunikasjon i karveggen sammenlignet med diffusible faktorer som nitrogenoksid og prostacykliner 14. Derfor data samlet i eksperimenter med pial arterier kan ikke nødvendigvis gjelder for parenkymatøs arterioler, etterlot et tomrom i vår kunnskap om lokal kontroll av cerebral perfusjon.
Til tross for sin betydning, parenkymceller arterioler er langt under-studert, hovedsakelig på grunn av de tekniske utfordringene med isolasjon og montering for ex vivo studier. I dette manuskriptet beskriver vi en metode for å isolere og cannulate cerebrale parenkymceller arterioler, som kan brukes for trykk myography, eller for å isolere vev for immunolabeling, elektrofysiologi, molekylær biologi, og biokjemisk analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kanyle og Chamber Forberedelse
- Sett ren borosilikatglass kapillærer (ytre diameter: 1,2 mm, indre diameter: 0,69 mm; 10 mm i lengde) inn i sporene til en pipette puller med en platina-filament (diameter 100 pm).
- Bruke riktige innstillingene, trekk kapillær å generere en kanyle med en lang og tynn spiss (figur 2) med en mikropipette avtrekker. Innstillingene som brukes er: Heat - 700, Pull - 100, Velocity - 50, Time - 10.
- Sett kanylen inn i holderen av trykk myograph kammeret. Juster kanyler riktig.
- Nøye bryte spissene av kanyler ved hjelp av en pinsett under disseksjonsmikroskop til den ønskede diameter. Her viser vi en kanyle med en 10 mikrometer spiss (figur 2).
- Fyll begge kanyler med kunstig cerebrospinalvæsken (aCSF) som inneholder 1,8 mM Ca 2+; fylle kammeret med Ca 2+ -fri aCSF supplert med 1% bovint serumalbumin (BSA) + 10 pM Diltiazem (alle løsninger bør fremstilles frisk før starten av eksperimentet). Avhengig av størrelsen av kammeret, variere volumet av aCSF mellom 5 til 20 ml. Oppbevar kammeret ved 4 ᵒ C til den er klar til å starte kanylering.
MERK: Diltiazem er en reversibel L-type spenning gated kalsium inhibitor som vil føre til utvidelse av arterioler, hvilket letter kanylering
2. Isolering av Parenkymalt arterioler
- Avlive dyret umiddelbart før disseksjon ved hjelp av standard protokoller i laboratoriet som er godkjent av institusjonens dyr omsorg komité. Bruken av barbiturater eller karbondioksyd er å foretrekke, som andre vanlig anvendte anestetika kan ha vasodilaterende effekt på cerebral sirkulasjon 15. Alle dyr prosedyrer som vises her er godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Nevada School of Medicine, og er i agreement med National Institutes of Health "Retningslinjene i omsorg og bruk av dyr".
- Avlive dyret ved hjelp av karbondioksid. Før halshogging, sikre at dyret har sluttet å puste, og ikke svarer når klyping potene.
- Halshogge dyret med en skarp saks (mus) eller giljotin (rotte). Fjern skinnet fra dyrets hode og skjær langs midtlinjen kranie sutur med en fin spiss saks. Ved hjelp av en sløv tang (mus) eller et bein tang forsiktig fjerne de kraniale bein og avsløre storhjernen. Fjern hjernen langsomt og forsiktig for å ikke skade overflaten pial arterier. Sett hjernen i en beholder fylt med 20 ml Ca 2+ -fri aCSF supplert med 1% BSA på is.
- Fylle et disseksjon skål inneholdende en pute med iskald Ca2 + -fri aCSF supplementert med 1% BSA og overføre hjernen med den ventrale overflate som vender oppover på denne tallerken (figur 2A). Sett fatet under en dissecting mikroskop (figur 3A). Pin hjernen til puten ved hjelp av 27-måle nåler. Vær nøye med å unngå å plassere pinnene nær midten cerebral arterie (MCA).
- Lokalisere Circle of Willis og MCA forgrening fra det. Skarpe og justert Vännäs våren saks, klippe et lite rektangel rundt MCA. Sørg for at rektangelet er nær 5 mm over gjennom hele lengden av MCA. Den øverste delen av rektangelet skal være forbi forgreningspunktet fra Circle of Willis (proksimale til Circle of Willis, figur 2B, pil).
- Ved hjelp av fjær Vännäs saks, utfører en underskjæring inn i dybden av vevet i ca. 2 - 3 mm.
MERK: Denne delen er avgjørende for god isolasjon av parenkymatøs arterioler, og det kan ta noen forsøk for å få det riktig. Hvis kuttet er notatet gjort dypt nok, vil de isolerte parenkymceller arterioler være kort; hvis kuttet er for dypt, vil arterioler bryte på sitt forgreningspunkt når dissekertvev er fjernet. - Peke ut den mest fjerntliggende enden av hjernen skive inn i dissekere fatet med MCA vendt oppover (distal fra Circle of Willis) med insektnålene. Gjør et grunt snitt til å kutte pia nær pinnen, er forsiktig med å kutte for dypt inn i den underliggende cerebral cortex (ellers pinnene holder ikke).
- grip nøye hver side av pia med små pinsett og starte peeling pia fra cortex. Om nødvendig, holde på MCA, slik at den omkringliggende pial membranen ikke skades.
- Hold peeling til pia inneholder MCA er fri fra cortex. Legg merke til at motstanden mot peeling vil øke nær Circle Willis. Vær ekstra forsiktig på dette punktet, fordi de lengre parenkymceller arterioler vil være i denne regionen.
- Når pia er gratis, legger den forsiktig på toppen av puten på dissekere fatet med overflaten motsatt parenkymatøs arterioler vendt nedover (figur 2B). <li> Bruke Vännäs våren saks, klippe ut dissekert arterioler fri fra MCA, og pass på at endene av fartøyet er kuttet rett ut.
- Innsamlede arterioler kan brukes for trykk myography, molekylær analyse, eller isolering av naturlig glatt muskel eller endotelceller.
3. Trykk Myography
- Forbered sutur forhånd. Skjær mørk grønn nylontråd inn i 5 mm biter og legg på den klebrige siden av en dobbeltsidig tape på en petriskål. Under dissekere mikroskop, skille hver brikke i sine filamenter som bruker fine tang, og løst forberede et enkelt halvstikk knute ved å føre den ene enden filamentet inn i den andre.
- Bruk pinsett, plukke en knute av dobbeltsidig tape, og pass på å ikke ta den med for mye press. Trekk sutur i badekaret løsning, sklie knute på kanylen og skru den på avstand fra spissen av kanylen. Gjenta denne prosessen til å ha 2 sting på hver kanyle.
- Coat et glassmikropipette med en 10% BSA løsning og skyll av overflødig med Ca 2+ -fri aCSF supplert med 1% BSA.
- Trekk 50 ul oppløsning i glasset mikropipette, trekke opp en parenkymatøs arteriole og overføre til trykk myography kammeret. Presse stempelet i en flytende bevegelse for å dispensere den parenchymal arteriole inn i kammeret for å hindre at det fester seg til det indre kammeret av glasset mikropipette.
- Ved hjelp av to super fin pinsett, åpne lumen av PA, er forsiktig med å bare berøre helt på slutten av fartøyet.
- Ved hjelp av pinsett for å holde kantene av parenkymal arterioler trekke fartøyet forsiktig inn på kanylen. Trekk langt nok på kanylen, slik at fartøyet er ikke helt på koniske enden av kanylen (figur 3A).
- Løsne de 2 sting på kanylen og skru dem på fartøyet (figur 3B). Space sting hverandre litt på fartøyet, og trekk mot operatøren mens Tighti det. Sørg for at alle grenene er bundet av før du lukker den motsatte enden av parenkymatøs arteriole.
- Snu seg rundt kammeret og lukker den motsatte ende av parenchymal arteriole som en blindgate. For å oppnå dette, åpner bånd på motsatt kanylen og passerer den på arteriole. Sakte lukker knute på en slik måte at den parenchymal arteriole vil bli knyttet til den side av kanylen. Unngå langsgående strekning av arteriole. (Figur 3C).
MERK: Hvis målet med studien er å perfuse narkotika gjennom lumen, cannulate den motsatte enden i stedet for å knytte parenkymatøs arteriole til siden av kanylen. Pass på at kanyler har ikke noen saltkrystaller eller interne bygge-ups som blokkerer intraluminal flyt. Regulering av strømningshastigheten på riktig måte for å opprettholde skjærspenning innenfor fysiologiske nivåer. En studie av Shih et al. Viser strømningsrater inne trengende arterioler i rotter 8, og kan tjene som en innledende guide for pimye studier. - overføre nøye kammeret til det stadiet av mikroskopet som skal brukes for opptak av kardiameteren. Fest kammeret på mikroskopet scenen, kobler temperatursonde og innløp og utløp for perfusjon til de riktige rørene. Trykksette arteriole til 40 mmHg intraluminale trykk for mus parenchymale arterioler eller 50 mmHg for rotte arterioler, ved hjelp av et trykksystem er tilgjengelig i laboratoriet (vannsøyle, peristaltisk pumpe er koplet til en trykktransduser, osv.). Figur 4D viser et eksempel på en peristaltisk pumpe koblet til en trykkgiver for å trykksette cannulated arteriole.
- Slå på systemet som brukes for å detektere endringer i diameter (figur 3E). Justere innstillingene på mikroskopet, slik som belysning og kontrast, for å oppnå den beste påvisning mulig. Ideelt veggene i arteriole bør være mørkt og lumen gjennomskinnelig. Når søket er hensiktsmessig, starte opptak than eksperimentere.
- Start superfusjonssystem. Vask den kanylerte, trykk parenchymal arterioler med varm (37 ᵒ C) aCSF inneholdende 1,8 mM Ca 2+ i 15 til 20 min ved en strømningshastighet mellom 3 - 5 ml / min. Dette aCSF bør ikke inneholde Diltiazem eller BSA.
- Bytt ut den vanlige aCSF med 60 mM KCl aCSF å vurdere levedyktigheten til forberedelse. På dette punktet PAs skal fremvise 10-20% innsnevring til 60 mM KCl. Hvis arteriole ikke constrict i den utstrekning, fjerne og cannulate annen arteriole.
- Vask ut 60 mM KCl med vanlig aCSF. Vent til generasjon av spontan myogenic tone, noe som kan ta opptil en time. Hvis arteriole ikke har myogenic tone da, erstatte den med en annen arteriole.
MERK: myogenisk tone er observert som en gradvis, og noen ganger sakte, reduksjon i lumen diameter av beholderen uten stimulering av kontraktile agonister eller høye KCl-oppløsning. Myogenisk tone blir beregnet ved følgende fformelen: med (1 - (aktiv lumendiameter / passiv lumendiameter)) x 100 5 En passende mengde av myogenisk tone kan variere i henhold til behandlinger, stammer, arter, transgene, osv.. Generelt varierer fysiologisk myogenisk tone 15-30% 5.
4. Eksempel Trykk Myography eksperiment: agonist-indusert innsnevring og myogenic reaktivitet
- Forbered en rekke fortynninger av en agonist av valget i aCSF ved hjelp av egnede konsentrasjoner. For det nåværende eksempel tromboksan A 2 reseptor agonist U46619 ble anvendt. En stamløsning av 1 ml av U46619 i en konsentrasjon på 1 mM ble fremstilt. Overføre 100 ul av 1 mM løsning i et nytt rør inneholdende 900 ul av aCSF for å lage en 10 gangers fortynning av medikament, som resulterer i en oppløsning inneholdende 100 uM U46619. Gjenta denne fremgangsmåten til 6 fortynninger, som strekker seg fra 1 mM til 100 nM for å fremstille en konsentrasjon-responskurve konstriktor.
- Tilsetthele volumet av oppløsningen som inneholder agonisten (1 ml for den første dose, etterfulgt av 900 ul av alle påfølgende doser) i 100 ml superfusing aCSF. Dette vil føre til en ekstra 100-gangers fortynning av agonisten. Således, de endelige konsentrasjoner av agonist i badekaret området fra 10 pm til 10 uM. Tillat arterioler å inkubere i ~ 10 minutter i hver konsentrasjon, inntil luminal diameter når en steady-state.
- Vask ut agonist ved superfusing PAs med aCSF uten rusmidler inntil PA diameter er tilbake til den opprinnelige verdien. Inkuber parenchymal arteriole i Ca2 + -fri aCSF (uten BSA) supplert med 10 uM Diltiazem + 2 mM EGTA for å indusere maksimal dilatasjon og registrere passiv diameter av arterioler.
- Fjern parenkymatøs arteriole fra kanylen ved å trekke det ut mens du holder inn i enden av båndene. Vask fartøyet kammer med dobbelt avionisert vann for å fjerne rusk og overskudd av agonist. Fyll kammeret med Ca2+ -fri aCSF + BSA og cannulate annen arteriole. Det anbefales ikke å utføre mer enn ett forsøk per arteriole.
- For å utføre en myogenic reaktivitet eksperiment, la parenkymatøs arteriole skal stabilisere seg på 40 mmHg intraluminal trykket inntil spontan myogenic tone genereres (beskrevet ovenfor). Redusere den intraluminale trykk under 5 mmHg og tillate PA til likevekt i ~ 5 - 10 min, inntil luminal diameter når stabil tilstand. Øke den intraluminale trykk trinnvis ved hjelp av intervallet av valg (for eksempel fra 5 til 140 mmHg i 20 mmHg trinn).
- Ikke utsett arteriole til intraluminal trykket under 5 mmHg, som det kan føre til kollaps og skade endotelet, og dermed endre utfallet av eksperimentet.
- Ved slutten av den trykk-kurve, superfuse parenchymal arteriole med Ca2 + -fri aCSF (uten BSA) supplert med 10 uM Diltiazem + 2 mM EGTA og gjenta trykkfremgangsmåten, som starter ved Lowest press.
MERK: Dette vil gi de passive diameter på PA, som er nødvendige for å beregne% myogenic tone, definert ved formelen:% tone = (1 - (aktiv diameter / passiv diameter)) x 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 5A viser en representativ innsnevring av mus PAS til 60 mM KCl aCSF å evaluere integriteten av preparatet. PAs skal innsnevre mellom 15 - 30%, i nærvær av 60 mM KCl. Hvis innsnevringen er under 15%, forkaste PA og cannulate en annen, så det tyder på at arteriole ble skadet under isolasjon og kanylering prosess.
Figur 5B illustrerer PA innsnevringen til økende konsentrasjoner av tromboksan A 2 analog U-46619 (10 pm til 1 uM) inn i superfusing badekaret. Den innsnevring som ble observert en reduksjon i lumen diameter etter inkubering med hver konsentrasjon. PA ble tillatt å ekvilibrere ved hver konsentrasjon i 10 minutter. Disse dataene kan bli analysert og presentert som en endring i diameter (ΔDiameter) eller som en% vasokonstriksjon til KCl, hvilken normaliserer Change i diameter ved den maksimale innsnevringen til 60 mM KCl.
Figur 6 viser et representativt sporing av hulrommet diameteren av en PA i en myogenisk reaktivitet eksperiment. Trinnvise økninger i intraluminale trykk forårsaker en gradert innsnevring av PA-er i nærvær av 1,8 mM ekstracellulær Ca 2 + (figur 6, lavere tracing). Inkubasjon av den samme PA med aCSF uten Ca2 + og supplert med 10 uM Diltiazem + 2 mM EGTA opphever myogenic tonegenerering, og lumen diameteren av PA øker ifølge intraluminale trykk (figur 5, øvre tracing), som er den passive lumen diameter av arteriole.
Figur 1: Skjematisk av Parenkymalt arterioler. PAs gren av overflaten pial arterier og dykke inn i den underliggende hjernen parenchyma. Hver PA perfuses en liten nevronale befolkningen innenfor sitt søyle territorium (uthevet regioner). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2:. Isolering av Mouse Cerebral PAs A) Bilde av hjernen med ventral overflaten vendt oppover viser Circle of Willis (pil 1) og MCA forgrening ut fra det (pil 2). B) Bilde av MCA med den underliggende hjernevev. Pilen peker til de mest proksimale regionen i MCA fra Circle of Willis. C) PAs forgrening ut av MCA (piler). Bar = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 
Figur 3: kanylering av Isolert Mouse PAs A) Bilde av en PA cannulated men ennå ikke bundet med sting.. Dette bildet viser lengden av PA som skal settes inn på kanylen før lukker den med suturer. B) PA er nå stengt på kanylen med 2 sting for å garantere at det ikke vil gli av kanylen etter trykksetting. C) Bilde av en cannulated, trykk mus PA i en blind-sac eksperimentelle konfigurasjon. Bar = 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Utstyr brukt i vårt laboratorium for PA Eksperimenter A) Dissection mikroskop med.lyskilde. B) Temperatur kontrolleren. C) Peristaltisk pumpe for badekar superfusjons av aCSF. D) Trykk Servo Control, levende systemer Instrumentation. E) Video Dimension Analyzer (nederst til høyre), overvåke (øverst til høyre) og Video kantdeteksjon system lastet på en laptop (til venstre). F) Små fartøy kammeret (lineær justering kammer). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Sammentrekning av PAS til KCl-indusert depolarisasjon og tromboksan A 2 Analog U46619 A) Representative innsnevring av mus PAS til 60 mM KCl aCSF å evaluere integriteten av preparatet.. PAs skal innsnevre mellom 15 - 30%, i nærvær av 60 mM KCl. B) U46619 indusert innsnevring av PAs; som er observert i tracing, fører U46619 enkonsentrasjonsavhengig innsnevring av PAs, observert som en reduksjon i lumen diameter etter inkubasjon med hver konsentrasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6:. Myogenisk Reaktivitet av PAs Trinnvis økning i intraluminal press fører til en gradert innsnevring av PAs i nærvær av 1,8 mM ekstracellulært Ca 2+ (lavere tracing). Dette trykk-indusert konstriksjon er karakteristisk for motstands arterioler. Inkubasjon av den samme PA med aCSF uten 1,8 mM Ca2 + og supplert med 10 uM Diltiazem + 2 mM EGTA opphever myogenic tonegenerering, og lumen diameteren av PA øker ifølge intraluminale trykk (øvre tracing), som er den passive lumen diameter på the arteriole. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cerebral parenkymceller arterioler er høy motstand arterioler med få anastomoser og greiner som perfuse forskjellige nevronale populasjoner. Disse spesialiserte blodårer er sentrale aktører i cerebrovaskulær autoregulation og nevrovaskulære kobling gjennom astrocyte-mediert vasodilatasjon en. Betydningen av disse spesialiserte blodårer i cerebral vaskulær sykdom har vært kjent i ca 50 år, når det banebrytende arbeidet til Dr. Miller Fisher beskrevet strukturelle endringer i parenkymceller arterioler innenfor territoriene til lakunære infarkter i hjernen til hypertensive pasienter post-mortem 16 . Disse endringene, koblet til funksjonssvikt, kan forårsake hypoperfusjon av den dype hvite substansen, en viktig risikofaktor for utvikling av vaskulær relatert demens 17. Parenkymceller arterioler er funksjonelt forskjellig fra store intrakranielle og pial arterier samt overflate arterioler, og dermed akkumulert data bruke disse medlemmer av cerebrovaskulær treet kan ikke være lett ekstrapoleres til parenkymatøs mikrosirkulasjonen. Til tross for sin klart betydning i å opprettholde riktig hjernen homeostase, studier som fokuserer på fysiologi og funksjonelle responser til disse arterioler har vært mangelvare inntil de siste årene, hovedsakelig på grunn av tekniske problemer i forbindelse med isolasjon og manipulasjon.
I den foreliggende manuskriptet beskriver vi en enkel og reproduserbar teknikk for isolering og kanylering av parenkymceller arterioler for trykk myography studier, molekylær analyse, eller ved fremstilling av naturlig glatt muskel eller endotelceller. Videre presenteres data på bruken av denne teknikk for å undersøke myogenic regulering, constrictor, og dilatory mekanismer i parenchymale arterioler. Vi ser at disse fartøyene er myogenically aktiv, genererer spontan myogenic tone når intraluminal trykket opprettholdes på et konstant nivå, samt å endre sinmyogenic status overfor endringer i intraluminal press, et fenomen godt beskrevet for motstandsarterier kalt myogenic reaktivitet 18. Myogenisk reaktivitet er en nøkkelfaktor i regulering av perfusjonstrykket i hjernen, og holder den konstante klednings svingninger i systemisk arterielt trykk, og dermed hindre tap av perfusjon ved lave trykk, eller vasogenic ødem ved høyere trykk 18. I tillegg, viser vi at disse arterioler svare på vasoaktive substanser, slik som endotelin-1, et viktig endogen vasokonstriktor produsert av endotelceller. En vesentlig begrensning av preparatet som er beskrevet her er at ved å isolere parenkymceller arterioler vitale komponenter i neurovascular enhet går tapt og funksjonelle hyperemic responser kan ikke bli studert. Andre preparater, slik som hjerne skive, opprettholde strukturen av det intakte neurovascular enhet og er mer hensiktsmessig å studere astrocytic kontrollen av cerebral arteriolar diameter 19. However, i hjernen skive fremstillingen, parenchymale arterioler ikke er satt under trykk og eksogen administrering av reseptor-avhengig vasokonstriksjonseffekter midler er nødvendig for å etterligne basal tone for å studere vasodilaterende respons. Trykk myography og hjernen skive fremstillingen bør vurdere komplementære for studiet av cerebral mikrosirkulasjonen.
Protokollen er beskrevet her var tilpasset fra en forberedelse først beskrevet av Dacey og Duling i 1982 20, og forandret av Coyne et al. 21. Den store forskjellen ligger i kanylering teknikken som brukes. Mens Dacey og Duling og Coyne et al brukt to forskjellige sett med pipetter, et holdingselskap ekstern pipette og en intraluminal kanylering pipette, bruker vi bare intraluminal pipette og manuelt skyve PA inn i pipetten . Denne teknikken har nylig blitt brukt til å utføre studier på rotter PAs etter cerebral iskemi - reperfusjonsskade 22, Pas fra Krønkjemisk hypertensive rotter 5, blant andre. I mus, benyttet vi denne teknikken for å vurdere Ca 2+ signaler i trykk PA glatte muskelceller under fysiologiske betingelser og acidose ved kobling PA kanylering til laser scanning konfokal mikroskopi for å vurdere Ca 2 + bølger og gnister i glatte muskelceller 13. Vi har også testet flere nevrovaskulære kobling agenter 3 og demonstrerte, ved hjelp av farmakologiske verktøy i forbindelse med membran potensielle innspillinger, som cerebrospecific oppregulering av spenningsstyrte kaliumkanaler K V 1 fører ionekanalsvikt-lignende feil i småkarssykdom genetisk modell 7. Disse eksemplene illustrerer levedyktigheten av dette preparatet for å svare på ulike problemstillinger.
Det er viktig å understreke at isolering av cerebrale PAS fra hjernevevet er det mest kritiske trinn, som den enkle kanylering vil avhenge av antallet og lengden av PAS isolated. Det kan ta noen forsøk for å optimalisere isolasjon. Videre kan læringskurven for kanylering være lang og frustrerende, og innledende suksess priser kan være så lav som 50%. Imidlertid, når mestret, reproduserbarheten og gjennomstrømningen av denne teknikken er høy, og mange eksperimenter kan utføres på en dag.
Oppsummert beskriver den nåværende manuskriptet en teknikk for isolering og kanylering av cerebral parenkymatøs arterioler. Et slikt preparat isolert vaskulær komponenten av neurovascular enheten, å opprettholde intakte responsene til trykksatte arterioler. Studier med isolerte PAs vil gi verdifull innsikt i cerebral parenkymatøs sirkulasjon, både fysiologiske og patologiske tilstander.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial Cerebrospinal Fluid | |||
| NaCl | Fisher Scientific | S-640 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217 | |
| MgCl Anhydrous | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G2870 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Isolation/Cannulation | |||
| Stereo Microscope | Olympus | SZX7 | |
| Super Fine Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Wiretrol 50 μl | VWR Scientific | 5-000-1050 | |
| 0.2 μm Sterile Syringe Filter | VWR Scientific | 28145-477 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm | Sutter Instruments | B120-69-10 | |
| Dark Green Nylon Thread | Living Systems Instrumentation | THR-G | |
| Linear Alignment Single Vessel Chamber | Living Systems Instrumentation | CH-1-LIN | |
| Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS-200 | |
| Video Dimension Analyzer | Living Systems Instrumentation | VDA-10 | |
| Four Channel Recorder with LabScribe 3 Recording and Analysis Software | Living Systems Instrumentation | DAQ-IWORX-404 | |
| Heating Unit | Warner Instruments | 64-0102 | |
| Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B | |
References
- Dunn, K. M., Nelson, M. T. Neurovascular signaling in the brain and the pathological consequences of hypertension. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 306, H1-H14 (2014).
- Iadecola, C. Neurovascular regulation in the normal brain and in Alzheimer's disease. Nat Rev Neurosci. 5, 347-360 (2004).
- Dabertrand, F., et al. Prostaglandin E2, a postulated astrocyte-derived neurovascular coupling agent, constricts rather than dilates parenchymal arterioles. J Cereb Blood Flow Metab. 33, 479-482 (2013).
- Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 365-370 (2007).
- Pires, P. W., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. Regulation of myogenic tone and structure of parenchymal arterioles by hypertension and the mineralocorticoid receptor. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 309, H127-H136 (2015).
- Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D. C., Hammack, S. E., Nelson, M. T. Stress-induced glucocorticoid signaling remodels neurovascular coupling through impairment of cerebrovascular inwardly rectifying K+ channel function. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 7462-7467 (2014).
- Dabertrand, F., et al. Potassium channelopathy-like defect underlies early-stage cerebrovascular dysfunction in a genetic model of small vessel disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, E796-E805 (2015).
- Shih, A. Y., et al. The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit. Nature neuroscience. 16, 55-63 (2013).
- Cipolla, M. J., et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity. Journal of applied physiology. 117, 53-59 (2014).
- Hamel, E. Perivascular nerves and the regulation of cerebrovascular tone. Journal of applied physiology. 100, 1059-1064 (2006).
- Brayden, J. E., Li, Y., Tavares, M. J. Purinergic receptors regulate myogenic tone in cerebral parenchymal arterioles. J Cereb Blood Flow Metab. 33, 293-299 (2013).
- Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Ryanodine receptors, calcium signaling, and regulation of vascular tone in the cerebral parenchymal microcirculation. Microcirculation. 20, 307-316 (2013).
- Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Acidosis dilates brain parenchymal arterioles by conversion of calcium waves to sparks to activate BK channels. Circ Res. 110, 285-294 (2012).
- You, J., Johnson, T. D., Marrelli, S. P., Bryan, R. M. Jr Functional heterogeneity of endothelial P2 purinoceptors in the cerebrovascular tree of the rat. Am J Physiol. 277, H893-H900 (1999).
- Nagase, K., Iida, H., Dohi, S. Effects of ketamine on isoflurane- and sevoflurane-induced cerebral vasodilation in rabbits. J Neurosurg Anesthesiol. 15, 98-103 (2003).
- Fisher, C. M. The arterial lesions underlying lacunes. Acta Neuropathol. 12, 1-15 (1968).
- Brown, W. R., Moody, D. M., Thore, C. R., Anstrom, J. A., Challa, V. R. Microvascular changes in the white mater in dementia. J Neurol Sci. 283, 28-31 (2009).
- Pires, P. W., Dams Ramos, C. M., Matin, N., Dorrance, A. M. The effects of hypertension on the cerebral circulation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304, H1598-H1614 (2013).
- Filosa, J. A., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Calcium dynamics in cortical astrocytes and arterioles during neurovascular coupling. Circ Res. 95, e73-e81 (2004).
- Dacey, R. G. Jr, Duling, B. R. A study of rat intracerebral arterioles: methods, morphology, and reactivity. Am J Physiol. 243, H598-H606 (1982).
- Coyne, E. F., Ngai, A. C., Meno, J. R., Winn, H. R. Methods for isolation and characterization of intracerebral arterioles in the C57/BL6 wild-type mouse. J Neurosci Methods. 120, 145-153 (2002).
- Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. SKCa and IKCa Channels, myogenic tone, and vasodilator responses in middle cerebral arteries and parenchymal arterioles: effect of ischemia and reperfusion. Stroke. 40, 1451-1457 (2009).
