Wir stellen die Techniken vor, die zur Isolierung der stromalen vaskulären Fraktion (SVF) aus inguinalen (subkutanen) und perigonadalen (viszeralen) Fettgewebsdepots der Maus erforderlich sind, um ihre Genexpression und kollagenolytische Aktivität zu beurteilen. Diese Methode umfasst die Anreicherung von Sca1-Stammzellen (ASCs) mithohem Fettgehalt durch immunomagnetische Zelltrennung.
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Methodenartikel
Immunomagnetische Trennung von Fett Depot-spezifische Sca1
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Isolierung von aus Fettgewebe gewonnenen Stammzellen (ASCs) ist eine wichtige Methode auf dem Gebiet der Fettgewebsbiologie, der Adipogenese und des Umbaus der extrazellulären Matrix (ECM). In vivo bietet eine EZM-reiche Umgebung, die aus fibrillären Kollagenen besteht, eine strukturelle Unterstützung für das Fettgewebe während des Fortschreitens und der Rückbildung von Fettleibigkeit. Der physiologische EZM-Umbau, der durch Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) vermittelt wird, spielt eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Größe und Funktion des Fettgewebes1,2. Der Verlust des physiologischen kollagennolytischen EZM-Umbaus kann zu einer übermäßigen Kollagenakkumulation (Gewebefibrose), einer Makrophageninfiltration und schließlich zu einem Verlust der metabolischen Homöostase einschließlich Insulinresistenz führen3,4. Wenn eine phänotypische Veränderung des Fettgewebes in gengesteuerten Mausmodellen beobachtet wird, ist die Isolierung primärer ASCs aus Fettdepots für in vitro-Studien ein wirksamer Ansatz, um die Rolle des spezifischen Gens bei der Regulation der Funktion von ASCs zu definieren. Im Folgenden definieren wir eine immunomagnetische Trennung von Sca1-hohen ASCs.
Einleitung
Stammzell - Antigen 1 (Sca1 oder Ly6A / E) wurde zuerst als ein Zelloberflächenmarker von hämatopoetischen Stammzellen und mesenchymalen 5,6 ausgedrückt identifiziert. Die stromalen vaskulären Fraktion (SVF) von Fettgewebe aus Maus - Fettdepots erhalten ist eine heterogene Population von Zellen von Fibroblasten umfasst, Makrophagen, vaskulären Endothelzellen, Nervenzellen und Adipozyten Progenitorzellen 7. Adipocyte Vorläuferzellen oder Fettgewebe gewonnene Stammzellen (ASCS) sind nicht-lipidbeladenen Zellen , die in das Kollagen-reiche perivaskulärem extrazellulären Matrix (ECM) 8 befinden. Etwa 50% des SVF von ASCS bestehen, die als....
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Protokoll
Ethik-Statement: Die University of Michigan Ausschuss für Benutzung und Pflege der Tiere (UCUCA) hat sich für die Pflege und Verwendung von Labortieren (Institut für Labortierforschung, National Research Council) alle Methoden und Protokolle gemäß dem Leitfaden genehmigt. Die Mäuse werden in einer von der Universität Michigan Vivarium gehalten und haben freien Zugang zu Nahrung und Wasser und hielt auf einem 12 Stunden Hell / Dunkel-Zyklus gegeben.
1. Vorbereitungen
- Bereiten Primärkulturmedien DMEM, 10% FBS, 1 x P / S / G und 1x Antibiotika / Antimykotika. Dies wird verwendet, um Gewebe zu halten, bevor die Verdauung. Legen Sie....
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Ergebnisse
Anreicherung von Sca1 hohe ASCS aus verschiedenen Fettpolster.
Die vaskuläre Stromazellen aus SQ Fett Anzeige Fibroblasten-ähnliche isoliert, gestreckt Zellform unabhängig von Sca1 Expressionsniveau (Abbildung 1A). Auf der anderen Seite, VIS (EWAT-derived) Sca1 hoch und Sca1 niedrigen Zellen zeigen deutliche Unterschiede in ihren Zellform. Wie SQ (iWAT abgeleitete) Sca1 ho.......
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Diskussion
Hier zeigen wir die Isolierung und immunomagnetischer Zellseparation von murinen ASCS aus verschiedenen Fettpolster und deren Verwendung für die in - vitro - Experimenten. Die vorgestellte Methode ist wirksam für die schnelle Isolierung von großen Anzahl von Sca1-positive ASCS, die über die technisch aufwendige und teure FACS-vermittelte Isolierung von ASCS 9,14 vorteilhaft ist. Anders als FACS, ist immunomagnetischen Zelltrennung erlauben nicht die Verwendung von mehreren Antigen zur Identi.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Diese Arbeit wird von NIH DK095137 (THC) unterstützt. Wir danken den aktuellen und ehemaligen Labor-Mitglieder, die an der Entwicklung und Verfeinerung der beschriebenen Verfahren beigetragen.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Typ 3 Kollagenase | Worthington Biochemisches | LS004182 | Gewebeverdauung |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | Kulturmedium mit hohem Glukosegehalt |
| Pen/Strepto/Glutamin (100x) | Gibco | 10378-016 | Medienantibiotikum |
| Anti-Anti (100x) | Gibco | 15240-062 | Medienantimykotikum |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| PBS (1x, pH 7,4) | Gibco | 10010-023 | |
| Trypsin (0,05%) | Gibco | 25300-054 | |
| Zellsieb | BD Bioscience | 352360 | 100-μ m cell Sieb |
| 60 mm Platten | BD Falcon | 353004 | |
| Schere | FST | 14001-12 | Große |
| Schere | FST | 14091-11 | Feine, gebogene Spitze |
| Große Pinzette | FST | 11000-12 | |
| Feine Pinzette | Beliebiger Hersteller | ||
| 25G 5/8" Nadeln | BD | 305122 | |
| 22G 1,5" Nadeln | BD | 305159 | |
| 15 ml konische Röhrchen | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml konische Röhrchen | BD Falcon | 352098 | |
| MACS Trennsäulen | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Anti-Sca1 Mikrokügelchen-Kit (FITC) | Miltenyi Biotec | 130-092-529 | FITC-anti-Sca1 1º Ab und Anti-FITC Mikrokügelchen 2º Ab |
| AutoMACS Laufpuffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Blaue Chux-Pads | Fisher | 276-12424 | |
| Saugeinlagen | Fisher | 19-165-621 | |
| Styroporplatte | Verwendung aus 50 ml Tuben | ||
| 70% Ethanol | |||
| Isofluran | Beliebiger Anbieter | ||
| Ratte IgG2a Alexa Fluor 647 | Invitrogen | R2a21 | |
| Ratte IgG2a Anti-Maus Sca1 Alexa Fluor 647 | Invitrogen | MSCA21 | |
| Ratte IgG2a R-PE | Invitrogen | R2a04 | |
| Ratte IgG2a Anti-Maus F4/80 R-PE | Invitrogen | MF48004 | |
| Rundbodenrohr | BD Falcon | 352058 | |
| HBSS (– Ca, – Mg) | Gibco | 14175-095 | |
| HBSS (+Ca, +Mg) | Gibco | 14025-092 | Für Kollagenase-Lösung |
| Typ I Kollagen (2,7 mg/ml in 37 mm Essigsäure | Im Haus zubereiten12 | ||
| 10x MEM | Gibco | 11430-030 | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 0,34 N NaOH | Haus | zubereiten | |
| Deckgläser | Corning | 2870-22 | |
| Alexa Fluor 594 Carbonsäure, Succinimidylester, gemischte Isomere | Invitrogen | A-20004 | |
| 0,89 M NaHCO3 | Gibco | 25080-094 |
Referenzen
- Chun, T. H., et al. A pericellular collagenase directs the 3-dimensional development of white adipose tissue. Cell. 125 (3), 577-591 (2006).
- Chun, T. H., et al. Genetic link between obesity and MMP14-dependent adipogenic collagen turnover.
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Nachdrucke und Genehmigungen
