本文描述了一种 离体 由小鼠淋巴结、骨、肺和脑组织来源的条件培养基组成的模型系统。该模型系统可用于鉴定和研究器官来源的可溶性因子及其对癌细胞器官趋向性和转移行为的影响.
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方法文章
器官条件培养基的制备及其在研究器官特异性对乳腺癌转移行为影响中的应用
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
乳腺癌在乳腺癌患者中倾向于转移至淋巴结、骨骼、肺、脑和肝脏。以往的研究主要集中在识别乳腺癌细胞自身固有的因素，这些因素被认为是导致这种特定转移模式（称为器官趋向性）的原因；然而，对于特定器官内部存在的、可能促进这一过程的因素，目前了解甚少。部分原因在于缺乏能够准确模拟器官微环境的体外（in vitro）模型系统。为解决这一问题，已建立一种离体（ex vivo）模型系统，可用于研究不同器官微环境中存在的可溶性因子。该模型通过采集正常无胸腺裸鼠分离出的器官（淋巴结、骨骼、肺和脑）所生成的条件培养基来实现。该模型系统已通过实验证实：不同的乳腺癌细胞系在响应不同器官来源的条件培养基时，表现出细胞系特异性和器官特异性的恶性行为，且该行为与其体内（in vivo）转移潜能相一致。该模型系统可用于鉴定和评估可能影响乳腺癌及其他类型癌细胞转移行为的特定器官来源的可溶性因子，包括对细胞增殖、迁移、类干细胞行为、基因表达等方面的影响，并有助于发现潜在的新型癌症治疗靶点。这是首个可用于深入研究器官特异性转移行为，并评估特定器官来源可溶性因子在驱动癌症转移过程中作用的离体（ex vivo）模型系统。
引言
乳腺癌是女性中最常被诊断出的癌症，也是癌症相关死亡的第二大原因1。乳腺癌的高死亡率主要归因于传统疗法无法有效控制和消除转移性疾病；约90%的癌症相关死亡由转移引起2。深入理解转移级联过程中潜在的分子机制，对于开发在乳腺癌早期和晚期均有效的治疗手段至关重要。
既往研究已帮助阐明了乳腺癌转移的多步骤特性，人们推测癌症进展和转移的结果在很大程度上依赖于癌细胞与宿主环境之间的相互作用3。临床观察表明，许多癌症表现出器官趋向性，i.e.，即倾向于优先转移到特定器官。以乳腺癌为例，患者的疾病通常会扩散或转移至5个主要部位，包括骨骼、肺、淋巴结、肝脏和脑4-6。为解释这一过程已提出多种理论，但仅有少数经受住了时间的考验。Ewing在20世纪20年代提出的转移理论假设转移分布完全由机械因素决定；即肿瘤细胞通过机体正常的生理性血流模式被携带至全身，并简单地在所遇到的第一个毛细血管床中滞留7。相比之下，Stephen Paget于1889年提出的"种子与土壤"假说则认为，转移灶的存活与生长还依赖于额外的分子相互作用，即癌细胞（"种子"）仅能在可产生适当分子因子的器官微环境（"土壤"）中定植并增殖8。近一个世纪后，Leonard Weiss对既往发表的尸检数据进行了荟萃分析，证实了Ewing的预测：在尸....
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方案
所有动物实验均按照加拿大动物护理委员会的建议进行，并经西安大略大学动物使用小组委员会批准的方案许可。
1. 器官分离（肺、脑、骨、淋巴结）
- 准备四个无菌的50 ml锥形管（每个待分离器官各用一个），每管中加入约30 ml无菌磷酸盐缓冲液（PBS）。使用电子天平预先称量每管PBS的重量。
- 通过 CO₂ 处死 6–12 周龄小鼠2 吸入。小鼠应留在CO中2 约1-2分钟 或直至小鼠停止活动和呼吸。可通过手指手动检查是否无心跳来进一步确认安乐死是否成功。应避免采用颈椎脱位法，因为该方法可能导致颈部血管破裂，从而增加腋下淋巴结的摘除难度。
注意：先前的研究专门使用了健康的雌性裸鼠，Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu13. - 在无菌组织培养罩内，将小鼠仰卧置于聚苯乙烯泡沫垫上，展开四肢并用图钉固定。
- 使用无菌镊子和剪刀，在生殖器处沿腹中线剪开腹部皮肤，并向上剪至口部。轻轻将腹部皮肤从腹肌上剥离，并用大头针固定在聚苯乙烯泡沫板上。
- 定位腋窝、肱部和腹股沟淋巴结。
注意：淋巴结通常被脂肪组织包围。腹股沟淋巴结位于腹部皮肤回缩后两支血管交汇处的浅表位置，最容易定位。腋窝和臂部淋巴结则位于组织较深处，需要轻柔地移动组织进....
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结果
器官条件培养基的制备
器官分离及制备条件培养基的流程示意图见图1，该操作的代表性照片见图2。需要注意的是，在本方案最初开发阶段，肝脏曾被纳入分析，因为肝脏是乳腺癌转移的常见部位。然而，由于肝脏会产生并分泌大量蛋白酶，很难使其在体外维持足够长的活性以制备高质量的条件培养基。此外，肝脏条件培养基在分离后也不稳定，往往会出现大量蛋白质沉淀，原因可能相同。因此，后续分析中未再包含肝脏。
为特异性制备淋巴结和骨组织条件培养基，可通过显微镜观察分离的基质细胞（LNSCs 和 BMSCs）的细胞形态，并结合标准流式细胞术进行免疫表型分析，以确认其表型。基质细胞在培养中应具有贴壁生长特性，其中 LNSCs 呈细长的成纤维细胞样形态（.......
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讨论
转移是一个复杂的过程，一系列细胞事件最终导致组织侵袭和远处肿瘤的形成4,30,31。本文介绍的ex vivo模型系统可用于研究转移进展中的两个重要方面：癌细胞向特定器官的归巢或迁移（"到达该部位"）以及在该器官中的生长（"在该部位增殖"）。以往许多研究主要集中在识别与癌细胞自身相关的关键分子特征，这些特征有助于转移过程。例如，Joan Massagué 研究组的工作已鉴定出与肺特异性、骨特异性和脑特异性扩散模式相关的不同基因表达谱10-12,32。尽管这些研究为癌细胞在该过程中的作用提供了重要的见解，但关于继发性微环境所提供的器官特异性因子的作用，目前了解仍较少，且这一领域相对难以研究13。
这 离体 模型系统先前已通过证明乳腺癌细胞系在器官条件培养基（organ-CM）中的特异性迁移和生长行为与其细胞系在继发器官微环境中的表现一致，从而被验证为继发器官微环境的准确表征。 体内 转移扩散模式。Chu 及其同事的一项研究使用了四种具有.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本研究得到了加拿大乳腺癌基金会安大略地区分部、加拿大创新基金会（编号：13199）以及伦敦健康科学基金会通过约翰和唐娜·布里斯托尔捐赠的资金支持（资助对象：A.L.A.）。研究生奖学金和博士后资助由安大略省研究生奖学金项目（安大略省政府，资助对象：G.M.P. 和 J.E.C.）、加拿大研究生奖学金-硕士项目（资助对象：M.M.P.）、加拿大卫生研究院（CIHR）战略培训项目（资助对象：M.M.P.、G.M.P. 和 J.E.C.）以及伦敦地区癌症项目帕梅拉·格林韦-科尔梅尔转化乳腺癌研究组（资助对象：M.M.P.、G.M.P.、J.E.C. 和 Y.X.）提供。A.L.A. 获得加拿大卫生研究院新研究者奖以及安大略省研究与创新部早期研究者奖的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 50 ml 锥形管 | Thermo Scientific (Nunc) | 339652 | 保持无菌 |
| 1× 磷酸盐缓冲液（PBS） | ThermoFisher Scientific | 10010-023 | 保持无菌 |
| 裸鼠 | Harlan Laboratories | Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu | 使用 6 至 12 周龄小鼠 |
| 聚苯乙烯泡沫垫 | N/A | N/A | 可使用废弃的聚苯乙烯泡沫运输箱盖板（约 4 × 8 英寸或更大）代替。用乙醇擦拭进行消毒。 |
| 镊子 | Fine Science Tools | 11050-10 | 保持无菌 |
| 剪刀 | Fine Science Tools | 14058-11 | 保持无菌 |
| 纱布垫 | Fisher Scientific | 22-246069 | 保持无菌 |
| 60 mm2 玻璃培养皿 | Sigma-Aldrich | CLS7016560 | 保持无菌 |
| 手术刀片 | Fisher Scientific | S95937A | 保持无菌 |
| DMEM:F12 | Life Technologies | 21331-020 | 使用前在 37 °C 水浴中预热，保持无菌 |
| 1× Mito + Serum Extender | BD Biosciences | 355006 | 在文稿中称为 "浓缩有丝分裂原补充剂"，保持无菌 |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/ml） | Life Technologies | 15140-122 | 保持无菌 |
| Rosewell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) | Life Technologies | 11875-093 | 使用前在 37 °C 水浴中预热，保持无菌 |
| 胎牛血清 | Sigma-Aldrich | F1051-500ML | 保持无菌 |
| 胰蛋白酶/EDTA 溶液 | ThermoFisher Scientific | R-001-100 | 使用前在 37 °C 水浴中预热，保持无菌 |
| 6 孔组织培养板 | Thermo Scientific (Nunc) | 140675 | 保持无菌 |
| 0.22 μm 注射器滤器 | Sigma-Aldrich | Z359904 | 保持无菌 |
| T75 组织培养瓶 | Thermo Scientific (Nunc) | 178905 | 保持无菌 |
| Transwell 小室 | Sigma-Aldrich | CLS3464 | 保持无菌，用于迁移实验 |
| 抗小鼠 Sca-1 抗体 | R&D Systems | FAB1226P | 使用浓度为 10 µl/106 个细胞 |
| 抗小鼠 CD105 抗体 | R&D Systems | FAB1320P | 使用浓度为 10 µl/106 个细胞 |
| 抗小鼠 CD29 抗体 | R&D Systems | FAB2405P-025 | 使用浓度为 10 µl/106 个细胞 |
| 抗小鼠 CD73 抗体 | R&D Systems | FAB4488P | 使用浓度为 10 µl/106 个细胞 |
| 抗小鼠 CD44 抗体 | R&D Systems | MAB6127-SP | 使用浓度为 0.25 µg/106 个细胞 |
| 抗小鼠 CD45 抗体 | eBioscience | 11-0451-81 | 使用浓度为 5 µl/106 个细胞 |
| 抗小鼠 gp38 抗体 | eBioscience | 12-5381-80 | 使用浓度为 10 µl/106 个细胞 |
| β-巯基乙醇 | Sigma-Aldrich | M6250 | 保持无菌 |
| 蛋白芯片 | RayBiotech Inc. | AAM-BLM-1-2 | 每种培养基条件（包括阴性对照）使用 1 个芯片，设三个重复 |
参考文献
- Canadian Cancer Statistics. Canadian Cancer Society. , Toronto, ON. Available from: www.cancer.ca (2014).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2015. CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
- Fidler, I. J. The organ microenvironment and cancer metastasis. Differentiation. 70
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