Summary
Questo protocollo descrive l'uso della microscopia multiphoton effettuare prolungato time-lapse imaging di interazioni multicellulari in tempo reale, in vivo a risoluzione singola cellula.
Introduction
Diffusione di cellule tumorali dal tumore mammario primario ha dimostrato di coinvolgere non solo le cellule tumorali, ma ospitare cellule stromali compresi macrofagi e cellule endoteliali. Inoltre, il tumore vascolare è anormale con aumento della permeabilità 1. Così, determinare come le cellule tumorali, macrofagi e cellule endoteliali interagiscono per mediare la permeabilità vascolare e intravasation delle cellule tumorali nel microambiente tumorale primaria è importante per la comprensione delle metastasi. Comprendere la cinetica della permeabilità vascolare, intravasation delle cellule tumorali e il meccanismo di segnalazione alla base delle interazioni multicellulari nel microambiente tumorale in grado di fornire informazioni cruciali per lo sviluppo e la gestione delle terapie anti-cancro.
I mezzi primari di studiare tumore permeabilità vascolare in vivo è stata la misura di coloranti extravascolare come Evans blue 2, destrani ad alto peso molecolare (155 kDa)3 e fluoroforo o proteine radiotracciante coniugato (tra cui l'albumina) 4 in punti fissi di tempo dopo l'iniezione del colorante. I progressi nella microscopia, modelli animali e coloranti fluorescenti hanno permesso la visualizzazione dei processi cellulari e permeabilità vascolare di animali vivi attraverso la microscopia intravitale 5.
Immagini di animali vivi con l'acquisizione di immagini statiche, o sequenze di breve time-lapse in diversi punti di tempo non permette la completa comprensione di eventi dinamici nel microambiente tumorale 6,7. Infatti, l'acquisizione di immagini statiche nel corso di 24 ore ha dimostrato che tumore vascolarizzazione è a tenuta, tuttavia la dinamica della permeabilità vascolare non è stata osservata 6. Così, lungo l'imaging continuo time-lapse fino a 12 ore cattura la cinetica di eventi dinamici nel microambiente tumorale.
Questo protocollo descrive l'uso di prolungato multiphot time-lapsesulla microscopia intravitale per studiare eventi multicellulari dinamici nel microambiente tumorale. Più tipi di cellule del microambiente tumorale sono etichettati con coloranti iniettabili o utilizzando animali transgenici che esprimono proteine fluorescenti. Utilizzando un catetere venoso coda coloranti vascolari o proteine possono essere iniettati dopo l'inizio di imaging per acquisire dati cinetici di eventi multicellulari nel microambiente tumorale. Per l'imaging cellulare dal vivo il tumore mammario è esposta attraverso la preparazione chirurgica di un lembo cutaneo. Le immagini vengono acquisite fino a 12 ore utilizzando un microscopio multiphoton dotato di molteplici tubi fotomoltiplicatori (PMT) rilevatori 8. Utilizzando opportuni filtri, un algoritmo di sottrazione consente 4 rivelatori PMT per acquisire 5 segnali fluorescenti nel microambiente tumorale contemporaneamente 9. Ad alta risoluzione multiphoton intravitale microscopia cattura di imaging singola risoluzione delle cellule di interazioni tumore-stroma nel microambiente tumorale, portando ad una migliore understanding della permeabilità vascolare e del tumore delle cellule intravasation 10-13. In particolare, rivelato altamente localizzati, transitori eventi permeabilità prolungati di imaging intravitale vascolari che si verificano selettivamente nei siti di interazione tra una cellula tumorale, un macrofago e una cellula endoteliale (definito come il microambiente tumorale delle metastasi, TMEM 14) 13. Inoltre, intravasation cellule tumorali si verifica solo in TMEM ed è spazialmente e temporalmente correlata con la permeabilità vascolare 13. risoluzione singola cella della dinamica di questi eventi è stato reso possibile attraverso l'utilizzo di prolungato time-lapse multifotonica microscopio di cellule fluorescente nel microambiente tumorale.
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Protocol
Tutte le procedure descritte devono essere eseguite in conformità con le linee guida e regolamenti per l'uso di animali vertebrati, tra cui la preventiva approvazione da parte del Albert Einstein College of Medicine Istituzionale cura degli animali e del Comitato uso.
1. Generazione di fluorescenza Tumori etichettati e macrofagi associati al tumore
- Generare cellule tumorali fluorescente attraversando il, autoctona, topo geneticamente modificato modello cancro mammario spontaneo in cui la ripetizione lungo terminale virus tumore del mouse mammaria spinge l'antigene polioma mezzo T (MMTV-PyMT) con i topi transgenici con i giornalisti fluorescenti [cioè, una maggiore verde fluorescente proteine (EGFP), una maggiore proteina ciano fluorescente (ECFP) o Dendra2] 8,9.
- Macrofagi etichetta fluorescente negli animali PyMT con fluorescente cellule tumorali attraversando modelli di topo geneticamente con i giornalisti fluorescenti specifiche myeloid- e macrofagi [cioè, MacGreen 15 o topi MacBlue CSF1R -GAL4VP16 / UAS-ECFP 16].
- In alternativa, generano fluorescente tumori attraverso il trapianto ortotopico di cellule fluorescente PyMT tumorali (singenici), linee di cellule umane di cancro al seno o tumori primari paziente umano derivati (xenotrapianti) 11,17.
- Implant fluorescente cellule tumorali PyMT in topi singenici con le cellule mieloidi fluorescenti proteina marcato per generare animali con cellule tumorali fluorescenza etichettati e cellule mieloidi 13.
- Iniettare 100 ml di 10 mg / kg fluorescente 70 kDa destrano per via endovenosa (iv) la coda vena in grave topi immunodeficienza combinata (SCID) con tumori xenotrapianto di linee cellulari umane o tumori primari del paziente di derivazione a macrofagi etichette fluorescenza 2 ore prima della partenza dell'imaging intravitale.
2. Installazione Microscopio e Imaging Preparazione
Nota: Questa procedura descrive il set-upper l'imaging intravitale su un microscopio multiphoton 8.
- Accendere tutti i componenti del microscopio e laser, tra cui laser a due fotoni e rivelatori.
- Selezionare la casella di riscaldamento a 30 ° C per pre-riscaldare il palco. Questo passaggio è fondamentale per il mantenimento della temperatura fisiologica dell'animale.
- Per l'uso su un posto microscopio invertito la fase di inserimento su misura sul palco microscopio. L'inserto personalizzato è un foglio di 1/8 "in alluminio di spessore lavorato per adattarsi allo spazio inserto palco e con un 1" di diametro foro passante nel centro per l'imaging.
- Pulire la fase di microscopio e l'inserto palco con il 70% di etanolo e aria secca.
- Mettere un grande goccia d'acqua sulla NA obiettivo 20X, 1,05 microscopio per mantenere il contatto ottico con il vetro di copertura.
- Bicchiere coperchio (# 1.5 spessore) sulla porta di imaging sull'inserto palco microscopio. Fissare in posizione con nastro adesivo di laboratorio.
- Utilizzare un pugno buco per fare un buco due centimetri x 2 cmin un pad in gomma flessibile e posizionare il gommino sul palco microscopio con il foro del pad allineato con il foro dell'inserto fase personalizzato.
3. Preparazione della vena della coda catetere e reagenti per iniezione durante Imaging
- Tagliare una lunghezza di 30 cm in polietilene (PE) tubo.
- Utilizzando pinze, spostare l'ago metallico di un ago G 31 avanti e indietro finché non si rompe fuori del raccordo di plastica.
- Utilizzando pinze, inserire l'estremità smussata dell'ago distaccata nel tubo PE.
- Inserire un ago G 31 nell'altra estremità del tubo PE.
- Riempire una siringa da 1 cc con fosfato sterile salina tamponata (PBS) e inserirlo nel ago G 31 e lavare tutta l'aria dal tubo e ago con PBS. PBS è usato per mantenere l'idratazione e osmolarità del sangue 9,18, soluzione salina isotonica tuttavia possono anche essere utilizzati.
- Riempire una siringa da 1 cc con 200 ml di 3 mg / kg 155 kDa destrano-tetramethylrhodamine (TMR) O punti quantici per l'etichettatura vascolare.
- Preparare eventuali altre proteine iniettabili come ad esempio un acido amino 165 isoforma del fattore di crescita vascolare endoteliale A (VEGFA 165) in una siringa da 1 cc e posto sul ghiaccio. Iniettare 0,2 mg / kg VEGFA 165 19 alla concentrazione di 0,05 mg / ml.
4. Inserimento della coda Indwelling Vena catetere
- Posto l'animale in anestesia utilizzando una camera di induzione con 5% isoflurano con O 2 come gas di trasporto.
- Trasferire il mouse per la piattaforma chirurgica una volta che è completamente anestetizzato e non risponde ad un pizzico dito del piede.
- Linea aperta isoflurano alla piattaforma chirurgica, chiudere la linea anestesia alla camera di induzione e posizionare il cono sopra muso dell'animale. Ridurre il isoflurano dal 5% al 2,5%.
- Applicare una pomata oftalmica agli occhi del mouse per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
- Scaldare l'animale sotto la lampada di riscaldamentoper altri 2 minuti per aumentare la circolazione nella coda come circolazione rallenta con anestesia profonda.
- Sterilizzare la vena della coda del mouse con il 70% di etanolo.
- Inserire la punta di un ago G 31 dal catetere costruito nella Sezione 3 nella vena caudale laterale dell'animale e spingere l'ago 2-3 mm.
- Tirare indietro sulla siringa per vedere il sangue, garantendo il catetere viene inserito nella vena della coda.
- Utilizzare una lunghezza 1 cm di nastro lab posto sopra l'ago per mantenere l'ago in posizione parallelamente alla vena lungo la lunghezza della coda.
5. Pelle Flap procedura chirurgica per esporre il tumore mammario
- Con l'animale sulla piattaforma chirurgica tamponare il tumore e la superficie ventrale con il 70% di etanolo. Nota: Come descritto, questa procedura non viene eseguita completamente asettico. Per le sessioni lunghe di imaging in cui l'infezione può diventare un fattore di confusione, si consiglia di utilizzare una corretta tecnica asettica.
- utilizzando steriLe pinze, sollevare la pelle ventrale e con le forbici sterili fanno un'incisione sottocutaneo lungo la linea mediana ventrale di circa 1 cm di lunghezza. Evitare la puntura del peritoneo durante l'incisione.
- Delicatamente tagliare il tessuto connettivo fissare la ghiandola mammaria e tumori lontano dal peritoneo per esporre il tumore mammario.
- Usando forbici e pinze, rimuovere delicatamente e tagliare via la fascia e grasso dalla superficie esposta del tumore mantenendo l'integrità del sistema vascolare del tumore e minimizzando sanguinamento. Questo passaggio è fondamentale nel mantenere l'architettura tumore e vascolarizzazione fornitura del tumore.
6. Preparazione degli animali per la microscopia
- Trasferire l'animale alla fase di imaging pre-riscaldato con il tumore esposta collocato sul vetrino sull'inserto palcoscenico sul obiettivo microscopio per l'imaging. Fare attenzione a trasferire il catetere vena della coda delicatamente con l'animale in modo da non staccare l'ago.
- ° postoe anestesia naso cono sopra il muso dell'animale per mantenere insieme l'anestesia al 3% isoflurano.
- Posizionare l'animale in modo che il tumore poggia nel foro del gommino ed entra in contatto con il vetro coprioggetto.
- Utilizzare due tamponi in gomma per tenere delicatamente il tumore al suo posto e fissarli al palco microscopio con del nastro laboratorio per ridurre il movimento durante l'acquisizione dell'immagine.
- Riempire la camera dal pad di gomma con PBS per mantenere il tessuto idratato e mantenere il contatto ottico con il vetrino.
- Inizia il monitoraggio dei segni vitali dell'animale con una sonda pulsossimetro. Collegare un sensore clip alla coscia dell'animale. In alternativa un collare che è configurato per adattarsi intorno al collo può essere utilizzato.
- Posizionare la scatola del riscaldamento sopra l'animale per mantenere 30 ° C 20.
- Lentamente ridurre il livello di isoflurano al 0,5-1% per mantenere l'anestesia e mantenere il flusso sanguigno.
7. Acquisizione di immagini e l'iniezione di flent Coloranti e iniettabili Proteine
- Utilizzando il fuoco del microscopio oculare sulle cellule tumorali fluorescenti sulla superficie del tumore.
- Selezionare un'area di interesse trovando zone con che scorre i vasi sanguigni. La selezione di una zona di interesse con scorre vasi sanguigni è critico per valutare vasi tumorali.
- Una volta che è stata selezionata una regione di interesse passare al microscopio in modalità di imaging multiphoton.
- Impostare i limiti superiore e inferiore di una serie z. Impostare il limite superiore della serie Z utilizzando il regolatore di messa a fuoco per spostare l'obiettivo nella posizione di partenza desiderato e facendo clic sul pulsante di posizione Z "Top". Determinare il limite superiore della serie Z visualizzando la rete in fibra di collagene sulla superficie del tumore nel canale generazione di seconda armonica (SHG) e osservando quando nessuna cellula ma solo fibre di collagene sono visibili.
- Impostare il limite inferiore della serie Z spostando l'obiettivo alla profondità di imaging desiderata (typically 50 - 150 micron) e il tasto "basso" cliccando la posizione Z.
- Impostare la dimensione del passo digitando il valore desiderato nel campo dimensione del passo. Determinare dimensione del passo sulla base di considerazioni di risoluzione e tempo di acquisizione (in genere 2 micron viene utilizzato per la ricostruzione 3D ad alta risoluzione e 5 micron altro).
- Impostare l'intervallo di time-lapse passando al pannello Time-Lapse e inserendo il lasso di tempo desiderato nel campo Time-Lapse. Per risoluzione temporale ottimale impostare l'intervallo di tempo a 0 sec per l'imaging continuo. Nota: Per lungo time-lapse imaging si consiglia di impostare l'intervallo di tempo di 10 secondi tra le acquisizioni per ricostituire il liquido di immersione obiettivo.
- Una volta che i parametri per l'imaging sono stati determinati, iniettare lentamente 155 kDa destrano-TMR.
- Rimuovere la siringa con PBS nel catetere coda vena e sostituirlo con la siringa contenente 155 kDa destrano-TMR facendo attenzione a non introdurre bolle nel Line.
- Iniettare lentamente 155 kDa destrano-TMR nel mouse, con un volume massimo di 200 ml, e sostituire la siringa con siringa contenente PBS. PUNTO CRITICO: eseguire l'iniezione lentamente e prendere precauzioni per evitare di ottenere una soluzione al di fuori della vena.
- Avviare l'acquisizione del time-lapse imaging Z-stack facendo clic sui pulsanti Time-lapse Z-Stack e per deprimere loro e poi cliccando sul pulsante di registrazione.
- Se altri destrani fluorescenti, vale a dire, isotiocianato 10 kDa destrano-fluoresceina (FITC), o le proteine, cioè, VEGFA 165, sono stati preparati in anticipo, li iniettare dopo l'inizio di acquisizione di immagini per a = 0 min inizio.
- Rimuovere la siringa con PBS nella vena della coda del catetere e sostituirlo con la siringa contenente 10 kDa destrano-FITC o VEGFA 165 facendo attenzione a non introdurre bolle nella linea.
- Iniettare lentamente iniettabili nel mouse attraverso il catetere vena della codae sostituire la siringa con una siringa contenente PBS.
- Ogni 30-45 min, iniettare lentamente 50 ml di PBS o soluzione salina per mantenere l'idratazione dell'animale.
8. L'eutanasia
- Al termine della acquisizione delle immagini, eutanasia dell'animale.
- Aumentare la isoflurano al 5%.
- Mantenere l'animale sotto il 5% isoflurano fino al 30 sec dopo che cessa di respirare e rimuovere l'animale dal palco.
- Eseguire dislocazione cervicale per garantire la completa eutanasia.
Processing 9. Immagine
- Acquisire le immagini in file TIFF a 16 bit per ogni singolo canale ad ogni tempo e salvare in modo sequenziale.
- Eseguire la separazione di sovrapposizione spettrale (cioè, GFP e PCP), l'eliminazione di deriva xy e la generazione di film da sequenze time-lapse con metodi stabiliti in ImageJ 9. Eseguire ricostruzioni di superficie 3D di immagini ad alta risoluzione 13.
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Representative Results
Esteso microscopia time-lapse intravitale permette l'imaging singola cella risoluzione dei processi multicellulari nel microambiente tumorale. Da parte delle cellule tumorali fluorescenza etichettatura, i macrofagi, lo spazio vascolare, e visualizzare la rete di fibre di collagene con il secondo segnale di generazione di armoniche, comparti multipli nel microambiente tumorale sono contemporaneamente monitorati durante l'imaging. Le cellule tumorali marcate con proteine fluorescenti possono essere generati in topi transgenici come è stato fatto nei topi MMTV-PyMT-Dendra2, con le cellule tumorali mammarie etichettati con Dendra2 (Figura 1A). Incrociando questi topi transgenici con i topi CSF1R -GAL4VP16 / UAS-ECFP, che hanno i macrofagi etichettati con ECFP, sia le cellule tumorali e macrofagi sono etichettati nei topi MMTV-PyMT. Con la strategia duale etichettatura delle cellule tumorali e macrofagi, l'interazione diretta dei due tipi di cellule può essere visualizzata in tempo reale (Figura 1A). Inoltre, umani linee di cellule di cancro al seno o cellule tumorali derivati da pazienti trasdotte con GFP possono essere usati per marcare le cellule tumorali. I macrofagi possono essere etichettati con fluorescente 70 kDa destrano che si accumula nei macrofagi fagocitiche (Figura 1B). Questi metodi hanno promosso lo studio di eventi multicellulari dinamiche come tumore a cellule-macrofagi motilità streaming, la permeabilità vascolare e intravasation delle cellule tumorali. Per visualizzare cambiamenti nella permeabilità vascolare tumorale, un elevato peso molecolare destrano fluorescente (155 kDa o superiore è raccomandato 9,13,21,22) o punti quantici sono utilizzati per etichettare spazio vascolare (Figura 1). 155 kDa destrano o quantum dots sono abbastanza grandi che non facilmente si diffondono attraverso gli spazi interendothelial 23.
Imaging continuo ad alta risoluzione facilita la cattura di eventi permeabilità vascolare e laquantificazione della cinetica di stravaso destrano e liquidazione a TMEM (Figura 2 e Movie 1). Poiché lo spazio vascolare viene facilmente definito dal 155 kDa destrano all'iniziazione della sequenza time-lapse (come in 0 'della figura 2) destrano fluorescente extravascolare può essere quantificato in ogni frame della sequenza temporizzata. Figura 2 e Movie 1 dimostrare la stravaso di 155 kDa destrano-TMR iniettato attraverso un catetere vena della coda in un MMTV-PyMT-Dendra2; Topo CSF1R-PCP. cellule Dendra2 marcato tumorali (verde) e macrofagi CFP-etichettati (Ciano) sono utilizzati per identificare TMEM di animali vivi. La struttura TMEM nel sito di permeabilità vascolare è descritto in una scatola bianca. Lo spazio vascolare è etichettato con 155 kDa destrano-TMR (rosso) di visualizzare scorre vascolarizzazione e stravaso dei contenuti vascolari durante gli eventi della permeabilità vascolare. Il picco di 155 kDa destrano-TMR stravasoin figura 2 è visibile tra 29 'e 34'. destrano extravascolare è visto alla freccia bianca nei pannelli superiore ed alla freccia rossa nei pannelli inferiori, mostrando solo il canale di 155 kDa destrano-TMR. Il 155 kDa destrano-TMR cancella dal tessuto ed è visto come una diminuzione del segnale extravascolare TMR come si vede al 97 'nella figura 2. Dopo la compilazione della sequenza time-lapse in ImageJ destrano extravascolare è quantificato.
Oltre ad osservare eventi spontanei nel microambiente tumorale, è importante studiare il meccanismo molecolare sottostante dei fenomeni individuati. L'iniezione di coloranti vascolari aggiuntivi o proteine per indurre la permeabilità vascolare in grado di fornire una conoscenza degli eventi di segnalazione che regolano la permeabilità vascolare. Figura 3 mostra la differenza di stravaso di 10 kDa destrano-FITC (verde) e 155 kDa destrano-TMR (rosso).Alto peso molecolare 155 kDa destrano-TMR viene somministrato immediatamente prima dell'inizio del time-lapse imaging. Cinque Z-stack vengono acquisiti nella sequenza time-lapse per impostare una linea di base prima di 10 kDa destrano-FITC viene iniettato. Dopo l'acquisizione del 5 ° Z-pila 10 kDa destrano-FITC viene somministrato attraverso la vena della coda del catetere senza interrompere l'acquisizione delle immagini. Il destrano-FITC si vede entrando nel sistema vascolare con stravaso immediato mentre il 155 kDa destrano-TMR rimane confinata allo spazio vascolare (Figura 3, 0 'e 6'). Il 10 kDa destrano-FITC extravasates completamente dal vaso sanguigno e libera dai tessuti lasciando il 155 kDa destrano-TMR nel vaso sanguigno (Figura 3 come visto al 56 'e film 2). Utilizzando un punto di tempo dalla prima dell'iniezione, la cinetica di 10 kDa destrano-FITC stravaso possono essere facilmente confrontati a 155 kDa destrano-TMR 13. Il stravaso immediata di 10 kDa dextran-FITC dopo l'iniezione è significativamente diverso dal mantenimento di 155 kDa destrano-TMR nel sistema vascolare e gli eventi permeabilità vascolare spontanei 13. Ulteriori controlli sperimentali possono essere eseguite compreso indurre la permeabilità vascolare attraverso la rottura meccanica del endotelio o tramite VEGFA 165 permeabilità mediata 13. La cinetica di stravaso di 155 kDa destrano-TMR di eventi spontanei di permeabilità possono essere paragonati a 10 kDa destrano, e altri mezzi di indurre permeabilità vascolare per comprendere gli eventi e segnali coinvolti in eventi permeabilità vascolare nel microambiente tumorale.
Figura 1. Strategie per etichettare le cellule e la vascolarizzazione del microambiente tumorale. (A) topo transgenico MMTV-PyMT con le cellule tumorali marcate con Dendra2 (MMTV-icre / CAGCAT-Dendra2 / MMTV-PyMT) e macrofagi etichettati con CFP (CSF1R -GAL4VP16 / UAS-ECFP). Tumore vascolare è etichettato con 155 kDa destrano-TMR amministrato da vena della coda del catetere. (B) i tumori xenotrapianto paziente di derivazione TN1-GFP con i macrofagi etichettati con 70 kDa destrano-Texas Red e vascolarizzazione etichettati con punti quantici con il catetere vena della coda. Barra della scala, 50 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Visualizzare la permeabilità vascolare transitoria. (A) microscopia intravitale (IVM) time-lapse di 155 kDa destrano-TMR (rosso) stravaso e tumore intravasation cellulare a TMEM (scatola bianca). Le cellule tumorali marcate con Dendra2 (verde, TC), macrofagi con ECFP (ciano, M) e blood navi con 155 kDa destrano-TMR (rosso, BV). siti permeabilità dei vasi sanguigni (freccia bianca). (B) Isolato canale 155 kDa destrano-TMR. Le frecce rosse indicano stravaso destrano (bianco). barra della scala, 50 micron. Film di time-lapse microscopia in Movie 1. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. visualizzazione multiple destrani fluorescente. IVM time-lapse di differenza di stravaso di 155 kDa destrano-TMR (rosso) e 10 kDa destrano-FITC (verde). I macrofagi sono etichettati con ECFP (ciano) e collagene in blu (SHG). La sovrapposizione di colore rosso 155 kDa destrano-TMR e verde 10 kDa destrano-FITC nel sistema vascolare è giallo. stravaso rapida di verde 10 kDa destrano-FITC picco è a 6 min. Scale bar, 50 micron. Film di time-lapse microscopia in Movie 2. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Film 1. Visualizzare la permeabilità vascolare transitoria spontanea con time-lapse IVM. Time-lapse microscopia (come si vede nella figura 2) del transitorio permeabilità dei vasi sanguigni visualizzati in un topo transgenico MMTV-PyMT con le cellule tumorali marcate con Dendra2 (MMTV-ICRE / CAGCAT -Dendra2 / MMTV-PyMT) e macrofagi etichettati con CFP (CSF1R -GAL4VP16 / UAS-ECFP). Stravaso di 155 kDa destrano-TMR stravaso (rosso nel pannello di sinistra, pannello bianco a destra) si osserva al punto di diramazione dei vasi sanguigni del tumore. Pleasing clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro del mouse per scaricare).
Movie 2. Visualizzare stravaso di più destrani fluorescente da time-lapse IVM. Time-lapse microscopia (come si vede nella figura 3) di stravaso di 155 kDa destrano-TMR (rosso) e 10 kDa destrano-FITC (verde) in una transgenico topo MMTV-PyMT con macrofagi etichettati con CFP (CSF1R -GAL4VP16 / UAS-ECFP). SHG di collagene è etichettato in blu. Rosso 155 kDa destrano-TMR rimane nel sistema vascolare del tumore per la durata del time-lapse, mentre il verde 10 kDa destrano-FITC extravasates rapidamente e cancella dai vasi sanguigni e il tessuto. Clicca qui per visualizzare questo video. (Tasto destro del mouse per scaricare).
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Discussion
interazioni cellulari che si verificano spontaneamente nel microambiente tumorale possono portare a cambiamenti nella motilità delle cellule tumorali e intravasation. High-Resolution Imaging intravitale del tessuto tumorale dal vivo permette la visualizzazione delle dinamiche pluricellulari che possono essere 10,13,24 altamente transitorio. End-point in vivo o immagini time-lapse acquisiti con i punti di tempo discreto grado di fornire informazioni essenziali sui meccanismi molecolari dei processi nel microambiente tumorale. Studi di imaging intravitale sono stati utilizzati per studiare i processi nel microambiente tumorale che si verificano nell'arco di diversi giorni, generando nuove intuizioni su angiogenesi, la migrazione delle cellule tumorali e la risposta al trattamento farmacologico 25-30. Tuttavia, questi test potrebbero non catturare la cinetica di eventi transitori nel microambiente tumorale a causa della scala dei tempi dei processi in fase di studio 7,31. Distinguere più eventi transitori dai processi costanti è un annuncio significativodi vista della microscopia intravitale.
La tecnica di imaging intravitale descritta in questo protocollo permette la visualizzazione diretta delle dinamiche cellulari nel microambiente tumorale, mediante l'etichettatura di fluorescenza di molteplici linee e strutture cellulari. Multiphoton microscopia permette una maggiore profondità delle immagini su singoli fotoni microscopia confocale con profondità di 300 micron eseguita di routine 24. Acquisizione di Z-pile di 50 - 100 micron a 2 micron passi è di risoluzione abbastanza alta per generare ricostruzione 3D di interazioni cellulari, le parti sporgenti che le cellule fare come si estendono verso l'altro 13 e vascolari strutture nel microambiente tumorale. Film e ricostruzioni 3D di time-lapse sequenze di immagini consentono la quantificazione della motilità cellulare (velocità e direzionalità) e, sulla base delle variazioni di intensità del segnale fluorescente di coloranti iniettabili, permeabilità vascolare.
Al fine di catturare speventi cellulari ontaneous numero delle singole immagini catturate in una singola sequenza devono essere ottimizzati per consentire una velocità di acquisizione delle immagini che cattura la cinetica della manifestazione, ma copre anche uno spazio fisico sufficiente ad aumentare la probabilità di catturare qualsiasi singolo evento durante una singola sequenza time-lapse. I parametri di imaging spaziali che devono essere considerati includono; il numero di fette in un Z-stack, il numero di campi di vista con Z-stack acquisite e la distanza assiale fra le singole sezioni in Z-stack. Pertanto, l'impostazione di questi parametri prima di avviare l'acquisizione delle immagini è un passo fondamentale nel protocollo. Utilizzando il microscopio multifotonica, l'acquisizione di 30 fotogrammi (500 micron x 500 micron) in una serie Z è di circa 60 sec. Poiché la durata osservata intravasation cellule tumorali può essere dell'ordine di minuti 13, catturando diversi Z-stack di ricostruzione 3D intravasation, il tempo di acquisizione di un Z-stack è stato limitato to 60 sec. Pertanto, un singolo campo visivo con un massimo di 30 fette in Z-stack è stato acquisito. Inoltre, dal momento che la ricostruzione 3D delle cellule è stata voluta, il passo assiale tra Z-fette è stato fissato a 2 micron. Questo permette di informazioni sufficienti sui volumi cellulari per consentire ricostruzione 3D. Questi parametri devono essere ottimizzati per qualsiasi software microscopio e di imaging utilizzata basato sulla cinetica degli eventi dal vivo in fase di studio.
La modifica del gommino sul palco microscopio e la coda vena iv catetere hanno sia consentito un aumento significativo tempo di imaging. Le forme pad in gomma un pozzo per consentire l'idratazione mantenuto del tumore, riducendo al minimo la deriva XY sul vetrino di vetro. La combinazione della camera di riscaldamento con la somministrazione di PBS mantiene idratazione e temperatura fisiologica degli animali. Queste condizioni combinate mantenere la perfusione vascolare e il flusso di sangue per consentire l'imaging prolungato di eventi cellulari ai vas tumoraliCulature tra cui la permeabilità vascolare e intravasation delle cellule tumorali.
Una limitazione di questa tecnica è il numero di etichette fluorescenti che possono essere utilizzati per visualizzare le cellule nel microambiente tumorale. Generazione di topi transgenici con altri tipi di cellule (ad esempio, cellule endoteliali, fibroblasti o periciti) contenenti proteina fluorescente può essere difficile e richiede tempo. Tuttavia, le future applicazioni potenziali potrebbero utilizzare una combinazione di etichettatura proteina fluorescente di tipi di cellule stromali di cellule tumorali impiantate e 70 kDa destrano etichettatura dei macrofagi. Usando una combinazione di queste strategie etichettatura e attraversando topi transgenici nuove combinazioni di etichette cellulari possono essere generate per valutare il movimento e gli eventi cellulari nel microambiente tumorale.
A differenza di esperimenti end-point sulla base di immunofluorescenza, ad alta risoluzione intravitale microscopio permette la visualizzazione di spontanea e transitoriaeventi nel microambiente tumorale. La procedura di imaging intravitale qui descritta rivela nuovi eventi e interazioni cellulari nel microambiente tumorale che non possono essere decifrati da immagini statiche. Con nuove informazioni sui tipi di cellule che interagiscono o processi, e la cinetica di questi eventi, ipotesi possono essere generati per studiare le vie di segnalazione che guidano queste interazioni.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta dal Dipartimento della Difesa Breast Cancer Research Program con il numero premio (ASH, W81XWH-13-1-0010), NIH CA100324, CA100324 PPG, e il programma di imaging integrato.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 155 kDa dextran-tetramethylrhodamine isothiocyanate | Sigma Aldrich | T1287 | reconstitute at 20 mg/ml in 1x PBS |
| 70 kDa dextran-Texas Red | Life Technologies | D-1830 | reconstitute at 10 mg/ml in 1x PBS |
| 10 kDa dextran-fluorescein isothyocyanate | Sigma Aldrich | FD10S | reconstitute at 20 mg/ml in 1x PBS |
| Qdot 705 ITK Amino (PEG) Quantum Dots | Life Technologies | Q21561MP | Dilute 25 μl in 175 μl of 1x PBS for injection |
| MMTV-PyMT mice | Jackson Laboratory | 2374 | |
| Csf1r-ECFP mice (Csf1r-Gal4/VP16,UAS-ECFP) | Jackson Laboratory | 26051 | |
| Csf1r-EGFP mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
| 1x PBS | Life Technologies | ||
| Isoethesia (isoflurane) | Henry Schein Animal Health | 50033 | 250 ml |
| Oxygen | AirTech | ||
| 1 ml syringe, tuberculin slip tip | BD | 309659 | |
| 30 G x 1 (0.3 mm x 25 mm) needle | BD | 305128 | |
| Polyethylene micro medical tubing | Scientific Commodities Inc | BB31695-PE/1 | 0.28 mm I.D. x 0.64 mm O.D. |
| Microscope coverglass | Corning | 2980-225 | thickness 1.5, 22 x 50 mm |
| PhysioSuite MouseSTAT pulse oximeter, software and sensors | Kent Scientific | ||
| Laboratory tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| soft rubber pad | McMaster-Carr | 8514K62 | Ultra-Soft Polyurethane Film, 3/16” Thick, 12" x 12", 40 Oo Durometer, Plain Back |
| hard rubber pad | McMaster-Carr | 8568K615 | High-Strength Neoprene Rubber Sheet 1/4" Thick, 12" x 12", 50 A Durometer |
| Microscope | Olympus | The microscope is a custom built two laser multiphoton microscope based on an Olympus IX-71 stand utilizing a 20X 1.05NA objective lens. | |
| 7-Punch set | McMaster-Carr | 3429A12 | 1/4" to 1" Hole Diameter, for Hammer-Driven Hole Punch |
References
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