RNA-Reinigung aus intrazellulär Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; In Makrophagenzellen

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine Methode zur Isolierung von bakterieller RNA aus Listeria monocytogenes Bakterien, die in murinen Makrophagen wachsen. Diese Technik kann auch bei anderen intrazellulären Krankheitserregern und Wirtszellen von Säugetieren eingesetzt werden.

Zusammenfassung

Die Analyse des Transkriptoms von bakteriellen Krankheitserregern während einer Säugetierinfektion ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung von Genen und Faktoren, die eine Infektion vermitteln. Die Isolierung bakterieller RNA aus infizierten Zellen oder Geweben ist jedoch eine schwierige Aufgabe, da die Säugetier-RNA hauptsächlich die Lysate infizierter Zellen dominiert. Hier beschreiben wir eine optimierte Methode zur RNA-Isolierung von Listeria monocytogenes Bakterien, die in Makrophagenzellen aus dem Knochenmark wachsen. Nach der Infektion werden die Zellen leicht lysiert und schnell filtriert, um die meisten Wirtsproteine und RNA zu verwerfen, während intakte Bakterien erhalten bleiben. Anschließend wird die bakterielle RNA durch Heißphenol-SDS-Extraktion isoliert, gefolgt von einer DNase-Behandlung. Die extrahierte RNA eignet sich für die Gentranskriptionsanalyse mit mehreren Techniken. Diese Methode wird erfolgreich in unseren Studien zur Genregulation von Listeria monocytogenes während der Infektion von Makrophagenzellen ^1-4 eingesetzt. Das Protokoll kann leicht modifiziert werden, um andere bakterielle Krankheitserreger und Zelltypen zu untersuchen.

Einleitung

Die intrazelluläre bakterielle Erreger ─ Bakterien verursachen Infektionskrankheiten und in der Lage zu wachsen und in den Zellen von menschlichen Wirten Wiedergabe ─ sind ein großes Gesundheitsproblem weltweit ^5. Um eindringen und zu replizieren in einer Säugerzelle, haben intrazelluläre Erreger anspruchsvolle Virulenzmechanismen und Faktoren erworben. Während diese Mechanismen grundlegender Bedeutung für die Fähigkeit sind, eine Krankheit zu verursachen, wissen wir wenig über ihre Regulation und Dynamik. Da Genexpressionsprofile von in flüssigen Medien gezüchtet Bakterien nicht die tatsächliche Umgebung, in Wirtszellen beziehen, gibt es einen wachsenden ....

Protokoll

Anmerkung: Während des gesamten Versuchs werden Makrophagenzellen bei 37 ° C in einem 5% CO ₂ Umluft Inkubator inkubiert und nur aus dem Inkubator genommen für experimentelle Manipulationen, die in einer Klasse - II biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden. Arbeiten mit L. monocytogenes Bakterien ist nach biologischen Sicherheitsstufe 2 Vorschriften.

1. Zellpräparation und bakterielle Infektion (Tag 1 und 2)

1. Tag 1
   1. Seed 2,0 x 10 ⁷ Knochenmark stammMakrophagenZellen (BMDM) auf einer 145 mm - Schale in 30 ml BMDM + Pen-Strep - Medien (Tabelle 2). Seed 3 Platten für jeden Bakteriensta....

Ergebnisse

Das Modellsystem ist in Figur 1 und enthält Makrophagenzellen mit L. infiziert gezeigten monocytogenes Bakterien, die in den Makrophagen Cytosol replizieren. 2 sind die Versuchsschema darstellt. Abbildung 3 stellt typische Ergebnisse solcher RT-qPCR - Analyse von Virulenzgenen bei WT L. monocytogenes Wachstum in Makrophagen im Vergleich zum Wachstum in den reichen Labor Medium BHI. Die Ergebnisse zeigen die Tra.......

Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll stellt ein optimiertes Verfahren zur Isolierung von bakteriellen RNA aus L. monocytogenes Bakterien intrazellulär in Makrophagen - Zellen wachsen. Dieses Protokoll basiert auf Zell Differential-Lyse und umfasst zwei Hauptschritte zur Anreicherung von bakterieller RNA: Makrophagen-Kerne Sedimentation mittels Zentrifugation und eine schnelle Ansammlung von Bakterien durch Filtration. Diese Schritte werden durch eine Standard-RNA-Extraktionsverfahren gefolgt. Während dieses Protokol.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Listeria monocytogenes 10403S			20
Aus dem Knochenmark gewonnene Makrophagen, hergestellt aus C57B/6 weiblichen			Mäusen21
H2O, RNAse-frei	ThermoScientific	10977-015	DEPC-behandeltes Wasser kann verwendet werden
DMEM	Gibco	41965039
Glutamin	Gibco	25030081
Natriumpyruvat	Gibco	11360-088
β-Mercaptoethanol	Gibco	31350010
Pen/Strep	Gibco	15140-122
Gentamicin	Sigma-Aldrich	G1397
FBS	Gibco	10270106
Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung-PBS	Sigma-Aldrich	D8537
Gehirn-Herz-Infusion (BHI)	Merckmillipore	1104930500
Phenol gesättigt pH 4,3	Fisher	BP1751I-400
Chloroform	Fisher	BP1145-1
Iso-Amylalkohol	Sigma-Aldrich	W205702
Natriumacetat	Sigma-Aldrich
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
DNaseI	Fermentas	EN0521
SDS 10%	Sigma-Aldrich	L4522
Ethanol absolut	Merck Millipore	1070174000
37 ° C, 5% CO2 Umluft-Inkubator	Thermo Scientific	Modell 3111
Zellabstreifer	Nunc	179693
Kontes Glashalter für 45 mm Filter	Fisher	K953755-0045
MF-Millipore Filter 45  mm, 0,45  &Mikro; m	Merck Millipore	HAWP04700
SpeedVac System	Thermo Scientific	SPD131DDA
Vortex-Genie 2	Scientific Industries	Modell G560E
NanoDrop	Thermo Scientific
145 mm Zellkulturschalen	Greiner	639 160
1,7 ml Röhrchen, RNase-frei	Axygen	MCT-175-C
30°; C Inkubator	Thermo Scientific
65 ° C Heizblock	Thermo Scientific
4 ° C-Tischzentrifuge	Eppendorf	5417R
Sterile Pipetten, 25 ml	Greiner
Falcon Röhrchen, 50 ml	Greiner
Flüssigstickstoff

W302406