Introduction
Die intrazelluläre bakterielle Erreger ─ Bakterien verursachen Infektionskrankheiten und in der Lage zu wachsen und in den Zellen von menschlichen Wirten Wiedergabe ─ sind ein großes Gesundheitsproblem weltweit 5. Um eindringen und zu replizieren in einer Säugerzelle, haben intrazelluläre Erreger anspruchsvolle Virulenzmechanismen und Faktoren erworben. Während diese Mechanismen grundlegender Bedeutung für die Fähigkeit sind, eine Krankheit zu verursachen, wissen wir wenig über ihre Regulation und Dynamik. Da Genexpressionsprofile von in flüssigen Medien gezüchtet Bakterien nicht die tatsächliche Umgebung, in Wirtszellen beziehen, gibt es einen wachsenden Bedarf an Transkriptom in ihren intrazellulären Nischen gewachsen von Bakterien analysiert. Solche Analysen werden die Entzifferung von spezifischen bakteriellen Anpassungen durch den Host ausgelöst ermöglichen und wird dazu beitragen, neue Ziele für therapeutische Design zu identifizieren. Transkriptom-Analyse von intrazellulär gewachsen Bakterien ist sehr anspruchsvoll, da Säuger RNA durch an bakterielle RNA-Überzahlmindestens das Zehnfache. In diesem Manuskript beschreiben wir eine experimentelle Methode bakterielle RNA von Listeria monocytogenes Bakterien zu isolieren innerhalb murine Makrophagen - Zellen wachsen. Die extrahierte RNA kann verwendet werden, intrazelluläre Anpassungen und Virulenzmechanismen von pathogenen Bakterien durch verschiedene Techniken von Transkriptionsanalyse, wie beispielsweise RT-PCR, RNA-Seq, Mikroarray und andere Hybridisierungs basierten Technologien zu studieren.
L. monocytogenes ist der Erreger der Listeriose beim Menschen eine Krankheit mit klinischen Manifestationen Targeting in erster Linie Personen mit geschwächtem Immunsystem, ältere Menschen und schwangere Frauen 6. Es ist ein Gram-positive fakultativ intrazelluläre Erreger , die eine breite Palette von Säugetierzellen befällt, die seit Jahrzehnten als ein Modell in der Wirt-Pathogen - Interaktionen 7 Studien verwendet wurden. Nach invasion, liegt es zunächst in einer Vakuole oder einem phagosome (im Falle von Phagozyten), von dem es in t entweichen müssener Gastgeber um Zellzytosol zu replizieren. Mehrere Virulenzfaktoren wurden 8 das Entweichen Prozess zu vermitteln gezeigt, in erster Linie die porenbildende Hämolysin, Listeriolysin O (LLO) und zwei zusätzliche Phospholipasen. Im Cytosol nutzen die Bakterien die Host - Aktin - Polymerisation Maschinen selbst auf Aktin - Filamenten innerhalb der Zelle zu treiben und von Zelle zu Zelle (1) zu verteilen. Alle wichtigen Virulenzfaktoren von L. monocytogenes beteiligt Invasion, intrazellulären Überleben und die Replikation, werden vom Master Virulenz Transkriptionsregulator aktiviert, PrfA. 8-10.
In den letzten zehn Jahren mehrere Studien , die von uns durchgeführt und haben andere Methoden zur Transkriptom - Analyse von intrazellulär gewachsenen Bakterien in Wirtszellen 2,11-15 erfolgreich angewendet. Zwei Hauptansätze sind verwendet, um bakterielle RNA von Wirt-RNA zu trennen, die basieren auf: 1) Selektive Anreicherung von bakterieller RNA und 2) RNA-Isolierung durch differenz Zell-Lyse. Der erste Ansatz beruht auf subtraktive Hybridisierung von Gesamt - RNA - Extrakten zu Säuger - RNA - Moleküle (beispielsweise kommerziell erhältlichen Kits) oder selektive Erfassung von bakteriellen transkribierte Sequenzen (SCOTS) 11. Der zweite Ansatz beruht auf differentiellen Lysis von Bakterien und Wirtszellen, in denen die Wirtszellen lysiert werden, während Bakterienzellen intakt bleiben. Bakterienzellen werden dann aus der Wirtszelle Lysat, üblicherweise durch Zentrifugation abgetrennt und die RNA Standardtechniken extrahiert werden. Das Hauptproblem mit diesem Ansatz ist, dass zusammen mit der intakten Bakterien-Wirtszellen Zellkerne sind ebenfalls isoliert, so dass die RNA-Präparationen noch Säuger RNA enthalten. Eine Möglichkeit, dieses Problem zu überwinden, ist intakten Bakterien aus Wirtszellen Zellkerne unter Verwendung differentieller Zentrifugation zu trennen, obwohl dieses Verfahren in der Regel Zeit in Anspruch nimmt während der Extraktion das Anliegen von Veränderungen in Genexpressionsprofil zu erhöhen. In diesem Papier stellen wir eine verbesserte und schnelle bacteria RNA-Extraktion-Protokoll, das auf die Zelldifferential Lyse-Ansatz basiert. Zuerst L. monocytogenes Makrophagenzellen infiziert sind , mit kaltem Wasser lysiert. Als nächstes werden Makrophagen-Kerne werden durch eine kurze Zentrifugation entfernt und intakten Bakterien schnell auf Filtern gesammelt, aus dem RNA heißem Phenol-SDS-Extraktion bakterieller Nukleinsäuren isoliert werden.
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Protocol
Anmerkung: Während des gesamten Versuchs werden Makrophagenzellen bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Umluft Inkubator inkubiert und nur aus dem Inkubator genommen für experimentelle Manipulationen, die in einer Klasse - II biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden. Arbeiten mit L. monocytogenes Bakterien ist nach biologischen Sicherheitsstufe 2 Vorschriften.
1. Zellpräparation und bakterielle Infektion (Tag 1 und 2)
- Tag 1
- Seed 2,0 x 10 7 Knochenmark stammMakrophagenZellen (BMDM) auf einer 145 mm - Schale in 30 ml BMDM + Pen-Strep - Medien (Tabelle 2). Seed 3 Platten für jeden Bakterienstamm zu analysieren. Über Nacht bei 37 ° C inkubieren in einem 5% CO 2 Inkubator Gebläseluft.
- Starten Sie eine Nacht Bakterienkultur von Wildtyp (WT) L. monocytogenes Stamms 10403S in 10 ml Hirn - Herz - Infusion (BHI) -Medium bei 30 ° C in einem Standard - Inkubator. Platz Kulturröhrchen schräg ohne Schütteln. Hinweis:Diese Wachstumsbedingungen bis regulieren die Expression der Flagellen Gene, die effiziente Infektion fördert.
- Tag 2
- Vorwärmen BMDM Medium (ohne Pen-Strep - Antibiotika) (Tabelle 2) und Phosphat - gepufferter Salzlösung (PBS) bei 37 ° C.
- Makrophagen-Monoschicht wasche zweimal mit 25 ml vorgewärmtes PBS Antibiotika zu entfernen. 30 ml frisch BMDM Medium.
- Waschen wurden 1,5 ml Bakterienkultur über Nacht mit PBS durch Bakterien bei> 14,000 × g für 1 min, Verwerfen des Überstandes und Resuspendieren Bakterien sanft in 1,5 ml PBS durch Pipettieren Zentrifugieren. Zweimal wiederholen.
- Infect jede Makrophagen Platte mit 0,5 ml einer gewaschen Nacht - Kultur von Wildtyp L. monocytogenes. Wenn mehrere Platten verwenden, infizieren auseinander jede Platte 15 min. Dieses Zeitintervall ermöglicht jede Platte einzeln am Ende der Infektion erntet.
Hinweis: Die Vielzahl der Infektion (MOI) durch Plattierung serielle Verdünnung getestet wirds Bakterienkultur für eine Infektion auf BHI-Agarplatten und Zählen koloniebildenden Einheiten (CFU) nach 24-stündiger Inkubation der Platten bei 37 ° C verwendet. Mit 0,5 ml WT L. monocytogenes Stamm 10403S Ergebnisse in einer MOI von ~ 100 (100 Bakterien KBE pro Makrophagen - Zelle). Bei bakteriellen Mutanten in das intrazelluläre Wachstum zu analysieren, sollte eine höhere MOI in Betracht gezogen werden. - Nach 0,5 Stunden Inkubation bei 37 ° C, waschen Sie die infizierten Zellen zweimal mit PBS, ungebunden Bakterien zu entfernen, und 30 ml vorgewärmten BMDM Medium. Befestigt Bakterien werden bei der nächsten 0,5 Stunden internalisieren.
- Bei 1 h nach Infektion, fügen Sie 30 ul Gentamicin (1: 1000 bis zu einer Endkonzentration von 50 ug / ml erreichen) extrazelluläre Bakterien zu töten.
- Bauen Sie die Filtervorrichtung durch einen Filterkopf auf einem Sammelflüssigkeit Kolben, der mit einem Vakuumaustrittsöffnung platzieren. Dann legen Sie einen Filter (0,45 & mgr; m) auf einem Filterkopf, durch einen Zylinder Trichter gefolgt und sichern die verschiedenen Teile mit einem Metall-cLampe. Bereiten Sie eiskalten RNase-freies Wasser.
- Nach 6 Stunden nach der Infektion, Ernte Bakterien aus infizierten Zellen wie folgt. Behandeln Sie jeden einzeln Platte.
Hinweis: In der Regel L. monocytogenes abgeschlossen 1-log des Wachstums während 6 Stunden der Infektion in Makrophagenzellen. Längere Inkubationen in bakterielle Überwucherung und Zelltod der Makrophagen führen könnte, während kürzere Inkubationszeiten deutlich niedriger Bakterienbelastungen führen könnte. Die MOI und die Zeit der Infektion kann modifiziert werden, um optimale Bedingungen zu erreichen.- Waschen infizierten Zellen einmal mit PBS. 20 ml eiskaltem RNase-freies Wasser zu Makrophagenzellen lysieren. Mit einem Zellschaber abkratzen die Zellen von der Platte schnell, aber sorgfältig.
- Sammeln lysierten Zellen auf eine 50 ml konischen Röhrchen. Vortex für 30 Sekunden. Zentrifuge bei 800 × g für 3 min bei 4 ° C.
- Führen Sie den Überstand durch das Filtergerät über ein Vakuumsystem. Mit einer Pinzette, den Filter rollen und es schnell übertragen zu einem 15 ml conical Rohr. Snap-gefrieren die Rohre mit den Filtern in flüssigem Stickstoff.
- Bauen Sie die Filtrationsvorrichtung mit einem neuen Filter für die nächste Probe, wie in 1.2.7 beschrieben.
- Lagern Sie die gefrorenen Filter bei -80 ° C für den nächsten Tag. Alternativ gehen Sie direkt zur Nukleinsäure-Extraktion.
2. Nucleic Acids Extraction (Tag 3)
Hinweis: Führen Sie alle Manipulationen mit Phenol und Chloroform-Lösungen in einem Abzug.
- Bereiten Sie eine 1: 1-Mischung aus angesäuerten Phenol: Chloroform, 400 & mgr; l für jede Probe. Mischen Sie in getrennten Röhren, und dann ziehen Sie die resultierende wässrige Schicht durch Absaugen. In 40 ul 10% SDS.
- Tauen Sie die Filter enthaltenden Röhrchen auf Eis sie kalt zu halten. Jedem Filter enthaltende Röhre fügen 650 ul Acetat-EDTA (AE) Puffer (Tabelle 2).
- Führen Sie die folgenden Schritte so schnell wie möglich.
- Energisch verwirbeln das Rohr den Filter so enthältdass der Filter Handrührer zum Umfang des Rohres und der Puffer voll wäscht den Filter. Halten Sie das Rohr kalt, indem sie es wieder auf Eis gestellt. Hinweis: Es kann notwendig sein, um zusätzlich das Rohr verwirbeln, während umgekehrt, um vollständig die Bakterien aus dem Filter zu waschen.
- Wiederholen Sie dies für alle Röhrchen. Es kann nützlich sein, kurz die Suspension auf Spin-down (1 min bei 120 xg) am Ende des Prozesses.
- Übertragung der bakterienhaltigen Puffer in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, die SDS und Phenol / Chloroform-Mischung, enthaltend (hergestellt wie in 2.1). Wiederholen Sie dies für alle Röhrchen. Es kann notwendig sein, die Filter enthalten, Rohre (1 min bei 120 · g) wieder zu spinnen Restpuffer aus dem Filter zu erhalten.
- Legen Sie alle 1,5-ml-Röhrchen in einem Mehrrohrwirbelvorrichtung und Wirbel bei voller Geschwindigkeit für 10 min.
- Inkubieren der Röhrchen in ein 65 ° C Heizblock für 10 min. Zentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit (> 14.000 x g) für 5 min.
- Übertragen Sie die wässrige Schicht (etwa 400 ul) von jedem tube in ein neues 1,5-ml-Röhrchen 40 ul 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 1,0 ml 100% Ethanol enthält. Vortex jedes Röhrchen gründlich.
Hinweis: Glycogen kann in diesem Schritt zugegeben werden Sichtbarmachung des ausgefällten Pellet zu verbessern. - Inkubieren der Proben bei -80 ° C für 1 Stunde. Alternativ brüten Proben bei -20 ° C über Nacht. zentrifugieren Dann werden die Proben bei 4 ° C für 20 min bei maximaler Geschwindigkeit (> 14.000 xg).
- absaugen vorsichtig die Ethanol (obere Schicht) aus jedem Röhrchen. In 500 & mgr; l kaltem 70% Ethanol zu jeder Probe und Vortex gründlich. Zentrifuge bei 4 ° C für 20 min bei maximaler Geschwindigkeit (> 1 4,000 xg).
- absaugen vorsichtig das Ethanol aus jedem Röhrchen. Trocknen Sie die Proben für ca. 2 min einen Vakuumverdampfer ohne Wärme. Nicht zu trocknen die Proben.
- Zugeben von 25 & mgr; l RNase-freies Wasser zu jeder Probe. für 20 min bei Raumtemperatur inkubieren. Sorgfältig Wirbel und Spin-down.
- Messen Sie RNA-Konzentration in ter Proben unter Verwendung eines Mikrovolumens UV-Vis-Spektralphotometer. Erwarten Sie etwa 0,5 zu extrahieren - 1 ug Nukleinsäuren pro Platte.
Anmerkung: Technical Replikaten kann auf dieser Stufe kombiniert werden.
3. DNase-Behandlung
- Eingerichtet , um die Reaktion gemäß Tabelle 1 in einem Mikrozentrifugenröhrchen. für 45 min bei 37 ° C inkubieren. In 450 & mgr; l RNase-freiem Wasser und 500 ul Phenol-Chloroform-IAA - Mix (Tabelle 2), getrennte Phasen von 2 min bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugiert (> 14.000 xg).
- Übertragen Sie die wässrige Phase in ein neues Röhrchen und fügen 500 ul Chloroform-IAA - Mix (Tabelle 2), Wirbel und getrennte Phasen von 2 min Zentrifugation bei maximaler Geschwindigkeit (> 14.000 xg).
- Übertragen die wässrige Schicht in ein neues Röhrchen und Zugabe von 1 ml Ethanol und 50 ul 3 M Natriumacetat (pH 5.2). Wirbel.
Hinweis: Glycogen kann in diesem Schritt zugegeben werden Sichtbarmachung des ausgefällten Pellet zu verbessern. - absaugen vorsichtig das Ethanol aus jedem Röhrchen. In 500 & mgr; l kaltem 70% Ethanol zu jeder Probe und Vortex gründlich. Zentrifuge bei 4 ° C für 20 min bei maximaler Geschwindigkeit. absaugen vorsichtig das Ethanol aus jedem Röhrchen.
- Trocknen Sie die Proben für ca. 2 min einen Vakuumverdampfer ohne Wärme. Nicht zu trocknen die Proben.
- In 12 ul RNase-freies Wasser, Inkubation für 2 min bei Raumtemperatur, Wirbel und Spin-down. Die Proben enthalten gereinigte RNA, halten sie auf dem Eis. Alternativ lösen sich RNA in RNase-freiem H 2 O mit 0,1 mM EDTA oder TE - Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA).
- Messen Sie RNA-Konzentrationen mit Hilfe eines Mikrovolumens UV-Vis-Spektralphotometer. Erwarten Sie ~ 100 ng RNA pro Probe (wenn technische Replikate kombiniert werden).
Anmerkung: RNA extrahiert gemäß diesem Protokoll ist geeignet for Gen-Transkription Analyse von mehreren Techniken. Wir in der Regel RT-qPCR - Analyse beschäftigen L. zu studieren monocytogenes Gen - Transkription während der Infektion von Makrophagen - Zellen 1-4.
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Representative Results
Das Modellsystem ist in Figur 1 und enthält Makrophagenzellen mit L. infiziert gezeigten monocytogenes Bakterien, die in den Makrophagen Cytosol replizieren. 2 sind die Versuchsschema darstellt. Abbildung 3 stellt typische Ergebnisse solcher RT-qPCR - Analyse von Virulenzgenen bei WT L. monocytogenes Wachstum in Makrophagen im Vergleich zum Wachstum in den reichen Labor Medium BHI. Die Ergebnisse zeigen die Transkriptionsniveaus von zwei wichtigen Virulenzfaktoren von L. monocytogenes; hly kodierend LLO - Toxin und actA kodierend Aktin - Zusammensetzungs - Protein, das bei der Infektion von Makrophagen robust induziert werden.
Abbildung 1: Allgemeiner Überblick über L. monocytogenes Lifestyle als Intracellular Pathogen. L. monocytogenes dringt in Wirtszellen durch spezialisierte Proteine bezeichnet Intern exprimieren , die aktive Internalisierung in nichtphagozytischen Zellen induzieren, während Fresszellen , die Bakterien phagozytieren. Bei der Invasion, L. monocytogenes wird zunächst in einem Endosom / phagosome Vakuole , aus dem sie schnell entweicht mit in erster Linie das Listeriolysin O - Toxin (LLO) gefunden. Innerhalb der Wirtszelle Cytosol L. monocytogenes repliziert schnell, und breitet sich von der Zelle unter Verwendung von Aktin - basierte Motilität über seine ActA - Protein zu Zelle. Alle genannten Virulenzfaktoren durch die Master - Virulenz - Aktivator reguliert werden, PrfA. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Darstellung von Flussdiagramm der Experimental Vorgehensweise. Die wichtigsten Schritte umfassen die Lyse von infizierten Zellen, die Trennung von Wirtszellen Kerne und Bakterienzellen und RNA - Isolierung. Kritische Schritte dargestellt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Transkriptionsanalyse von Virulenz - Gene während L. monocytogenes intrazelluläres Wachstum. Transkriptionsanalyse von hly - Gen (LLO kodieren) und des ACTA - Gens während der L. monocytogenes 10403S intrazelluläre Wachstum in Makrophagenzellen bei 6 Stunden nach der Infektion im Vergleich zu ihren Ebenen während des exponentiellen Wachstums in BHI - Medium RT-qPCR - Analyse. Transkriptionsniveaus werden als relative Menge (RQ) dargestellten relativenauf die Transkriptionsniveaus während des Wachstums in BHI. Transkriptionsniveaus waren zu den Ebenen der 16S rRNA als Referenz Gen normalisiert. Die Daten sind repräsentativ für 3 unabhängige biologische repeats (N = 3). Die Fehlerbalken stellen 95% Konfidenzintervall. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| RNA | bis zu 2 & mgr; g (in max Volumen von 44 ul) |
| 10x DNase Puffer | 5 ul |
| RNase-freies Wasser | komplett bis 50 & mgr; l Gesamtvolumen |
| DNAse | 1 ul (1 Einheit) |
Tabelle 1: DNase Reaktion Protokoll.
| 1. 500 ml BMDM + Pen-Strep Medien (Filter sterilisiert): | |
| DMEM | 235 ml |
| FBS (inaktiviert 30 min bei 54 ° C) | 100 ml |
| M-CSF (L-929 - konditioniertes Medium) 19 | 150 ml |
| Glutamin | 5 ml |
| Natriumpyruvat | 5 ml |
| & beta; -Mercaptoethanol | 0,5 ml |
| Penicillin / Streptomycin | 5 ml |
| Gesamt | 500 ml |
| 2. 500 ml BMDM (Filter sterilisiert): | |
| DMEM | 235 ml |
| FBS (inaktiviert 30 min bei 54 ° C) | 100 ml |
| M-CSF (L-929 - konditioniertes Medium) 19 | 150 ml |
| Glutamin | 5 ml |
| Natriumpyruvat | 5 ml |
| & beta; -Mercaptoethanol | 0,5 ml |
| Gesamt | 500 ml |
| 3. AE - Puffer | |
| NaOAc pH 5.2 | 50 mM |
| EDTA | 10 mM |
| RNase-freies Wasser | |
| 4. Phenol-Chloroform-IAA | |
| Phenol | 25 ml |
| Chloroform | 24 ml |
| Iso-Amylalkohol | 1 ml |
| 5. Chloroform-IAA | |
| Chloroform | 24 ml |
| Iso-Amylalkohol | 1 ml |
Tabelle 2: Rezepte von Medien und Puffer.
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Discussion
Das hier beschriebene Protokoll stellt ein optimiertes Verfahren zur Isolierung von bakteriellen RNA aus L. monocytogenes Bakterien intrazellulär in Makrophagen - Zellen wachsen. Dieses Protokoll basiert auf Zell Differential-Lyse und umfasst zwei Hauptschritte zur Anreicherung von bakterieller RNA: Makrophagen-Kerne Sedimentation mittels Zentrifugation und eine schnelle Ansammlung von Bakterien durch Filtration. Diese Schritte werden durch eine Standard-RNA-Extraktionsverfahren gefolgt. Während dieses Protokolls Reinigung von listeriellen RNA beschreibt, kann sie leicht auf andere bakterielle Pathogene modifiziert werden. Obwohl das Verfahren auf die Reinigung von RNA für die transkriptionelle Analyse konzentriert sich das verwendete Prinzip die intrazellulär wachsenden Bakterien aus seinem Wirt zu trennen , können auch zur Reinigung von anderen Bakterienkomponenten, wie DNA, Proteine, Zellwand usw. Solche genomischen aufgebracht werden und biochemische Analysen würde ein besseres Verständnis und die Charakterisierung der intrazellulären Erreger liefernLebenszyklus während des Verlaufs der Infektion.
Das Verfahren führt in ~ 100 ng Gesamt-bakterielle RNA. Obwohl RNA Ausbeuten relativ niedrig sind, sind sie Downstream-Analysen der Gentranskription unter Verwendung mehrerer Techniken, wie beispielsweise RT-qPCR, RNA-Seq und moderne Hybridisierung basierenden Technologien geeignet. Um RNA-Ausbeuten zu verbessern, ist es empfehlenswert, frische Bakterien Inokula zu verwenden, sowie frische Phenollösung nukleasefreiem Wasser und Puffer möglich RNase Kontaminationen zu vermeiden. Geernteten Bakterien und isolierte RNA sollte immer auf Eis während des Extraktionsprozesses zu halten. Die Infektion Zeit kann auf die biologische Frage eingestellt werden, in Abhängigkeit und der Organismus untersucht. Um die RNA-Mengen zu erhöhen, kann das Experiment skaliert werden bis zu mehr Infektion Platten pro jeder Probe enthalten.
Die Hauptsorge bei solchen Durchführung eines Experiments ist das Risiko des Transkriptionsprofils der Bakterien während des Erntens Schritten zu verändern. Die meisten bacteria reagieren auf Kälte durch Kälteschock Stressreaktionen zu aktivieren und somit bakterielle Ernte sollte so schnell wie möglich durchgeführt werden. Reagenzien und Geräte sollten vor der Zeit vorbereitet werden, und jede Probe sollte getrennt behandelt werden. Der kritischste Schritt ist, um sofort die Filterhaltigen Bakterien in flüssigem Stickstoff einzufrieren. kann so dramatisch Sie dies nicht die Qualität der isolierten RNA reduzieren. Ein weiterer wichtiger Schritt in diesem Protokoll ist die Ethanolfällung der relativ geringen Mengen an Nukleinsäuren. Besondere Sorgfalt sollte nicht zu stören, die unsichtbare Nukleinsäuren Pellet entnommen werden. Glycogen kann in die Fällungslösung gegeben werden Visualisierung des Pellets während dieser Schritte zu verbessern.
Für einige spätere Anwendungen, zB RT-qPCR, DNA zu entfernen , ist kritisch. 5-fach in der Gesamtmenge von Nukleinsäuren folgende DNase t - Obwohl wir eine Reduktion von 3 nicht routinemäßig die Effizienz der DNase-Behandlung zu überwachen,reatment ist indikativ für eine effiziente DNase-Behandlung. Zu beachten ist, ist jeder im Handel erhältliche Technik oder Kit für die DNA-Entnahme aus RNA-Proben geeignet. Zusätzlich Qualitätskontrollproben verwendet, wie beispielsweise eine Probe ohne reverse Transkription durchgeführt wird, ist vorteilhaft in solchen Anwendungen.
Eine wesentliche Einschränkung des hier beschriebene Protokoll ist die relativ geringe Menge an RNA extrahiert, die etwa 100 ng der Gesamt-RNA ist. Somit ist diese Technik für klassische Hybridisierungstechniken nicht geeignet, wie Northern - Blot - Analyse, die Mikrogramm RNA erfordert.
Die jüngsten technologischen Fortschritte in der RNA - Sequenzierung (tiefe RNA-seq) ermöglicht die Analyse sowohl der bakterielle Erreger und den Säugerwirt Transkriptionsprofile zusammen, ohne die Notwendigkeit , ihre RNAs zu trennen, ein Verfahren namens "Dual - RNA-seq" 16-18. Obwohl Dual-RNA-seq Analyse Wirt-Pathogen in Studium Interaktion ideal ist, ist es sehr expensive und kann nicht häufig verwendet werden. Weil bakterielle RNA-Gehalt in infizierten Zellen besonders gering ist, ist es extrem schwierig und teuer genug bakterielle liest für eine effektive Genexpressionsanalyse, auch mit der hohen Lesetiefe bereitgestellt durch neueste Sequenzierplattformen erhalten. Ein zusätzlicher Nachteil dieses Ansatzes ist die häufige Verwendung einer RNA oder cDNA Amplifikationsschritt, die zu verzerrten Ergebnissen der Genexpression führen kann. Das hier vorgestellte Verfahren bietet einen Kompromiss zwischen Informationen erhalten und Wirtschaftlichkeit.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Listeria monocytogenes 10403S | 20 | ||
| Bone marrow derived macrophages prepared from C57B/6 female mice | 21 | ||
| H2O, RNAse free | Thermo Scientific | 10977-015 | DEPC-treated water can be used |
| DMEM | Gibco | 41965039 | |
| Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-088 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco | 31350010 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
| FBS | Gibco | 10270106 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline-PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Brain heart infusion (BHI) | Merckmillipore | 1104930500 | |
| Phenol saturated pH 4.3 | Fisher | BP1751I-400 | |
| Chloroform | Fisher | BP1145-1 | |
| Iso-amyl alcohol | Sigma-Aldrich | W205702 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | W302406 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| DNaseI | Fermentas | EN0521 | |
| SDS 10% | Sigma-Aldrich | L4522 | |
| Ethanol absolute | Merck Millipore | 1070174000 | |
| 37 °C, 5% CO2 forced-air incubator | Thermo Scientific | Model 3111 | |
| Cell scrapers | Nunc | 179693 | |
| Kontes glass holder for 45 mm filters | Fisher | K953755-0045 | |
| MF-Millipore filters 45 mm, 0.45 µm | Merck Millipore | HAWP04700 | |
| SpeedVac system | Thermo Scientific | SPD131DDA | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | Model G560E | |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ||
| 145 mm cell culture dishes | Greiner | 639 160 | |
| 1.7 ml tubes, RNase-free | Axygen | MCT-175-C | |
| 30 °C incubator | Thermo Scientific | ||
| 65 °C heat block | Thermo Scientific | ||
| 4 °C table centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Sterile pipettes, 25 ml | Greiner | ||
| Falcon tubes, 50 ml | Greiner | ||
| Liquid nitrogen |
References
- Lobel, L., et al. The metabolic regulator CodY links Listeria monocytogenes metabolism to virulence by directly activating the virulence regulatory gene prfA. Mol Microbiol. , (2014).
- Lobel, L., Sigal, N., Borovok, I., Ruppin, E., Herskovits, A. A. Integrative genomic analysis identifies isoleucine and CodY as regulators of Listeria monocytogenes virulence. PLoS Genet. 8 , e1002887 (2012).
- Kaplan Zeevi, M., et al. Listeria monocytogenes multidrug resistance transporters and cyclic di-AMP, which contribute to type I interferon induction, play a role in cell wall stress. J Bacteriol. 195, 5250-5261 (2013).
- Rabinovich, L., Sigal, N., Borovok, I., Nir-Paz, R., Herskovits, A. A. Prophage excision activates Listeria competence genes that promote phagosomal escape and virulence. Cell. 150, 792-802 (2012).
- World Health Organization WHO. , http://www.who.int/en/ (2005).
- Swaminathan, B., Gerner-Smidt, P. The epidemiology of human listeriosis. Microbes Infect. 9, 1236-1243 (2007).
- Hamon, M., Bierne, H., Cossart, P. Listeria monocytogenes: a multifaceted model. Nat Rev Microbiol. 4, 423-434 (2006).
- Dussurget, O., Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. Molecular determinants of listeria monocytogenes virulence. Ann Rev Microbiol. 58, 587-610 (2004).
- Portnoy, D. A., Auerbuch, V., Glomski, I. J. The cell biology of Listeria monocytogenes infection: the intersection of bacterial pathogenesis and cell-mediated immunity. J Cell Biol. 158, 409-414 (2002).
- Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen. Nat Rev Microbiol. 7, 623-628 (2009).
- Graham, J. E., Clark-Curtiss, J. E. Identification of Mycobacterium tuberculosis RNAs synthesized in response to phagocytosis by human macrophages by selective capture of transcribed sequences (SCOTS). Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 11554-11559 (1999).
- Toledo-Arana, A., et al. The Listeria transcriptional landscape from saprophytism to virulence. Nature. 459, 950-956 (2009).
- Schnappinger, D., et al. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis within Macrophages: Insights into the Phagosomal Environment. J Exp Med. 198, 693-704 (2003).
- Albrecht, M., Sharma, C. M., Reinhardt, R., Vogel, J., Rudel, T. Deep sequencing-based discovery of the Chlamydia trachomatis transcriptome. Nucleic Acids Res. 38, 868-877 (2010).
- La, M. V., Raoult, D., Renesto, P. Regulation of whole bacterial pathogen transcription within infected hosts. FEMS Microbiol Rev. 32, 440-460 (2008).
- Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Dual RNA-seq of pathogen and host. Nat Rev Microbiol. 10, 618-630 (2012).
- Rienksma, R. A., et al. Comprehensive insights into transcriptional adaptation of intracellular mycobacteria by microbe-enriched dual RNA sequencing. BMC Genomics. 16, 34 (2015).
- Afonso-Grunz, F., et al. Dual 3'Seq using deepSuperSAGE uncovers transcriptomes of interacting Salmonella enterica Typhimurium and human host cells. BMC Genomics. 16, 323 (2015).
- Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells. J Immunol Methods. 184, 281-283 (1995).
- Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5, e00969-e900914 (2014).
- Celada, A., Gray, P. W., Rinderknecht, E., Schreiber, R. D. Evidence for a gamma-interferon receptor that regulates macrophage tumoricidal activity. J Exp Med. 160, 55-74 (1984).
