Summary
Transgena manipulationer och genom redigering är avgörande för funktionellt testa roller gener och cis -regulatory element. Här en detaljerad mikroinjektion protokoll för generering av genomiska förändringar (inklusive Tol2-förmedlade fluorescerande reporter transgenstrukturerna, Talens och CRISPRs) presenteras för den framväxande modellen fisken, storspigg.
Abstract
Den storspigg fisk har visat sig vara ett kraftfullt system för att studera den genetiska grunden för ett brett utbud av morfologiska, fysiologiska och beteendemässiga fenotyper. De anmärkningsvärt olika fenotyper som har utvecklats som marina populationer anpassar sig till otaliga sötvattensmiljöer, i kombination med förmågan att passera marina och sötvattensformer, ger en sällsynt ryggradsdjur system där genetiken kan användas för att kartlägga genomregioner styra utvecklats drag. Utmärkt iska resurser finns nu tillgängliga, vilket underlättar molekylärgenetisk dissektion av utvecklade förändringar. Medan kartläggningsexperiment generera listor av intressanta gener är funktionella genetiska manipulationer som krävs för att testa roller dessa gener. Genreglering kan studeras med transgena reporter plasmider och BAC integrerade i genomet med hjälp av Tol2 transposas systemet. Funktioner av specifika gener och cis -regulatory element kan bedömas genom att inducera riktademutationer med talen och crispr / Cas9 genomet redigering reagenser. Alla metoder kräver införande av nukleinsyror i befruktade en-cellpigg embryon, en uppgift gjorde utmanande av den tjocka chorion av pigg embryon och den relativt liten och tunn blastomer. Här är ett detaljerat protokoll för mikroinjektion av nukleinsyror i spigg embryon beskrivs för transgena och genom redigeringsprogram för att studera genuttryck och funktion, samt tekniker för att bedöma framgången för genmodifiering och återställa stabila linjer.
Introduction
En grundläggande komponent för att förstå hur den biologiska mångfalden uppstår är att bestämma de genetiska och utvecklingsmässiga grunderna för evolved fenotypiska förändringar i naturen. Den storspigg fisk, Gasterosteus aculeatus, har dykt upp som en utmärkt modell för att studera den genetiska grunden för utvecklingen. Spigg har genomgått många adaptiva evolutionära förändringar som marina fisk har koloniserat otaliga sötvattensmiljöer runt norra halvklotet, vilket resulterar i dramatisk morfologiska, fysiologiska och beteendeförändringar 1. Genomen av individer från tjugoen pigg populationer har sekvenserats och monteras, och en hög densitet koppling karta har tagits fram för att ytterligare förbättra enheten 2,3. Genetisk kartläggning experiment har identifierat genomregioner underliggande utvecklats fenotyper 4-6, och i några fall har de funktionella roller specifika gener testats 7,8. Ett antal genomregioner underliggande morfologiska förändringar har identifierats med lovande kandidatgener, men dessa kandidater har ännu inte funktionellt testade 9-12. Dessutom, spigg är vanliga modeller för studier av populationsgenetik / genomik 13,14, artbildning 15 beteende 1, endokrinologi 16, ekotoxikologi 17, immunologi 18 och parasitologi 19. Framtida studier i vart och ett av dessa områden kommer att gynnas av möjligheten att utföra funktionella genetiska manipulationer i spigg. Förutom att manipulera sina kodande sekvenser, kan rollerna av gener bedömas genom att studera deras cis -regulatory sekvenser och funktionellt ökar minskar eller eliminerar uttryck av genen kandidaten. Mikroinjektion och genmodifiering metoder spigg är väl etablerade 7,8,20 och ursprungligen utvecklats med hjälp av en meganuclease-medieradmetod 21 som först beskrevs i medaka 22. Den modifierade mikroinjektion metod som presenteras här har optimerats för både Tol2-medierad genmodifiering och nyutvecklade genomredigerings reagens inklusive Talens och CRISPRs.
Ändringar cis -regulatory element tros vara avgörande för morfologisk evolution, som cis -regulatory förändringar kan undvika de negativa pleiotropa konsekvenserna av kodning mutationer 23. Därför testar och jämför förmodade cis -regulatory sekvenser har blivit ett centralt mål för ett ökande antal evolutionära studier. Dessutom har de flesta varianter humana sjukdoms regulatoriska varianter 24,25, och modell ryggradsdjur system är i högsta grad behövs för att studera cis -regulatory elementet funktion och logik. Fisk som befrukta sina embryon externt i ett stort antal erbjuder kraftfulla ryggradsdjur system för att studera cis -Förordning. Den Tol2 transposon-system, i vilket utrikgn DNA som skall integreras i genomet flankeras av Tol2 transposas bindningsställen samt co-injiceras med Tol2 transposas mRNA, arbetar med hög verkningsgrad för att framgångsrikt integrera plasmiden konstruktioner i fiskgenom 26 - 28. Normalt är en potentiell förstärkare klonad uppströms av en basal promotor (såsom hsp70l 29) och fluorescerande reportergen såsom EGFP (enhanced green fluorescent protein) eller mCherry i en Tol2 ryggrad och injiceras med transposas-mRNA 26. Observation av uttryck av den fluorescerande reporter, antingen i injicerade embryon eller avkomma med stabilt integrerade transgener, ger information om Spatiotemporal regleringen av genuttryck som drivs av den förmodade förstärkare. I ytterligare experiment, kan validerade förstärkare användas för att driva vävnadsspecifik överuttryck av gener av intresse.
För analys av större cis -regulatory regioner, hög kvalitet stor insats GENOMic bibliotek med bakterie- artificiella kromosomer (BACS) har konstruerats för både marina och sötvattens spigg 30. Dessa BAC kan recombineered för att ersätta en gen med en fluorescerande reportergenen i samband med en stor (150 till 200 kb) genomregion 31. Den fluorescerande reporter uttrycks sedan i en spatiotemporal mönster som bestäms av regulatoriska sekvenser inom BAC. För studier i fisk kan Tol2 platser tillsättas till BAC att underlätta genomisk integration 32,33. I senare stadier av utveckling när in situ hybridisering är tekniskt utmanande, kan fluorescerande avläsning av BAC användas för att studera mönster av genuttryck, som har visats för Pigg benmorfogenetiskt protein 6 (BMP6) 20. Dessutom kan fluorescerande uttrycksmönster i en individ spåras över tiden, vilket inte kan uppnås med in situ-hybridisering. BAC kan också användas för att lägga till en additional kopia av en genomisk region för att öka dosen av en gen av intresse.
För studier av genfunktion, är genom att redigera en explosivt växande område som kan användas för att producera riktade förändringar genomsekvenser i en mängd olika organismer 34. Transkriptionsaktivator liknande effektor nukleaser (Talens) är modulära, sekvensspecifika nukleaser ursprungligen isolerade från växtpatogener som kan exakt konstruerad för att binda direkt till en genomisk sekvens av val och generera en dubbelsträng bryta 35,36. Klustrade regelbundet mellanrum korta palindromiska upprepningar (crispr) / CAS-system var ursprungligen hittades i bakterier och använda en guide-RNA och Cas9 proteinet för att generera ett avbrott i en mål-DNA-sekvens som är komplementär till guiden 37. Den efterföljande reparation av dubbelsträngbrott som skapas av både Talens och CRISPRs lämnar ofta bakom en liten insättning eller deletion, som kan störa funktionen av målsekvensen35-37. I spigg har Talens använts för att störa genuttryck genom att rikta en förstärkare 20, och båda Talens och CRISPRs har framgångsrikt producerat mutationer i kodande sekvenser (opublicerade data). En detaljerat protokoll för generering av CRISPRs för användning i zebrafisk kan användas som en riktlinje för att utveckla CRISPRs för sticklebacks 38.
Transgena och genom redigering experiment kräver införande av nukleinsyror i en nyligen befruktade en-cell embryo. Genom att införa transgenen eller genomet redigeringsverktyg tidigt i utvecklingen, är antalet genetiskt manipulerade dotterceller i embryot maximeras. Injicerade embryon sedan visuellt screenas för fluorescens eller molekylärt screenas för genom modifieringar. Om celler som bidrar till könscellinjen framgångsrikt målinriktad, kan transgenen eller mutation föras vidare till en undergrupp av avkomma, även när efter injektion letalitet är hög. De mosaik fisk kan utparade ellerintercrossed och deras avkomma screenas för att återställa muterade alleler eller ett stabilt integrerat transgen av intresse. Detta protokoll beskriver metoder för att införa transgener och genom redigering reagens i en cell pigg embryon och övervakning för framgångsrika iska förändringar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All fisk arbete godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of California-Berkeley (protokollnummer R330).
1. Förbered nukleinsyror för injektion
- Tol2 Plasmid genmodifiering (Anpassad från Fisher 26).
- Skär 10 ug transposas plasmid (PCS-TP) 39 med 10 U NotI i medföljande buffert under 1 timme vid 37 ° C för att linjärisera.
Obs: Material Transfer Agreements kan krävas för att uppnå Tol2 plasmider. - Extrahera den skurna plasmiden med en 25: 24: 1 blandning av fenol: kloroform: isoamylalkohol och etanol fällning med natriumacetat enligt standardprotokoll 40. Resuspendera plasmid i 50 | j, l RNas-fritt vatten.
Obs: fenol-kloroform bör användas i en huv och avfallet måste kasseras enligt institutionens riktlinjer. - Inrätta en Sp6 transkriptionsreaktion i enlighet med tillverkarens instruktioner.
- Använd en RNA-isolation kit för att rensa upp transkriptionsreaktion enligt tillverkarens instruktioner; resuspendera RNA i 50 | il RNas-fritt vatten.
- Ta en 1 pl alikvot av RNA. Värm till 65 ° C under 5 min för att denaturera sekundärstrukturer sedan omedelbart kyla på is. Frysa återstående transkriptionsreaktion vid -80 ° C.
- Köra RNA alikvot på en 1% agarosgel i 0,5x TAE (Tris-bas, Ättiksyra, Etylendiamintetraättiksyra) körningsbuffert med en RNA-storleksstandard i ett körfält. Den förväntade produkten är 2200 bp; kasta om> 5% av den totala RNA visas i ett cellprov mindre än 2200 bp, vilket tyder på omfattande nedbrytning (Figur 1).
- Kvantifiera RNA med användning av en spektrofotometer vid 260 nm. Späd till 350 ng / | il i RNas-fritt vatten och lagra en il alikvoter vid -80 ° C (bra under minst två år).
- Klon Tol2 reporterplasmid (exempelvis med användning av pT2HE 8 eller plasmider från Tol2 satsen 41) med cis- Reglerande element av intresse. I korthet, PCR-amplifiera en genomisk DNA-sekvens av intresse med primrar innehållande restriktionsställen som finns i plasmiden, smälta PCR-produkten och vektorn med enzymet (s), ligera insatsen in i vektorn, och omvandla resulterande plasmiden in i kompetenta E. coli 40. Isolera plasmid med ett kit som innehåller ett endotoxin sköljning enligt tillverkarens protokoll.
- Utföra en andra rening av Tol2 plasmiden med ett PCR-reningskit enligt tillverkarens protokoll. Eluera i 30 | j, l RNas-fritt vatten.
Obs: avkastningen från detta steg kan vara låg (ibland under 50% av den ingående plasmid). - Späd plasmid till ~ 125 ng / | il i RNas-fritt vatten.
- Skär 10 ug transposas plasmid (PCS-TP) 39 med 10 U NotI i medföljande buffert under 1 timme vid 37 ° C för att linjärisera.
Figur 1. transposas mRNA gel. Renat transkriptionsreaktion prokanalen (1 | il) upphettades till 65 ° C, kyldes på is, och kördes på en 1% agarosgel med 0,5x TAE rinnande buffert vid 100 V. Storleken på RNA-stege i kilobaser (kb) är indikerade till vänster . Fullängds transposas mRNA är en ljus band vid ~ 2,2 kb. En liten men acceptabel mängd nedbrutet eller ofullständig mRNA ses under 2,2 kb. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- BAC genmodifiering (Se Suster 32,33 för BAC Recombineering Techniques)
- Förbered BAC från E. coli med hjälp av BAC-reningskit enligt tillverkarens protokoll. Använda etanolutfällning för att utvinna DNA med en standard natriumacetat-etanol extraktion 40 och återsuspendera DNA vid ~ 250 ng / | il i RNas-fritt vatten.
- Förbered transposas mRNA som i avsnitt 1.1.
- Mutation Induktion med Talens (Se Cermak
- Använd webbaserad applikation för att utforma Talens för genen av intresse 42. Om det är möjligt, att designen Talens störa en restriktionsenzym snitt webbplats för att underlätta molekylär analys.
- Klon Talens och förbereda plasmider för transkription följande publicerade protokoll 35.
- Transkribera Talen mRNA med en Sp6 transkriptionsreaktion enligt tillverkarens anvisningar och städa upp mRNA som beskrivits för transposas i avsnitt 1.1.4. Kvantifiera med en spektrofotometer och späd till 200 ng / l i RNas fritt vatten. Kör Talen mRNA på en gel för att säkerställa att det är rätt storlek och inte bryts ned som beskrivs i steg 1.1.6.
- Utforma ett par av PCR-primrar för att amplifiera cirka 100-200 bp omger Talen målsekvensen med användning av en primer designverktyg och mål-DNA-sekvensen 43. Beställa det lämpliga restriktionsenzymet till testet för lesioner vid målstället baserat på steg 1.3.1.
- Design och förbereda CRISPRs och Cas9 mRNA enligt protokoll 38, och order lämplig verifierings primers och restriktionsenzymer som beskrivs i steg 1.3.4.
2. Förbered Injektions Reagens
- Använd Borosilikatglas kapillärer man förbereder nålar som beskrivs nedan.
Notera: dessa kapillärer är inte de vanliga kapillärer som används för zebrafisk mikroinjektion, och är gjorda av ett tjockare och starkare glas som är avgörande för att punktera den tuffa Pigg chorion.- Alltid bära nitril eller latexhandskar när man drar nålar, och tillåter inte nålar för att hudkontakt eller hudfett.
- Bestäm mikropipett dra parametrar empiriskt av ramptester efter mikropipett avdragare är tillverkarens anvisningar. Till exempel, med en låda filament framställdes följande parametrar avskräckaminerade att vara optimal (Heat = 515, Pull = 60, Velocity = 60, Delay = 85, tryck = 500). Dessa inställningar producera en nål som smalnar kraftigt vid ca 12 ° för ~ 2 mm och sedan en lång förlängning som smalnar till cirka 2 ° för ~ 6 mm (Figur 2).
Obs: De korrekta parametrar kommer att variera med avdragare och filament, och blint använder ett program utan att bestämma de parametrar som först genom ramptester kan permanent förstöra avdragare är filament, som är svårt och dyrt att ersätta. - Följ tillverkarens instruktioner för att dra åtminstone 4 mikropipett nålar från borosilikatglas med inställningarna som fastställts i 2.1.2.
- Förvara nålar vertikalt i kapillär förvaringsburk med spetsen vänd nedåt.
- Före injektion, placera kapillär förvaringsburk på is för att kyla nålar. Lägga till en bit av fuktig pappershandduk för att burken för att förhindra avdunstning gång nålarna är fyllda.
- Befrukta ägg (AllaStegen som utförs vid RT)
- Strip ägg koppling från gravid kvinna Pigg genom att försiktigt klämma magen och klappa i en främre till bakre riktning för att skjuta äggen ut genom kloaken och i en 35 x 10 mm 2 petriskål. Lägga en fuktig bit hushållspapper på ena sidan av petriskålen (vidrör inte ägg) för att skapa fuktkammare. Placera locket på petriskål så ägg stanna fuktig.
- Avliva manlig pigg i 0,025% tricaine-S buffrade med 0,1% natriumbikarbonat.
- Skära upp buken, ta testiklar och blöta i 250 pl Hanks lösning (se Wester 44 för full protokoll för Hanks lösning förberedelse).
- Gödsla högst 100 ägg med 50 ^ spermielösning och försiktigt rör om med pipettspetsen att säkerställa att alla ägg befruktas. Om kopplingen är> 100 ägg, gödsla halv av äggen senare för att se till att alla embryon är på en en-cellstadiet vid tiden för injektion. Ägg kan lämnas obefruktatvid RT under upp till en timme, och spermie allmänhet varar i 1-7 dagar vid 4 ° C i Hanks lösning.
- Håll embryon täckta med petriskål lock efter befruktning för att förhindra uttorkning. Låt 20-25 minuter för den första cellen att växa och svälla upp (förbereda injektionsmaterial under denna tid).
- Fyll en 150 mm x 15 mm petriskål med Pigg vatten. (För att göra Pigg vatten, först förbereda 10% natriumbikarbonat upplöst i avjoniserat vatten. Tillsätt sedan 3,5 g artificiellt havsvatten mix och 0,217 ml 10% natriumbikarbonat per 1 L avjoniserat vatten och rör om / skaka kraftigt för att lösa salt.)
- Förbered injektionslösningen (Medan Ägg är Gödning)
- Bereda injektionslösningen enligt tabell 1 och förvara på is.
Obs: koncentrationerna av vissa nukleinsyror har ökat från de som publicerats för zebrafisk på grund av den ökade volymen av spigg blastomere.
- Bereda injektionslösningen enligt tabell 1 och förvara på is.
| Reagens | Tol2 injektion | BAC injektion | Talen injektion | crispr injektion |
| Tol2 mRNA | 350 ng | 350 ng | - | - |
| DNA | 150-200 ng plasmid | 200-300 ng BAC | - | - |
| Talen mRNA | - | - | 200 ng vardera | - |
| Crispr guide-RNA | - | - | - | 200 ng |
| Cas9 mRNA | - | - | - | 400 ng |
| 0,5% fenolrött inDulbecco PBS | 0,5 ^ | 0,5 ^ | 0,5 ^ | 0,5 ^ | RNAse fritt vatten | till 5 | j, l | till 5 | j, l | till 5 | j, l | till 5 | j, l |
Tabell 1:. Injektions reagens bör alla blandningar framställas till en total volym på 5 pl och lagras på is.
- Fyll nålar (On Ice, Tillåt minst 10 min för nålar att fylla).
- Återfyllning minst tre nålar genom att pipettera 0,5 | il injektionslösning på den trubbiga övre änden av nålen medan nålar hänger vertikalt i kapillär förvaringsburk. Var noga med att nedgången stannar på toppen och inte droppa ner sidan och undvika bubblor.
- Efter den röda vätskan har mestadels dräneras till den spetsiga nålspetsen, lägga till ytterligare 0,5 ^ il till den trubbiga änden av nålen och låt den rinna av.
3. Förbered Injicera Rig och nål för mikroinjektion
Obs: Dessa steg cen vanligtvis göras efter befrukta äggen.
- Slå på genomlysning ljus för dissekera mikroskop och placera en ~ 13 cm x 13 cm glasplatta på mikroskop ljus bas med 15 cm gips sågklinga ovanpå glasskivan 7. Orientera sågen vinkelrät mot injektionsanordningen med fördjupning vända mot nålhållaren.
- Slå på lufttillförseln och säkerställa tryck är inställt på ~ 200 kPa från regulatorn.
- Vrid på kontrollboxen och justera inställningarna. Ställ tryck till ~ 150-175 kPa. Ställ insprutningstiden till 180 ms.
- Lossa nålhållaren sätter en fylld nål i hållaren tills ett motstånd av gummihållare kan kännas, och dra åt tills fingrarna.
- Justera nålen vinkeln till cirka 45 °.
- Använd mikromanipulator kontroller för att justera nålen så slutet är centrerad i synfältet. Zooma in ~ 40X förstoring och fokusera på spetsen av nålen, som inte bör röraglaset nedan.
- bryta försiktigt nålspetsen genom att greppa den med urmakare pincett. Helst inte bryter vinkelrätt, utan snarare på en ~ 60 ° vinkel. Bryta nära spetsen (ej mer än 2-3 pincett bredder bort från änden, fig 2).
Figur 2. Obrutna och brutna mikroinjektion nålar. Den övre nålen är obruten och spetsen på den undre nålen har brutits med pincett (pil). Nålar är fyllda med en lösning innehållande 0,05% fenolrött. Skalstreck = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Tryck på injektions fotpedalen flera gånger för att testa om nålen är trasig. Efter några kranar, bör små röda droppar börjar att komma ut ur than slutar. Om inte, försök att bryta nålen något högre.
- Om nålen har en luftbubbla, öka mottrycket enheten och tryck på pedalen flera gånger snabbt för att arbeta bubblan ut.
- Justera mottryck:
- Använda engångs överföringspipetten att placera några droppar pigg vatten på glasplattan.
- Sänk försiktigt nålen i vattnet.
- Öka mottrycket tills en svag ström av rosa vätska kommer ut ur nålen (indikerar positivt tryck).
Obs: Om det inte finns tillräckligt mottryck, kommer nålen upprätta cytoplasman genom kapillärverkan. Om det finns för mycket mottryck, kan injektionsvolymen oavsiktligt för stor. - Dra in nålen så långt som möjligt så att den inte kommer att skadas samtidigt förbereda embryona (se nedan).
- Alternativt justera mottrycket till en högre tryckinställning så att en konstant stark ström av vätska lämnar nålen whöna den är nedsänkt i vatten. Sedan trycker på fotpedalen för att injicera blir onödig; måste emellertid injektionen utföras snabbt för att undvika över injicering.
Obs: Försök inte denna teknik när först lära sig att injicera.
4. Mikroinjektion
- Cirka 25 minuter efter befruktning, använda två 10 l pipettspetsar för att ta bort 5-10 embryon från kopplingen och överföring till glasskivan.
- Fortfarande med användning av de pipettspetsar, försiktigt separera de embryon i individuella fördjupningar av sågklingan. Var försiktig att inte punktera embryon.
- Med hjälp av en överföringspipett med slutet avskurna så pigg embryon passar inuti, tillsätt tillräckligt Pigg vatten för att täcka embryon lämna vattnet på i 3-5 sekunder, sedan bort överflödigt vatten med pipett lämnar en liten mängd vatten beläggning varje embryo.
Notera: För mycket vatten kommer att orsaka de chorions att härda och bryta nålen, men en liten volym vatten som är nödvändigt för att lyfta lmorion bort från cellen och äggula (Figur 3A - B). - Från och med embryot längst bort, skjuter glasplatta och zooma in så att den första embryot fyller cirka 25% av synfältet.
- Sänk ner nålen i synfältet, använd sedan 10 pl pipettspetsen att försiktigt vrida embryot att identifiera blastomere, en kornig, svagt gul upphöjning av cytoplasman ovanpå äggulan (Figur 3B), och sedan rotera så att den blastomere är direkt vinkelrät mot änden av nålen (och samtidigt hålla embryot i fördjupningen på sågbladet, fig 3C).
Obs: gule dropparna kan röra sig som embryot roteras, så att inte använda dem som en referensram för placeringen av blastomere. - Sänk ner nålen i cytoplasman men inte driva igenom till den underliggande äggula. Applicera tryck långsamt och jämnt när piercing chorion att undvika att bryta nålen. Omnål krökar hårt, dra och försök igen i en något annan plats.
- Tryck på fotpedalen 3-4 gånger för att injicera så att en röd bolus med något diffusa kanter fyller ungefär ~ 1/8 diameter cytoplasman (se figur 3D).
- Undvika att erhålla en röd bolus med skarpa kanter som inte börjar att diffundera, vilket indikerar injektion i äggulan nedanför cytoplasman (Figur 3E).
- Om en ljus rosa-röd fläck diffunderar snabbt in nålen vidare att punktera blastomere.
- Om injektions bolus blir gul omedelbart, vrid embryot att säkerställa blastomere har valts ut och injicera igen (Figur 3F).
Figur 3. Utseende av spigg embryon före och efter injektion. Samtliga embryon hämtade från the perspektiv tittar ner genom mikroskop (med undantag för C och G). (A) Innan du lägger vatten, befruktade embryon har ett enhetligt utseende med oljedroppar flytande nära toppen av äggula. (B) Efter tillsats av vatten, chorion sväller, avslöjar en blastomere som sticker ut från äggula och är synlig i profil. (C) Rotation av embryot så att nålen går vinkelrätt mot chorion och blastomere. (C ') Lateral vy av en nål som har punkterat chorion med spetsen i cytoplasman. (D) Injektion i cytoplasman resulterar i en röd fläck med diffusa kanter som bleknar med tiden. (E) Injektion i äggulan underliggande cytoplasman resulterar i en röd fläck med definierade kanter. (F) Injektion i äggulan motsatt de cytoplasma resulterar i en pH-inducerad färgskiftning från rött till gult. (G) Lateralutsikt över injektionsresultat, med Xs över injektion sub-idealiska platser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Använda mikromanipulator kontroller för att dra in nålen, med användning av 10 | j, l pipettspetsen för att hålla ner embryot om den fastnar på nålen.
- Efter tillbakadragning av nålen skjuter glasskivan att anpassa nästa embryot med nålen.
- Efter injicering alla embryon, använder överföringspipett att tillsätta vatten till de embryon sedan samla dem i överföringspipetten och plats i 150 mm petriskål full av spigg vatten.
- Torka av glasskivan med en pappershandduk för att undvika att ackumulera för mycket vatten.
- Fördela färska embryon på sågen och upprepa steg 4,4 till 4,10.
- Håll ~ 10% av embryon som uninjected kontroller för att säkerställa att oinjicerade embryon utvecklas normalt och att använda som vild-typ kontroller för than molekylära analyser som beskrivs nedan.
5. Post Injection Care
- Inkubera embryon i petriskålar vid 18 ° C efter injektionen tills kläckning 10. Efter kläckning, bakre larver i akvarier som beskrivs 10.
- Häll försiktigt bort Pigg vatten en dag efter injektion och ersätta med färsk Pigg vatten. Ersätt med färskt Pigg vatten åtminstone varannan dag efter det.
- Kontrollera om döda eller missbildade embryon dagligen. Ta bort dessa embryon att förhindra förfall från att förorena vattnet.
6. Analys av Injection resultat
- För injektion av fluorescerande reportrar, övervaka embryon dagligen i ett mörklagt rum med en fluorescerande dissekera mikroskop med en GFP eller RFP filter (beroende på fluorescerande transgen). Spela anatomiska mönster av genuttryck med digitala fotografier och / eller skriftliga beskrivningar och sammanräkningen av antalet fiskar med olika Expressions domäner (fig 4 och 5).
Notera: sticklebacks har autofluorescerande, stellate pigmentceller som är synliga under GFP filter med början vid 4 dagar efter befruktning (dpf).- För att generera stabila linjer, spara embryon med detekterbar fluorescens och växa till vuxen ålder som beskrivits 10.
- Utparning injicerade vuxna fiskar till vildtyp fisk med hjälp av provrörsbefruktning i beskrivs i avsnitt 2.2 och skärm avkomma till fluorescens som beskrivs i steg 6,1 för att leta efter fluorescerande avkomma, vilket indikerar framgångsrik transgen transmission.
- Att visualisera fluorescens i kläckts, frisimmande larver, tillsätt 500 l 0,8% Tricaine till 150 mm petriskål för att bedöva fisk och vänta tills fisken sluta flytta till bilden. Skölj omedelbart flera gånger med färsk Pigg vatten efter observation och avbildning.
- Eventuellt, för att bevara fluorescens för ytterligare avbildning, avliva larver i0,025% (250 mg / L) Tricaine buffrad med 0,1% natriumbikarbonat och fastställa till 4 h i 4% paraformaldehyd i 1x Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid 4 ° C. Förvara i 1x PBS för upp till två veckor.
Obs: bakgrund auto-fluorescens ökar över tiden.
- Diagnostisk PCR / matsmältning genotypning för Mutation Induktion med CRISPRs eller Talens - bäst vid 2 dagar efter befruktningen.
- Använd en överföringspipett att placera 10 injicerade embryon (2 DPF, fortfarande i chorions) i de första 10 brunnar i en 12 brunnar PCR strip röret. Placera oinjicerad kontroll fisk under de senaste två brunnar.
- Avlägsna överskottsPigg vatten.
- Tillsätt 50 | il lyseringsbuffert (10 mM Tris pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,3% Tween-20, och 0,3% NP-40) till varje brunn.
- Placera lock på rör och inkubera vid 95 ° C under 20 min i en termocykler.
Obs! Äggula blir vit och seg efter kokningssteget. - Ta bort locken och använda en annan cleen 1000 l pipettspetsen att blöta embryot i varje rör.
Notera: Vit skräp kommer samlas på botten av röret. - Tillsätt 2,5 | il 10 mg / ml proteinas K till varje brunn.
- Locken igen och inkubera vid 55 ° C under 1 h för att smälta protein, följt av 95 ° C under 20 min för att inaktivera proteinas K. Förvara vid -20 ° C för att undvika mögeltillväxt.
- Utför PCR med hjälp av en high-fidelity-polymeras enligt tillverkarens instruktioner. Använd embryot lysat som DNA-mall.
Obs: Var noga med att ta bort vätska från toppen av röret för DNA-mall, undvika synliga chorion eller äggula skräp på botten av röret. - Blanda PCR-produkten i lika stor volym med ett restriktionsenzym huvudblandning innehållande 1x enzymspecifika buffert och 0,25 | il enzym per prov. spara alltid hälften av den oklippta PCR-produkten för att analysera på en gel för att bekräfta PCR-produkter är den förväntade storleken. Inkubera PCR blandas med enzym vid lämpliga villkor förrestriktionsenzymet.
Obs! Vissa enzymer kan kräva andra förhållanden av enzymbuffert till PCR-produkt; justera buffertkoncentrationen om uninjected kontrollerna inte visar fullständig uppslutning. - Efter digerering, för att köra produkterna på en 1% agarosgel bredvid en DNA-storlek stege bekräfta förväntade produktstorlekar.
Obs: Uncut band i injicerade embryon indikerar närvaron av molekylära lesioner (figur 6) och oinjicerade kontroller måste vara helt rötas för att tolka resultaten. - För att bekräfta lesioner, klippa ut oklippt band från agarosgeler och rena DNA med en gelextraheringskit. Använd Sanger-sekvensering, helst med hjälp av en sekvenseringsprimer internt till PCR-primers, för att bekräfta skador. I F 0 injicerade embryon, kommer en blandning av lesioner sannolikt vara närvarande, vilket gör att kvaliteten på Sanger läs att brytas ned nära målstället.
- För att producera en stabil linje, spara alla injicerade embryon från kopplingar som skärmen positivt för molekylära lesioner. Gro upp fisk, utparning, och sedan screena en delmängd av F 1 embryon för molekylära skador som beskrivs i steg 6.2.1 till 6.2.11. Om heterozygota bärare identifieras, växa återstående F 1 embryon till vuxenlivet och identifiera heterozygota personer som använder DNA som extraherats från en stjärtfenan klipp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För reportergen transgener som har förstärkaraktivitet, kommer lyckad injektion resultera i specifik, cellulär expression av transgenen (Figur 4A, 4C). Injicerade fisk kan sedan utparade att producera stabila linjer (Exempel på en BAC stabil linje visas i figur 4B). Injicera DNA i pigg embryon resulterar typiskt i mycket högre dödlighet än RNA ensamt. Det är typiskt att se upp till 50% (ibland mer) dödlighet eller missbildning (se figur 4D - F, 4I) efter injektion Tol2 reporter konstruktioner (liknande den tidigare beskrivna meganuclease metod 21). Men varierar resultaten allmänt baseras på den specifika konstruktionen, embryot morfologi och skicklighetsnivå. För en aktiv förstärkare, 40-50% av embryon i allmänhet kommer att visa vävnadsspecifik transgen expression, t ex i de median och bröstfenor (Figure 5). Graden av bakgrund och icke-specifik fluorescens (Figur 4G - I) varierar kraftigt baserat på den använda promotorn; zebrafisk hsp70l promotorn tenderar att vara läckande, speciellt i muskler och nervvävnad, och BAC tenderar att ha hög bakgrunds expression i gulan (liknande figur 4G). Karp beta aktin 41 promotorn är mindre läckande men driver också betydligt svagare GFP uttryck. Överföring av Tol2 plasmid transgener kan vara hög, med upp till 100% av GFP + F 0 fisk producera transgena avkommor (tabell 2). Emellertid den procentuella avkommor som bär transgenen varierar inom vida gränser, från <1% till 72% (tabell 2). Sparar bara GFP + injicerade embryon ökar generellt överföringseffektiviteten. BAC tenderar att ha mycket lägre genmodifiering priser, med endast upp till 10% av F 0 injicerade Pigg embryon visar fluorescens i förväntade vävnader. transmissionshastighet av BAC är lägre än den för plasmidkonstruktioner, med endast upp till 14% av det kontrollerade pigg sändning av BAC (tabell 2), som är likadan som den rapporterade överföringshastighet på 15% i zebrafisk 32.
I motsats till den relativt låga effektiviteten hos BAC transgenes, typiskt 70-100% av det kontrollerade fisk som injicerats med Talens har mosaik lesioner (i n = 10 injicerade kopplingar som screenades för lesioner). Detta antal kan vara lägre med en mindre effektiv talen par, och kan variera med injektionskvalitet. Figur 6 visar ett PCR / restriktionsklyvning 10 embryon från en enda koppling injiceras med Talens rikta en PvuII skära plats inom Tfap2a. En oklippt amplikon i var och en av de injicerade embryon (spår 1-10) indikerar att en del av cellerna i varje embryo bära lesioner vid målstället, även om varje embryot är höggradigt mosaik med en betydande vildtyp cut bandet. the amplikon från oinjicerade embryon i banorna 11-12 är fullt digererades med PvuII. Talen-inducerade mutationer kan lätt överföras till nästa generation. Med två olika talen sätter, 50% och 90% av screenade F 0 s överförda skador till avkomma, med 20-90% av avkomman bär skador i fasta kopplingar (tabell 3). Medan crispr / Cas9 effektivitet inte har optimerats i spigg, med en crispr guide inriktning Pitx2, en av tre injicerade embryon hade lesioner baserat på Sanger-sekvensering av en PCR-produkt av crispr målet (den oklippta bandet sekvenserades efter restriktionsklyvning, figur 7). Förlusten av sekvenskvalitet på den förväntade snittet webbplatsen visar en blandning av molekylära skador förekommer. Fin klippning vuxna F 0 fisk och screening för skador med hjälp av en PCR och restriktionsklyvning analys fann 10/22 fisk med somatiska skador i fenan. En representativ delmängd av dessa djur visas i Figur 8 </ Strong>; individuell # 3 har en hög andel av DNA med lesioner, medan individuell # 2 har en låg procentandel av DNA med lesioner.
Figur 4. Exempel på injicerade embryon. (A) mosaik embryo injiceras med en förstärkare som driver GFP uttryck i bröst (asterisk) och median fenor (pilspets) vid 5 dagar efter befruktningen (DPF). Skalstreck = 500 | j, m. (B) stabil linje av en reporter BAC som driver GFP uttryck i embryonala hjärtat på 4 dpf. (C) Mosaik embryo injiceras med en Col2a1a förstärkare som driver mCherry uttryck i notochord på 4 dpf. Den Col2 a1a-förstärkaren klonades från pigg DNA med primrar 5'-CGCTCCTTGAGGGTTTGAGCTG-3 'och 5'-ATACTGTGCTCATTTCGGCCGT-3', som förstärker den konserverade ortologa enhancer rapporteras i Dale och Topczewski2011 45. (D) Exempel på en normalt utveckla injicerat embryo. (E - F) Exempel på missbildade embryon med injektions trauma; E saknas det vänstra ögat och F har nekrotisk vävnad längs den högra sidan (pilhuvuden). (G) Exempel på diffusa GFP uttryck i äggula, sannolikt till följd av injektion i äggulan snarare än blastomere. (H) Exempel på icke-specifik uttryck av GFP i epidermis (pilspets). (I) Bright, ospecifik, granulär GFP uttryck. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Effektivitet av reporterkonstruktion injektion. Tio kopplingar injicerades med en 190 bp Pigg BMP6 förstärkare Konstrten som driver bröstfenan och median fin uttryck vid 5 dpf 20. Från varje koppling, var åtminstone 20 embryon gjorde för att ha vävnadsspecifik (bröst och / eller median fin) och / eller icke-specifik (alla andra vävnader) GFP uttryck. Procentandelen av alla överlevande injicerade embryon som har icke-specifik och vävnadsspecifikt uttryck visas som en boxplot. Horisontella linjerna anger den första kvartilen, medianen och tredje kvartilen; whiskers omfatta nollpunkt inom 1,5 IQR (kvartilavståndet) av den första och tredje kvartilen. Data är anpassade från Erickson et al. 2015. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. PCR och restriktionsklyvning för att screena för Talen-inducerade skador. En Talen par inriktning Tfap2a Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7. Sanger-sekvensering från mosaik F 0 crispr / Cas9 injicerade embryo. En crispr guide-RNA (5'-GTGGACCAACCTCACGG-3 ') mot Pitx2 (visas överst) samin injicerades med Cas9 mRNA (transkriberas från pCS2-nCas9n plasmid såsom beskrivits 38) och embryon screenades för lesioner med användning av ett restriktionsenzymanalys. Den oklippta bandet var gelén extraheras och sekvenseras genom Sånger-sekvensering. Sekvensen kvaliteten försämras vid det förutsagda klyvningsstället (pil nedan) på grund av mosaik blandning av skador som förekommer i den injicerade embryot. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8. Analys av CRISPR F 0 caudal fin klipp. DNA framställdes från fin klipp från F 0 ungdomar som kommer från embryon som injicerats med CRISPRs mot Pitx2. Den crispr / Cas9 mål amplifierades med primrar 5'-CTCGGATGACCCTTCAAAAA-3 'och 5'-GGCCCAAATTACCCACATTT-3', och produkten digererades med EcoRI. Fyra personer visas; en oklippt PCR-produkten är till vänster och diger PCR-produkten är på rätt för varje numrerad individ. Produkten av storleken på det oskurna bandet (~ 230 bp) i det digere körfält indikerar närvaron av en lesion. Individer 2, 3 och 4 visar alla tecken på en molekylär skada, indikerade med asterisker, med varierande mosaicism mellan individer. Relevanta stegstorlekar anges till vänster. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Konstruera | GFP avkomma / total F0 skärmad fisk (%) | % F1-avkomman positiv | Notera |
| BAC A | 6/46 (13%) | 4-19% | |
| BAC B | 1/41 (2%) | 4% | |
| BAC C | 5/42 (12%) | 3-40% | |
| BAC D | 22/03 (14%) | 5-15% | |
| plasmid A | 2/38 (5%) | 2-5% | alla F0 embryon screen, inte bara GFP + |
| plasmid B | 16/03 (19%) | <1-8% | alla F0 embryon screen, inte bara GFP + |
| plasmid C | 1/11 (9%) | 10% | |
| plasmid D | 11/02 (18%) | 1-45% | Plasmiden D injiceras i2 genetiska bakgrunder |
| plasmid D | 05/05 (100%) | 16-72% | |
| plasmid E | 2/3 (67%) | 2-22% | |
| plasmid F | 06/02 (33%) | <1-65% | |
| plasmiden G | 3/8 (38%) | 2-56% | |
| plasmid H | 18/03 (17%) | inte gjorde | |
| plasmid I | 24/05 (21%) | inte gjorde |
Tabell 2:. Transgene överföringsverkningsgrader för BAC och enhancer konstruktioner F 0 injicerade embryon höjdes till vuxen ålder och sedan utparade till vildtyp fisk och F 1 avkomma gjorde för GFP fluorescens. Antalet F 0 personer som överförs transgenen är exprEssed procent av alla skärmad F 0 fisk. Utbudet av procentandelar av F 1 avkomma som bär transgenen visas också för de kopplingar som hade GFP positiv fisk.
| Talen | % F0 överförande lesioner | % F1-avkomman positiv |
| en | 10/09 (90%) | 20-90% |
| B | 08/04 (50%) | 20-72% |
Tabell 3:. Överföringseffektiviteten för två Talen paren F 0 injicerade embryon höjdes till vuxen ålder och sedan utparade med vildtyp-fisk och F en avkomman screenas för Talen lesioner. Procentandelen injicerade personer sänder lesioner visas, liksom de olika procentsatser av avkomma med lesioner i dessa kopplingaratt överförda skador. Talen En riktad en BMP6 förstärkare 20, Talen B riktade Tfap2a (opublicerad).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Injicera en cell pigg embryon för genmodifiering eller genom redigering presenterar tre viktigaste utmaningarna. Först, i förhållande till zebrafisk embryon är spigg embryonala chorion tuff och kommer ofta bryta nålar. Detta problem kan delvis övervinnas genom användning av tjockare och starkare glasmikropipetter och injektions vinkelrät mot chorion (se protokoll, figur 2). Att se till att så lite vatten som möjligt tillsätts till embryona (bara tillräckligt för att orsaka chorion att svälla och lyfta bort från cellen) hjälper till att minska chorion hårdhet. Chorion hårdnar med tiden, så att arbeta snabbt efter att ha fuktat embryona är viktig. Hålla embryona i en fuktkammare före injektion så att de inte torkar ut är också kritisk. Vissa kopplingar och även enskilda embryon har helt enkelt mycket tjockare och hårdare chorions; ibland går vidare till nästa embryot eller försöker med en ny koppling är den enklaste lösningen. Det är mycket lättare att hoppa över en d ifficult embryo än att ersätta en skadad nål. Med backup nålar redo gör injektioner för att fortsätta i fråga om nålen går. Vid injektion BAC, är det vanligt att nålen att täppa. Nålen kan unclogged genom att försiktigt skrapa eller åter bryta spetsen med pincett, eller genom att använda konstant lufttryck omkopplaren att rensa täppa.
För det andra, att identifiera den första cellen i embryot är utmanande; det är ofta ganska tillplattad och svårt för nybörjare att se, och är särskilt osynlig när man tittar direkt på det. Ofta blastomere kan endast ses som en något förhöjd bula i profil. Därför är det bäst att identifiera cellen i profil (figur 3B) och sedan rotera försiktigt embryot framåt och åt sidan så cellen kommer att möta i slutet av den vinklade nålen (även om cellen ofta kommer att vara osynlig från denna vinkel, den mörkare färg på blastomere i fig 3 har överdrivits för tydlighets skull).
e_content "> För det tredje, targeting cytoplasman är också svårt, särskilt om den första cellen är särskilt platt. Sikta för fylligaste delen av blastomere (vanligen mitten) förbättrar chansen att injicera in i cytoplasman. Medan insprutning i äggulan nära cytoplasman framgångsrikt kan producera transgen fisk, tycks effektiviteten ökas och dödlighet minskade när cytoplasman är riktad med en enda nålstick. Ibland kommer individuella kopplingar har särskilt tunna blastomeres, så att undvika äggulan är nästan omöjligt. väntar längre än 25 min att börja injektioner kan hjälpa (vissa kopplingar bildar inte en full storlek blastomere tills ~ 45 min efter befruktning), men om blastomerer aldrig öka i storlek, är det ofta lättare att få en ny koppling av ägg än att försöka att injicera tillplattade celler .Överdriven injektioner dödlighet efter kan uppstå av flera skäl. Trubbiga nålar och / eller för stor en nål hål storlek kan orsaka too mycket skada på cellen och / eller orsaka cytoplasman läcker ut. Vissa DNA-konstruktioner verkar vara särskilt dödlig; sänka koncentrationen av DNA kan förbättra överlevnaden men lägre transgenes hastigheter. Sanering plasmider först med en Midiprep kit som innehåller ett endotoxin sköljning följt av en andra PCR rensning kit minskar konstruera toxicitet. Slutligen kan genom redigering producera en förlust av funktion mutation som är dödlig för att utveckla embryon. Minska koncentrationen av den crispr eller Talen mRNA kan öka mosaicism av embryot för att förhindra dödlighet, men kan minska muterad allel återvinningseffektivitet.
En tidigare publicerade protokoll för att generera transgena spigg med hjälp av en meganuclease metod 21 rapporterade en transgen könsceller överföringshastighet 4-7% från F 0 grundare fisk. Den Tol2 metod som rapporterats här resulterade i upp till en transgen könsceller överföringshastighet 72% från F 0 grundare fisk (som anger flera genom integrejoner). Den tidigare studie med en meganuclease metod rapporterade 40% av injicerade embryon som visar specifik GFP uttryck, liknande den som redovisas här. Således medan likartade frekvenser av transgena F 0 grundare observeras för transgen fisk som genereras av både meganuclease och Tol2 metoder visas könsceller överföringshastigheten mycket högre för Tol2 förmedlade transgena.
Som genom redigering teknik fortsätter att avancera, kommer ännu mer specifika genetiska manipulationer blir möjligt spigg och andra fiskarter. Till exempel kommer riktade reparation 46 och homolog rekombination tillåter allelen swappar mellan havs- och sötvattenspigg genom, och modifierade CRISPRs kan användas för att specifikt aktivera eller inhibera genuttryck 47. Dessa spännande teknik för genomet redigering och analys kommer att leda till nya insikter om den genetiska grunden för många intressanta morfologiska, fysiologiska och beteendemässiga fenotyper i sticklebacks och andra fiskarter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats delvis av NIH R01 # DE021475 (CTM), en NIH Predoctoral Training Grant 5T32GM007127 (PAE), och en NSF Graduate Research Fellowship (NAE). Vi tackar Kevin Schwalbach för att utföra BAC recombineering och injektioner, Nick Donde för att generera crispr Sanger sekvensdata och Katherine Lipari för hjälp feedback på injektionsprotokollet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope with transillumination | Leica | S6e/ KL300 LED | |
| Manual micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | Marzhauser M33 Micromanipulator |
| Pressure Injecion system | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
| Micropipette holder kit | Applied Scientific Instrumentation | MPIP | |
| Magnetic base holder | Applied Scientific Instrumentation | Magnetic base | |
| Foot switch | Applied Scientific Instrumentation | FSW | |
| Iron plate (magnetic base) | Narishige | IP | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Disposable transfer pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| 0.5% phenol red in DPBS | Sigma | P0290 | injection tracer |
| #5 forceps, biologie dumoxel | Fine Science Tools | 11252-30 | for needle breaking |
| Micropipette Storage Jar | World Precision Instruments | E210 | holds needles |
| 6", 6 teeth per inch plaster drywall saw | Lenox | 20571 (S636RP) | hold eggs for injection |
| 13 cm x 13 cm glass plate | any hardware store | - | |
| Borosilicate glass capillaries, 1.0 mm OD/0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100-F4 | *harder glass than zebrafish injection capillaries |
| 150 x 15mm Petri dish | Fisher | FB0875714 | raise stickleback embryos |
| 35 mm x 10 mm Petri dish | Fisher | 08-757-100A | store eggs pre-injection |
| Instant Ocean Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| Tricaine methanesulfonate/MS-222 | Western Chemical Inc | MS222 | fish anaesthesia/euthanasia |
| Sp6 transcription kit | Ambion | AM1340 | For transcription of TALENs and transposase mRNA |
| RNeasy cleanup kit | Qiagen | 74104 | purify transposase or TALEN RNA |
| QiaQuick PCR cleanup kit | Qiagen | 28104 | clean up plasmids for injection |
| Proteinase K 20 mg/ml | Ambion | AM2546 | for DNA preparation |
| Nucleobond BAC 100 kit | Clontech | 740579 | for BAC DNA preparation |
| NotI | NEB | R0189L | |
| Phusion polymerase | Fisher | F-530L | |
| Qiagen PlasmidPlus Midi kit | Qiagen | 12943 | contains endotoxin rinse buffer |
| QIAQuick Gel Extraction | Qiagen | 28704 | for sequencing induced mutations |
| Phenol:chloroform:Isoamyl alcohol | Sigma | P2069-100ML | |
| Sodium acetate | Sigma | S2889-250G | |
| Ethanol (molecular biology grade) | Sigma | E7023-500ML | |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| 50x Tris-acetate-EDTA buffer | ThermoFisher | B49 | |
| 0.5-10 Kb RNA ladder | ThermoFisher | 15623-200 | |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-500G | |
| 10x PBS | ThermoFisher | 70011-044 | |
| 1 kb Plus DNA Ladder | ThermoFisher | 10787-018 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9541-500G | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266-100G | |
| NP-40 | ThermoFisher | 28324 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379-500ML | |
| Tris pH 8.3 | Teknova | T1083 | |
| 12-strip PCR tube | Thermo Scientific | AB-1113 |
References
- Bell, M. A., Foster, S. A. The Evolutionary Biology of the Threespine Stickleback. , Oxford University Press. (1994).
- Jones, F. C., et al. The genomic basis of adaptive evolution in threespine sticklebacks. Nature. 484 (7392), 55-61 (2012).
- Glazer, A. M., Killingbeck, E. E., Mitros, T., Rokhsar, D. S., Miller, C. T. Genome assembly improvement and mapping convergently evolved skeletal traits in sticklebacks with Genotyping-by-Sequencing. G3. 5 (7), 1463-1472 (2015).
- Miller, C. T., et al. Modular skeletal evolution in sticklebacks is controlled by additive and clustered quantitative trait Loci. Genetics. 197 (1), 405-420 (2014).
- Shapiro, M. D., et al. Genetic and developmental basis of evolutionary pelvic reduction in threespine sticklebacks. Nature. 428 (6984), 717-723 (2004).
- Colosimo, P. F., et al. Widespread parallel evolution in sticklebacks by repeated fixation of Ectodysplasin alleles. Science. 307 (5717), 1928-1933 (2005).
- Chan, Y. F., et al. Adaptive evolution of pelvic reduction in sticklebacks by recurrent deletion of a Pitx1 enhancer. Science. 327 (5963), 302-305 (2010).
- O'Brown, N. M., Summers, B. R., Jones, F. C., Brady, S. D., Kingsley, D. M. A recurrent regulatory change underlying altered expression and Wnt response of the stickleback armor plates gene EDA. eLife. , e05290 (2015).
- Cleves, P. A., et al. Evolved tooth gain in sticklebacks is associated with a cis-regulatory allele of Bmp6. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (38), 13912-13917 (2014).
- Erickson, P. A., Glazer, A. M., Cleves, P. A., Smith, A. S., Miller, C. T. Two developmentally temporal quantitative trait loci underlie convergent evolution of increased branchial bone length in sticklebacks. Proc. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 281 (1788), 20140822 (2014).
- Glazer, A. M., Cleves, P. A., Erickson, P. A., Lam, A. Y., Miller, C. T. Parallel developmental genetic features underlie stickleback gill raker evolution. EvoDevo. 5 (1), (2014).
- Ellis, N. A., et al. Distinct developmental and genetic mechanisms underlie convergently evolved tooth gain in sticklebacks. Development. 142, 2442-2451 (2015).
- Hohenlohe, P. A., Bassham, S., Currey, M., Cresko, W. A. Extensive linkage disequilibrium and parallel adaptive divergence across threespine stickleback genomes. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 367 (1587), 395-408 (2012).
- Hohenlohe, P. A., et al. Population genomics of parallel adaptation in threespine stickleback using sequenced RAD tags. PLoS Genet. 6 (2), e1000862 (2010).
- McKinnon, J. S., Rundle, H. D. Speciation in nature: the threespine stickleback model systems. Trends Ecol. Evol. 17 (10), 480-488 (2002).
- Shao, Y. T., et al. Androgen feedback effects on LH and FSH, and photoperiodic control of reproduction in male three-spined sticklebacks, Gasterosteus aculeatus. Gen. Comp. Endocrinol. 182, 16-23 (2013).
- Katsiadaki, I., et al. Three-spined stickleback: an emerging model in environmental endocrine disruption. Environ. Sci. Int. J. Environ. Physiol. Toxicol. 14 (5), 263-283 (2007).
- Lenz, T. L., Eizaguirre, C., Rotter, B., Kalbe, M., Milinski, M. Exploring local immunological adaptation of two stickleback ecotypes by experimental infection and transcriptome-wide digital gene expression analysis. Mol. Ecol. 22 (3), 774-786 (2013).
- Barber, I. Sticklebacks as model hosts in ecological and evolutionary parasitology. Trends Parasitol. 29 (11), 556-566 (2013).
- Erickson, P. A., et al. A 190 base pair, TGF-β responsive tooth and fin enhancer is required for stickleback Bmp6 expression. Dev. Biol. 401 (2), 310-323 (2015).
- Hosemann, K. E., Colosimo, P. F., Summers, B. R., Kingsley, D. M. A simple and efficient microinjection protocol for making transgenic sticklebacks. Behaviour. 141 (11/12), 1345-1355 (2004).
- Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech. Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
- Carroll, S. B. Evo-Devo and an expanding evolutionary synthesis: a genetic theory of morphological evolution. Cell. 134 (1), 25-36 (2008).
- Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
- Hindorff, L. A., et al. Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (23), 9362-9367 (2009).
- Fisher, S., et al. Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish. Nat. Protoc. 1 (3), 1297-1305 (2006).
- Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (21), 11403-11408 (2000).
- Kikuta, H., Kawakami, K. Transient and stable transgenesis using Tol2 transposon vectors. Methods in Moleculario Biology: Zebrafish. , 69-84 (2009).
- Halloran, M. C., et al. Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish. Dev. Camb. Engl. 127 (9), 1953-1960 (2000).
- Kingsley, D. M., et al. New genomic tools for molecular studies of evolutionary change in threespine sticklebacks. Behaviour. 141 (11/12), 1331-1344 (2004).
- Mortlock, D. P., Guenther, C., Kingsley, D. M. A general approach for identifying distant regulatory elements applied to the Gdf6 gene. Genome Res. 13 (9), 2069-2081 (2003).
- Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nat. Protoc. 6 (12), 1998-2021 (2011).
- Suster, M. L., Sumiyama, K., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish and mice. BMC Genomics. 10 (1), 477 (2009).
- Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat. Rev. Genet. 15 (5), 321-334 (2014).
- Cermak, T., et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res. 39 (17), (2011).
- Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat. Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Talbot, J. C., Amacher, S. L. A streamlined CRISPR pipeline to reliably generate zebrafish frameshifting alleles. Zebrafish. 11 (6), 583-585 (2014).
- Kawakami, K., et al. A Transposon-Mediated Gene Trap Approach Identifies Developmentally Regulated Genes in Zebrafish. Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2012).
- Villefranc, J. A., Amigo, J., Lawson, N. D. Gateway compatible vectors for analysis of gene function in the zebrafish. Dev. Dyn. 236 (11), 3077-3087 (2007).
- Doyle, E. L., et al. TAL Effector-Nucleotide Targeter (TALE-NT) 2.0: tools for TAL effector design and target prediction. Nucleic Acids Res. 40 (W1), W117-W122 (2012).
- Untergasser, A., et al. Primer3-new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 40 (15), e115 (2012).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio) . , 5th Edition, University of Oregon. Press: Eugene, OR. (2007).
- Dale, R. M., Topczewski, J. Identification of an evolutionarily conserved regulatory element of the zebrafish col2a1a. Dev. Biol. 357 (2), 518-531 (2011).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of Gene expression. Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).
