En este artículo se describe un protocolo para la visualización de las placas amiloides Aß en modelos de ratón de la enfermedad de Alzheimer utilizando metoxi-X04, que cruza la barrera sangre-cerebro y selectivamente se une a ß-plisadas las hojas que se encuentran en centros densos placas de Aß. Permite pre-selección de secciones de tejido que contiene de placa antes de la inmunotinción y el procesamiento para microscopía electrónica.
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Artículo de método
Correlativa Microscopia óptica y electrónica para estudiar las interacciones microgliales con placas de beta-amiloide
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Resumen
Resumen
Se proporciona un protocolo detallado para identificar amiloide placas Aß en secciones de cerebro de modelos de ratón de la enfermedad de Alzheimer antes de pre-incrustación de la inmunotinción (específicamente para ionizado molécula de unión a calcio adaptador 1 (Iba1), una proteína de unión de calcio expresada por microglia) y el procesamiento de tejido para microscopía electrónica (EM). Metoxi-X04 es un colorante fluorescente que atraviesa la barrera hematoencefálica y selectivamente se une a las hojas plegadas beta que se encuentran en centros densos placas de Aß. La inyección de los animales con metoxi-X04 antes del sacrificio y la fijación del cerebro permite la preselección y selección de las secciones del cerebro que contiene de placa para su posterior procesamiento con manipulaciones que consumen mucho tiempo. Esto es particularmente útil en el estudio de la patología AD temprano dentro de las regiones específicas del cerebro o capas que pueden contener muy pocas placas, presentes en sólo una pequeña fracción de las secciones. procesamiento post-mortem de las secciones de tejido con Rojo Congo, tioflavina S, y ThioflAvin T (o incluso con metoxi-X04) puede etiquetar láminas beta plegadas, pero requiere una amplia compensación con etanol para eliminar el exceso de colorante y estos procedimientos son incompatibles con la conservación ultraestructural. También sería ineficiente para llevar a cabo el etiquetado de Aß (y otros marcadores celulares como Iba1) en todas las secciones del cerebro de las regiones de interés, sólo para dar una pequeña fracción que contiene placas de Aß en el lugar correcto. Es importante destacar que las placas de Aß son todavía visibles después de la elaboración de tejidos para EM, lo que permite una identificación precisa de las zonas (generalmente hasta unos pocos milímetros cuadrados) para examinar con el microscopio electrónico.
Introducción
Amiloide la formación de placas de Aß es la principal característica distintiva neuropatológico de la enfermedad de Alzheimer (AD). Sin embargo el aumento de la evidencia sugiere importantes funciones del sistema inmune en 1,2 progresión de la enfermedad. En particular, los nuevos datos de los estudios preclínicos y clínicos establecidos disfunción inmune como principal impulsor y colaborador de patología de la EA. Con estos resultados, las células inmunes central y periférico han surgido como dianas terapéuticas prometedoras para AD 3. El siguiente protocolo combina la luz y microscopía electrónica (EM) para generar nuevos conocimientos sobre l....
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Protocolo
Nota: Todos los experimentos fueron aprobados y realizados bajo las directrices del comité de ética animal institucional, de conformidad con el Consejo Canadiense sobre el manejo de estos animales como administrado por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad Laval. Se utilizaron ratones macho APP-PS1 entre 4 y 21 meses de edad. Estos animales se mantuvieron en un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas a 22 - 25 ° C, con acceso libre a comida y agua.
1. Metoxi-X04 Preparación de la solución
- Preparar una solución de 5 mg / ml de metoxi-X04 9 disolviendo metoxi-X04 en una solución que contiene 10% de sulfóxido de....
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Resultados
Esta sección ilustra los resultados que se pueden obtener en diferentes pasos críticos del protocolo. En particular, los resultados muestran ejemplos de las secciones del cerebro que contienen metoxi-X04 placas teñidas en la región específica y capas de interés: el hipocampo CA1, radiatum estrato, y lacunosum-moleculare. Las placas y la organización regional / laminar del hipocampo se visualizan sucesivamente usando una combinación de UV y filtros de campo claro (Figura 1).
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Discusión
Este protocolo explica un enfoque correlativa para dirigir centros densos placas Aß con EM. Metoxi-X04 en vivo por inyección permite una rápida selección de las secciones del cerebro que contienen placas de Aß en determinadas regiones y capas de interés, por ejemplo, el hipocampo CA1, radiatum estrato, y lacunosum-moleculare. En el presente ejemplo, metoxi-X04 selección previa se combinó con pre-incrustación de la inmunotinción para Iba1 para estudiar cómo los diferentes fenotipos microgliales interactúan con l.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a la Dra. Sachiko Sato y a Julie-Christine Lévesque de la Plataforma de Bioimagen del Centro de Investigación del CHU de Québec por su asistencia técnica. Las subvenciones del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC) RGPIN-2014-05308, la Fundación de Investigación Banting y la Fundación Benéfica del Rito Escocés de Canadá a M.E.T apoyaron este trabajo.
H.E.H. es beneficiario de una beca del Ministerio de Educación y Educación Superior libanés, y K.B. de la Facultad de Medicina de la Université Laval.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Methoxy-X04 | Tocris Bioscience | 4920 | 10 mg sustrato por comprimido |
| Propilenglicol | Sigma Aldrich | W294004 | |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Fisher BioReagents | BP231-1 | Precaución: tóxico |
| Cloruro de sodio NaCl | Sigma | S9625 | |
| Fosfato de sodio monobásico monohidratado | Sigma | S9638 | |
| Fosfato de sodio dibásico | Sigma | S0876 | |
| Clorhidrato de Tris | Fisher BioReagents | BP153500 | |
| Acroleína | Sigma 110221 | Precaución: | |
| Microscopía electrónica | granular con paraformaldehído | 19210 | Precaución: Papel |
| filtro | Fisher | 09-790-14F | |
| Bomba peristáltica con tubo | ColeParmer | cp.78023-00 | |
| Excel Juego de recolección de sangre alada Agujas 25 G | Becton Dickinson 367341 | ||
| Pinzas extrafinas | F.S.T | 11152-10 Forma de | la punta: curvada |
| Tijeras | F.S.T | 14090-09 Forma de | la punta: recta |
| Hartman Hemostats | F.S.T | 13003-10 Forma de | la punta: curvada |
| Tijeras quirúrgicas | F.S.T | 14004-16 Forma de | la punta: |
| recta Tijeras de microdisección | almacén quirúrgico ROBOZ | 5818 | |
| Viales de centelleo de vidrio | Fisher Scientific | 74515-20 | |
| Microtomo de cuchilla vibratoria Leica VT1000 S | Leica Biosystems | ||
| Cuchillas de vibratomo | Microscopía electrónica Sciences | 71990 | |
| Portaobjetos de microscopio | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos | Fisher Scientific | 353047 | |
| Etilenglicol | BioReactivos Fisher | BP230-4 | |
| Glicerol | BioReactivos | Fisher BP229-4 | |
| Peróxido de hidrógeno, 30% | J.T.BAKER | cat: 2186-01 | |
| Borohidruro de sodio | Sigma | 480886 | |
| Tris HCl | Fisher | BP153-500ML | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Sigma Aldrich | F1051 | |
| Albúmina sérica bovina (BSA), fracción V | Thomas Scientific | C001H24 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Anti IBA1, Conejo | WAKO | 019-19741 | |
| Cabra Anti-Conejo IgG | Jackson Immunoresearch | 111066046 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit (Estándar) | Vector Labs | PK-6100 | |
| 3.3'-Diaminobencidina tetra-clorhidrato (DAB) | Sigma | D5905-50TAB | Precaución: |
| tóxico Tetróxido de osmio, solución al 4% | Ciencias de la Microscopía Electrónica | 19150 | Precaución: |
| Durcupan&trade tóxico; ACM monocomponente A | Sigma | 44611 | Resina Precaución: Tóxico |
| Durcupan™ ACM monocomponente B | Sigma | 44612 | Endurecedor Precaución: |
| Durcupan&trade tóxico; ACM monocomponente C | Sigma | 44613 | Plastificante Precaución: Tóxico |
| Durcupan™ ACM monocomponente D | Sigma | 44614 | Accelerator Precaución: Etanol tóxico |
| LesAlcoolsdeComerce | 151-01-15N | ||
| Óxido de propileno | Sigma | 110205 | Precaución: corrosivo |
| Platos de pesaje de aluminio | Ciencias de la microscopía electrónica 70048-01 | ||
| ACLAR® – Películas de fluoropolímero | Microscopía Electrónica Sciences | 50425 | |
| Horno/Incubadora | VWR |
Referencias
- Heneka, M. T., Carson, M. J., et al. Neuroinflammation in Alzheimer's disease. The Lancet Neurol. 14 (4), 388-405 (2015).
- Herrup, K. The case for rejecting the amyloid cascade hypothesis. Nat. Neurosci. 18 (6), 794-799 (2015).
- Heppner, F. L., Ransohoff, R. M., Becher,....
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Reimpresiones y permisos
