Summary
הקריוספירה מציע גישה אורגניזמים משומרים שנמשכו בתנאים סביבתיים בעבר. פרוטוקול מוצג לאסוף לטהר ליבות קרח העד של קרקעות וקרח. עדר מושבות אקסוגניים ו- DNA מראה כי מיקרואורגניזמים זוהה מייצג את החומר, ולא זיהום מקידוחים או עיבוד.
Introduction
הקריוספירה (למשל, קרקעות קפוא, תכונות קרח, שלג קרחונים, firn, וקרח) מציעה צצה אל מה סוגים של אורגניזמים התעקש בתנאים סביבתיים בעבר. מאז מצעים אלה יכולים להיות עשרות עד מאה אלף שנים, קהילות החיידקים שלהם, כאשר נשמרו קפוא מאז בתצהיר, משקף תנאים סביבתיים עתיקים. כדי לנתח אלה מערכות אקולוגיות כראוי ולחלץ מידע ביולוגי משמעותי מקרקעות קפוא וקרח, אוסף ועיבוד תקין של הדגימות הקפואות יש צורך. זה הוא בעל חשיבות עליונה כמו תחזיות אקלים עבור המאה ה -21 מצביעות על פוטנציאל התחממות בולטת הארקטי ותת-הארקטי אזורי 1. באופן ספציפי, הפנים אלסקה וגרינלנד צפויים לחמם כ 5 מעלות צלזיוס ו -7 ° C, בהתאמה עד שנת 2100 2,3. זה צפוי להשפיע על הקרקע באופן משמעותי וקהילות חיידקים ימיים, ולכן, הקשוריםתהליכי biogeochemical. הטמפרטורות החמות המשטר משקע שינה צפויים ליזום שפלת permafrost בתחומים רבים 2-5 פוטנציאלי מוביל מופשר עבה, עונתיות (פעיל) שכבת 6,7, הפשרת קרקעות קפוא, ואת ההיתוך של גופי קרח מסיביים כגון קרקע קרח, טריזי קרח, והפרדת קרח 8. זה היה משנה את תכונות biogeochemical דרמטי בנוסף המגוון הביולוגי של צמחים ובעלי חיים במערכות אקולוגיות אלה.
קרח קרחונים ותכונות permafrost משקעים וקרח syngenetic יש לכודים כימיים ממצא ביולוגי של סביבה המייצגים מה שחי שם בזמן התכונות נוצרו. לדוגמה, ב הפנים אלסקה, הן Illinoisan וויסקונסין בגילאי permafrost קיימים permafrost זה בפרט מספק מיקומים ייחודיים משנת מודרני 150,000 שנים לפני ההווה (שנה לפני זמננו) המכילים ראיות ביולוגיות גיאוכימיים של הרשות למניעת הלבנתct של שינויים אקלימיים בעבר על המגוון הביולוגי. כתוצאה מכך, משקעים אלה מספקים תיעוד של biogeochemistry והמגוון הביולוגי על אלפים רבים של שנים. מאחר שהתחום יש שיעורי שקיעה נמוכים, ומעולם לא מכוסה קרחונים, דגימות באין מפריע נגישות עבור איסוף וניתוח, או קידוח אנכי לתוך אדמת הפרופיל או הקידוח אופקי במנהרות. יתרה מכך, רשומות נרחב קיימים במיוחד להדגיש את המאפיינים הייחודיים של biogeochemical permafrost באזור זה 9-14. באופן ספציפי, היישום של ניתוח דנ"א להעריך נוכחות והיקף של מגוון ביולוגי הוא דגימות קרח קפוא קיימות ועתיקות מאפשר חקירה של ההצמדה של תנאים סביבתיים העתיקו ובית הגידול לכיבוש על ידי אורגניזמים ספציפיים.
מחקרים קודמים זיהו השפעות אקלימיות על יונקים, צמחים ומיקרואורגניזמים ממדגמים המתוארכים 50k 11 שנה לפני זמננו, 15-19, למרות כל המחקר השתמש differeהמתודולוגיה NT לאסוף לטהר ליבות קרח העד או קרח. בחלק ממקרים, ליבות הקידוח עוקרו 16, 20-21, על פי מתודולוגיה ספציפית לא הבהירה אם חומצות גרעין זרות גם הודחו מן הדגימות. במחקרים אחרים, חיידקים מבודדים 15 (למשל, marcescens Serratia) וכן microspheres פלורסנט 22 שמשו כדי למדוד את היעילות של שיטות ניקוי מתאימות.
ניסוי זה היה חלק ממחקר גדול חוקרת קהילות חיידקים מדגימות permafrost שראשיתה כ 40k שנה לפני זמננו. המטרה הספציפית של חלק זה של המחקר הייתה לטהר בהצלחת ליבות קרח קפוא. למיטב ידיעתנו, אין מתודולוגיה שילבה את השימוש של פתרונות שנועדו לחסל חומצות גרעין זרים nucleases הקשורים מהחלק החיצוני של ליבות קפוא. זאת למרות העובדה שפתרונות אלו הם commonly לשמש כדי לטהר ציוד מעבדה לניסויים מולקולריים.
לאחר ליבות היו לעקרם, הדנ"א הגנומי הופק באמצעות פרוטוקולים שפותחו על ידי גריפיתס et al. 23 ו towe et al. 24, לכמת באמצעות ספקטרופוטומטר, ומדולל עם מים סטריליים, חינם-DNA כדי להשיג 20 ng לכל תגובה. גנים rRNA 16S בקטריאלי היו מוגבר עם פריימרים 331F ו 797R ו לחקור BacTaq 25 וגנים archaeal 16S rRNA היו מוגבר עם פריימרים קשת 349F ואדר 806R ו לחקור TM קשת 516F 26 בתנאים הבאים: 95 מעלות צלזיוס למשך 600 שניות ואחריו 45 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 57 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות, ו -72 מעלות צלזיוס למשך 25 שניות עם סיומת סופית ב 40 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות. כל התגובות qPCR נערכו בשני עותקים. 20 כרכי התגובה μl כללו 20 DNA ng, 10 מיקרומטר של פריימרים, 5 מיקרומטר של החללית, ו -10 μl של תערובת תגובת qPCR. תקני FOr חיידקים archaeal qPCR אלה נערכו על בסיס ה- DNA הגנומי של Pseudomonas fluorescens ו Halobacterium salinarum, בהתאמה. שניהם גדלו להתחבר שלב. ספירת צלחת נערכה ו- DNA שבודד התרבויות. הדנ"א הגנומי היה לכמת עם ספקטרופוטומטר עם ההנחה של אחד ושישה עותקים של הגן 16S rRNA לכל הגנום עבור H. salinarum ו פ fluorescens, בהתאמה 27-28. מספרי העתק של גני חיידקיים archaeal חושבו בהתבסס על עקומת הסטנדרט, יומן טרנספורמציה על מנת להתייחס להבדלים שוויוניים בין הטיפולים, הוערך על ידי ANOVA.
רכב הקהילה נקבע על ידי רצף גן 16S rRNA באמצעות תאי זרימה וטכנולוגיות הגברת גשר וניתוח הקהילות עם "תובנה כמוני לתוך אקולוגיה מיקרוביאלית '(QIIME) 29. קדימה לאחור קורא חוברו יחדיו ואז רצפים סוננו, באינדקס,ונציגים באיכות גבוהות נבחרו יחידות טקסונומיות דה נובו מבצעיות (OTU) הקצאה באמצעות יישור רצף עם נתונים להפניה. רצפים מסודרים הושוו מסד נתוני התייחסות נפרד למשימת טקסונומיות. שולחן OTU מערכה רמת נוצרה כדי לקבוע את הרכב הקהילה בכלל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הכנת ציוד 1. אוסף Core permafrost
- הכנת ציוד אוסף מדגם שדה וציוד שימור
- להרכיב במקדחה עבור אוסף מדגם ידי הוספת מתאם הכונן לתוך החלק העליון של הקנה ואת סיבוב הידית כדי לנעול אותו במקום. הצמד את צינור המתאם על מתאם הכונן ואת סיכת המנוע על צינור המתאם. הכנס את כרסומי החבית.
- לובש חליפות חובת אור, כפפות ניטריל, ומסכות לצמצם את זיהום הדגימות. תלבש גינת אוזן וכובע קשה בטיחות בכניסת מנהרת קרח העד (איור 1).
- נכנסים לתוך המנהרה לבחור מיקום לאסוף דגימות (איור 1B).
הערה: מיקום קידוח אנכי או אופקי, בחר באזור שבו יש ידוע ראיות כי החומר הוא קפוא (למשל, קרח או קרח עד), אין שם מערכת שורשים גדולים ידוע, ואין חצצתי ידוע. להסיר את כלחי חומר צמחי מאזור לפני איסוף דגימה. אם קידוח אנכי או אופקי, בחר אזור הוא יחסית שטוח ונגיש עם במקדחה. - כן תחנת עבודה על ידי שכבות הקרקע עם חומר פלסטי כי כבר מעוקר עם 70% isopropanol, פתרון טיהור DNA, פתרון טיהור RNase.
- מניחים פוליוויניל כלוריד בקוטר 10 ס"מ (PVC) לחתוך צינור לאורכם בתחנת העבודה לספק שוקת להחזיק ליבות כפי שהם יוסרו מן במקדחה. לטהר את צינור PVC עם 70% isopropanol, פתרון טיהור DNA, פתרון טיהור RNase.
- ליד תחנת עבודה, לטהר במקדחה ידי ריסוס זה עם 70% isopropanol, פתרון טיהור DNA, פתרון טיהור RNase. הסר פתרונות מן במקדחה עם לנגב.
- אוסף ליבת קרח קפוא ואחסון
- בחר שטח של הקיר כדי מדגם (ראה 1.2.1הערה).
- לטהר כ 10 ס"מ קוטר של האזור קיר קפוא על ידי מנגב אותו עם 70% isopropanol, פתרון טיהור DNA, פתרון טיהור RNase.
- הגבהה של במקדחה לחטא לאזור של ריבית כזו שיהיה ניצב לאזור מדגם ולהתחיל קידוח לתוך הפנים ניקה של קיר (איור 1 ג ', ד').
- מוציאים בזהירות את במקדחה מאזור אוסף המדגם. נתק במקדחה מהמנוע ומניחים במקדחה מעל צינור PVC סטרילי בתחנת עבודה נקייה. בזהירות להטות במקדחה כך ליבות קפוא להחליק החוצה על צינור PVC סטרילית (איור 1E).
- לטהר כפפות עם 70% isopropanol, פתרון טיהור DNA, פתרון טיהור RNase.
- תרים את ליבות הקרח קפוא עם כפפות סטריליות ולהכניס אותם לתוך שקיות סטרילי.
- מניח את הליבות בחדר קריר או קר עד שהם נשלחים או מעובד.
- שששip הליבות הקפואות באמצעות קרח יבש כדי לשמור אותם בטמפרטורה נמוכה מ 0 °.
- מיד לאחסן ליבות ב -80 מעלות צלזיוס.
Permafrost 2. ועיבוד Core קרח
- הכנת חומר
- כן סטרילית, רדיד אלומיניום הכבדות חינם חומצות גרעין, מדפי מתכת, זכוכית, מלקחי מתכת, וצמר זכוכית על ידי אפייה בתנור על 450 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות. מניחים בצד את החומרים הללו עד בשימוש.
- לעקר 95% אתנול ומים ultrapure ידי העברת הפתרונות דרך פילטר 0.22 מיקרומטר.
- פתרון אתנול חנות ב C ומים -20 ° ב 4 מעלות צלזיוס.
- לעקר סרגל פלסטיק ידי ריסוס זה עם 70% אתנול, פתרון טיהור DNA, פתרון טיהור RNase ומיד מנגב אחרי כל פתרון.
- בקטריאלי תרבות הכנה
- כן מרק וצלחות לגדול marcescens Serratia.
- עבור מרק, לשלב לנסות גרם 5ptone, גלוקוז g 1, תמצית שמרים 5 גרם, ו dibasic פוספט אשלגן 1 גרם, ולאחר מכן מוסיפים מים מזוקקים כדי להגיע 1 ל כדי להפוך צלחות, להוסיף 15 גרם של אגר לתערובת לעיל. לקבלת מרק וצלחות, כדי להתאים את pH 7 ו חיטוי ב 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
- הכן תמיסת מלח 1x buffed פוספט (PBS) על ידי שילוב 8 נתרן כלורי גרם, 0.2 גרם של אשלגן כלורי, 1.44 גרם של dibasic פוספט נתרן, אשלגן זרחתי monobasic 0.24 גרם ולהוסיף מים מזוקקים כדי להגיע 800 מ"ל. התאם ל- pH 7.4 ולהוסיף מים מזוקקים כדי להגיע 1 ל החיטוי ב 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
- לחסן מרק עם לולאה סטרילי ושלח יד אל ס תרבות marcescens שהיה מאוחסן קפוא בעבר ב -80 מעלות צלזיוס. בתנאים aseptic, סדרתי לדלל את התרבות על ידי הוספת 1 מ"ל של התרבות עד 9 מ"ל של PBS ו ידני להפוך את הפתרון. הוסף 1 מ"ל של דילול זה עד 9 מ"ל של PBS ו ידני להפוך את הפתרון. חזור על פי שמונה יותר עד 10 -9 dilution הוא הגיע.
- מורחים את 10 -6, 10 -7, 10 -8, ו -10 -9 פתרונות על צלחות אגר על ידי הפצת 1 מ"ל של מרק לצלחת והפצת עם מפזר תא. האם זה בשלושה עותקים לכל דילול. אחסן את התרבות המקורית על 4 מעלות צלזיוס.
- דגירת צלחות על 30 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. ספירת מושבות כדי לחשב את מספר תאי התרבות המקורית. הערה: מספר מושבות בתרבות המקורית יהיה תלוי בקצב הצמיחה של החיידקים.
- Pipet 250 μl של התרבות המקורית לתוך 1.5 מ"ל microcentrifuge צינור סטרילי. לדלל תרבות המקורי על ידי הוספת נפח מספיק של PBS 1x לקבל כ 10 9 תאים / מ"ל כפי שנקבע על ידי ספירת המושבה בשלב הקודם. גלולת התאים בצינור microcentrifuge על ידי צנטריפוגה ב 2500 XG במשך 10 דקות.
הערה: היקף PBS 1x ישתנה תלוי בקצב הצמיחה של החיידקים. - בעוד biohood סטרילי, Pipet את מרק resuspend התאים 1 מ"ל 1x חיץ PBS. חנות ב 4 ° C עד השימוש או כחודשיים.
- ביום של עיבוד, לדלל את ס תרבות marcescens משלב 2.2.7 על ידי הוספת 1 מ"ל של ס המקורי תרבות marcescens ל -39 מ"ל 1x חיץ PBS בצינור צנטריפוגה 50 מ"ל.
- כן מרק וצלחות לגדול marcescens Serratia.
- הכן מקום בחדר קר לעיבוד ליבה וציוד שימור
- לפני המצמרר בחדר הקר, קירות נקיים, רצפות, שולחן מתכת עם פתרון אקונומיקה 1%.
- טמפרטורת סט בחדר הקר לכ -11 מעלות צלזיוס.
- ברגע בחדר הקר הגיע לטמפרטורה הרצויה, לובש חליפות חובת אור, כפפות ניטריל, ומסכות לצמצם את זיהום לחדר הקר הדגימות.
הערה: שני אנשים לבושים כראוי נדרשים לצורך הליך זה. - תביא את החומרים סטרילי (למשל, רדיד אלומיניום, מדפי מתכת, זכוכית, מגש, תרבות marcescens ס, ותערובותלהב crotome) ודגימות לחדר והמקום הקרים על השולחן סטרילי.
- Permafrost ועיבוד ליבת קרח במתקן בחדר קר
- מניח ליבת permafrost על גיליון חינם חומצה סטרילי, גרעין של רדיד אלומיניום.
- קל לחסן את החלק החיצוני של הליבה עם התרבות המדוללת של ס marcescens באמצעות תקע קצף סטרילית (איור 2 ב).
- מניח את הליבה על מדף מתכת סטרילי שיושב מעל מגש.
- לעקר את להב פלדה microtome עם 70% אתנול, פתרון טיהור DNA, פתרון טיהור RNase.
- יש פרט נקי כפפות ניטריל עם 70% אתנול, פתרון טיהור DNA, פתרון טיהור RNase וחזק ליבה בזווית של 45 מעלות מעל המגש.
- מאדם B בעדינות לגרד כ 5 מ"מ של החלק החיצוני של הליבה כולו, כולל הקצוות, באמצעות להב סטרילי תוך הפרט הופך את הליבה אחרי כל שריטה (
- מאדם B לשפוך אתנול מסנן-מעוקר 95% מעל המוקד בזהירות ובמהירות, תוך פרט הופך את הליבה כפתרון הוא שפך (2D הדמוי, 3 ג).
- מאדם B מיד לשטוף את הליבה עם מים מעוקרים-מסנן.
- חלף מתל מתכת משומשת על מגש עם מתלת מתכת סטרילית חדשה.
- מאדם נקי כפפות ניטריל שלו או שלה עם 70% אתנול, פתרון טיהור DNA, פתרון טיהור RNase והחזק את הליבה בזווית של 45 מעלות מעל המגש.
- מאדם B לרסס את הליבה כולו עם פתרון טיהור DNA.
- מאדם B מיד לשטוף את הליבה עם מים מעוקרים-מסנן.
- מאדם B לרסס את הליבה כולו עם פתרון טיהור RNase.
- יש individuאל B מיד לשטוף את הליבה עם מים מעוקרים הסינון.
- מניחים את הליבה על גיליון סטרילי של רדיד אלומיניום ולעטוף בקלילות.
- ליבה חיצונית הפשרה
- מניחים מתלה מתכת סטרילי מעל צלחת זכוכית סטרילית biohood סטרילי עם זרימה למינרית.
- מניח שתי צלחות אגרו ספציפית S. marcescens בצלחת זכוכית מתחת מתלה סטרילי לאסוף נוזלי מהליבה (איור 2E).
- מניח את הליבה על מדף מתכת סטרילי.
- יש להמתין לפחות 2-5 מ"מ של פני השטח החיצוניים של ליבה להפשיר ב 23 ° C (בממוצע, זה יתרחש בתוך כ -10 דקות). סובב את הליבה כ 90 ° כל 2 דקות.
- ספוגי כל פני שטח של ליבה באמצעות מלקחיים סטריליות וצמר זכוכית סטרילית ולחסן שתי צלחות אגרו ספציפית S. marcescens ידי בניקוי חומרים אלה על פני השטח של הצלחות. לחסן שתי צלחות חדשות עם התרבות המקורית ששמש סם כלשהו חיצוני שלליבה, אשר נחשפה לטמפרטורות הנמוכות של החדר הקר.
- מדוד ממדים חיצוניים של ליבה גלילית מופשרת על ידי צבת שליט סטרילית ליד, אבל לא נוגע ליבה.
- מניח את הליבה לתוך שקית סטרילית גדולה ולאחסן אותו ב -80 מעלות צלזיוס.
- בדוק לצמיחה
- דגירת צלחות אגרו ב 23 מעלות צלזיוס במשך שבוע אחד.
- בדוק צלחות אגרו לצמיחה של ס מושבות marcescens.
- אם אין מושבות גלויות על הצלחת, המשך לשלב 2.5.3.
- אם המושבות המופיעות על צלחת, וחזור משלב 2.1.1 בסעיף 2 "permafrost ועיבוד ליבת קרח".
- השג את הליבה ממקפיאה בסביבה נקיה מחיידקים ולהעבירו שקית סטרילית.
- אחסן את הליבה בתוך שקית סטרילית על 4 מעלות צלזיוס למשך כ 24-48 שעות כדי להפשיר את הליבה כולו.
3. לקבל subsample להפקת חומצות גרעין של ליבות קרח ו permafrost
- מיצוי חומצות גרעין של ליבות קרח
- מערבבים את החומר מופשר מליבת קרח ידי להסעיר את התיק בעדינות (איור 2G).
- יוצקים את החומר מופשר לתוך מיכל סטרילי עם מסנן 0.22 מיקרומטר תחת ואקום לאסוף מיקרואורגניזמים.
- בסביבה נקייה מחיידקים, להסיר את המסנן עם מלקחיים סטריליות ומניחים אותו בתוך שפופרת קרמי 2 מ"ל סטרילי (1.4 מ"מ).
- אחסן את המסנן ב -80 מעלות צלזיוס.
- מיצוי חומצות גרעין מ ליבות permafrost
- מערבבים את החומר מופשר מהליבה permafrost את לישת שקית בעדינות.
- לאחר הקפואה כבר מעורבב היטב, לקבל subsample אדמה בתפזורת כ 0.5 גרם עם scoopula סטרילי ולמקם אותו צינור בורג מכסה קרמי tared סטרילי 2 מ"ל (1.4 מ"מ) שיושב זקוף על איזון.
- subsamples החנות ב -80 מעלות צלזיוס.
- השג תכולת המים gravimetric של דגימות.
- מדוד 10 גרם של קרח העד עם sterilscoopula ומקום דואר בתוך פח tared על איזון. מדוד המוני הרטוב של permafrost ובדיל.
- דגירה קפוא בתנור שחומם ל -105 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. מדוד מסה יבשה של permafrost ובדיל.
- חשב את תכולת מי gravimetric על ידי הפחתת מסת הרטוב של permafrost ידי המסה היבשה של permafrost וחלוק המסה היבשה של permafrost.
- permafrost חנות ב -80 מעלות צלזיוס.
4. חלץ חומצות גרעין מ שכבות האדמה הקפואה והקרח Cores
- הכנת חומר
- הכן בקבוקונים ענבר להחזיק פתרונות על ידי טיפול עם 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC), דוגרים O / N ב 37 מעלות צלזיוס, ו מעוקר.
- כן 240 פתרון חיץ פוספט אשלגן מ"מ. להוסיף 2. 5 גרם של monobasic פוספט אשלגן 38.7 גרם של dibasic פוספט אשלגן. התאם נפח סופי 500 מ"ל על ידי הוספת מים סטריליים.
- כן ברומיד hexadecyltrimethylammonium (CTAB) מיצוי buffer ידי המסת נתרן כלורי 4.1 גרם ב 80 מ"ל מים תוך הוספה הדרגתית 10 גרם CTAB תוך חימום ו ערבוב. התאם נפח סופי 100 מ"ל על ידי הוספת מים סטריליים.
- להוסיף כמויות שווות של פתרון חיץ פוספט CTAB החיץ מסנן לעקר עם מסנן 0.22 מיקרומטר. מכסים בקבוק עם רדיד אלומיניום ולאחסן ב RT.
- הכן 1.6 M פתרון נתרן כלורי (NaCl) על ידי שילוב 9.35 גרם NaCl ו -100 מ"ל מים סטריליים. הוסף 10 גר 'פוליאתילן גליקול 8000 אל לעקר פתרון ולסנן 1.6 M NaCl. חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
- מיצוי חומצות גרעין פי גרסה שונה של אל גריפיתס et. 22 ו towe et al. 23
- לובש חליפות חובת אור, כפפות ניטריל, ומסכות. מרחב pipets מעבדה נקי עם 70% אתנול, פתרון טיהור DNA, פתרון טיהור RNase.
- הסר subsample (מסנן מליבה קרח או דגימת קרקע קפואה) ב 2 מ"ל קרמי בורג-cap צינור מ -80 מעלות צלזיוס הקפאת פשרה ב RT.
- הוסף 0.5 מ"ל של ברומיד hexadecyltrimethylammonium (CTAB) מיצוי חיץ בקצרה מערבולת.
- הוסף 0.5 מיליליטר של אלכוהול פנול, כלורופורם-isoamyl (25: 24: 1) (pH 8) ולנער צינורות אופקיים במשך 10 דקות באמצעות מתאם שטוח על vortexer.
- בעקבות הכאת חרוז, צינורות צנטריפוגות ב 16,100 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C.
- הסר השכבה המימית לצינור 1.5 מ"ל סטרילי חדש ומערבבים עם נפח שווה של אלכוהול כלורופורם isoamyl (24: 1). צנטריפוגה ב 16,100 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C..
- סר שכבה מימית לצינור 1.5 מיליליטר סטרילי חדש ולהוסיף שני כרכים של גליקול 30% פוליאתילן 8000 ו -1.6 M NaCl. דגירה עבור שעה 2 ב 4 ° C..
- צנטריפוגה ב 16,100 XG במשך 10 דקות ב 4 °.
- לשטוף גלולת חומצות גרעין עם כ 500 μl של אתנול ו צנטריפוגות קרה כקרח 70% ב 16,100 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C.
- האוויר גלול יבש בתוך biohood סטרילי עבור שעה 2. Resuspend ב 50 DNase μl / RNase ללא חיץ TE (pH 8.0). DNA הוא מוכן יישומים במורד כגון PCR ו qPCR.
- קביעת ריכוז של ה- DNA עם ספקטרופוטומטר.
- לדלל DNA עם מים סטריליים, חינם-DNA כדי להשיג 20 ng לכל תגובה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השיטה המוצגת יכולה לשמש כדי לטהר דגימות קפואות שנאספו מסביבות cryosphere שונות, החל קרח קרחונים כדי קפוא. כאן, אנו מציגים נתונים שנאספו במיוחד ממדגמים קרח קפוא שנאספו לחקר ההנדסה ופיתוח מרכז - קר אזורי מחקר מעבדת הנדסה (ERDC-CRREL) permafrost מנהרת ממוקם פוקס, AK (איור 1A ו -1 B). מנהרת permafrost משתרעת כ 110 מטר לתוך הצד של Goldstream עמק ומספקת גישת סחף עשיר קרח וסחף 30-31. דוגמאות מתוך טריז קרח קרקע קפוא נאספו בקפידה בשלושה עותקים מחומות המנהרה ב -24 באוקטובר 2014. באותו הזמן של דגימה, הטמפרטורה של קיר permafrost הייתה -2.9 מעלות צלזיוס. דוגמאות נאספו תכונת טריז קרח כ 27 מ 'מהפורטל של המנהרה, והאדמה קפואה ב 35 מ' ו -60 מ 'הפורטל של המנהרה (איור 1 ג ו 1D). טיפול מיוחד נלקח במהלך איסוף דגימה להגביל זיהום של ליבות קרח קפואה (איור 1E). הליבות קפואות טופלו על פי פרוטוקול הטיהור שלנו (איור 2), והם הוסעו על קרח יבש אל המעבדה למיקרוביולוגיה אדמת CRREL בהאנובר, NH לעיבוד.
כל הליבות עובדו באמצעות הפרוטוקול המתואר בסעיף 2 באמצעות להבים ופתרונות microtome סטרילית (איור 3 א ', ב' ו-ג). מטרת המחקר הנוכחי הייתה לחלץ חומצות גרעין אנדוגני בהצלחה מן הדגימות הקפואות לקבוע את קהילות החיידקים הנוכחות בזמן שהחומר הופקד. פרוטוקול הטיהור הוערך על ידי סימום הליבות עם תרבות מדוללת של marcescens Serratia ולאחר מכן לבחון את צלחות פטרי עבור ומאחור צמיחהאה הליבות טופלו 31. עדר ס מושבות marcescens ציינו כי מיקרואורגניזמים אקסוגניים הוסרו כראוי מן החלק החיצוני של הליבה. עם זאת, בהעדר מושבות לא לציין אם DNA אקסוגני הוסר מן החלק החיצוני של הליבה. לכן, אנו רצפנו דגימות מן ליבת הקרח כדי לבדוק דנ"א Serratia sp. בגלל שפע חיידקים טריז הקרח עשוי נמוך משמעותית מאשר הקפואה, השתמשנו בליבות קרח כדי לקבוע אם דנ"א ס marcescens יהיה נוכח בעקבות פרוטוקול הטיהור. אם הליבות לא היו לחטא כמו שצריך, אז רצפים הקשורים S. marcescens יהיה צפוי להיות נוכח הדגימות. איור 4 מראה את מגוון חיידקים הנמוך בתוך ליבת הקרח מתוצאות רצף גן 16S rRNA. רצפים הקשורים Pseudomonas sp., של המערכה Gammaproteobacteria, שלוט הקרח samples. חברים הקשורים Planctomycetia נכחו גם בתוך הקרח, אך במידה פחותה. שים לב במיוחד הוא העדר sp Serratia. בתוצאות רצף, דבר המצביע על כך פרוטוקול טיהור הסיר DNA אקסוגני מספיק.
יתר על כן, קיים סיכון נוסף של זיהום במהלך החילוץ של חומצות גרעין. חסר חילוץ שלילי שמש לחשוף זיהום מחומצות גרעין אקסוגניים. ה- DNA מן דגימות בקרות שליליות היו מוגבר באמצעות qPCR. נתונים qPCR הראה כי permafrost טיפח חיידקים, אבל קדומים היו לא זוהה permafrost (טבלה 1). טיהור מוצלח קיבלה אישוש נוסף על ידי חוסר amplicons חיידקי או archaeal ב החסר החילוץ, בשיתוף עם הגברה חיובית של הבקרות, Pseudomonas fluorescens ו Halobacterium salinarum (טבלה 1). abundמדידות אהה גילו כי לא היו הבדלים משמעותיים שפע חיידקים בין הליבות שנאספו ב -35 מ 'מהפורטל לעומת 60 מ' הליבות (טבלת 1). מחקר שוטף נערך כדי לקבוע אם רכב קהילת חיידקים היה שונה בין הליבות.
אתרי באיור 1. לדוגמא ליד פיירבנקס, AK. (א) מפת פיירבנקס, AK (http://www.volunteer.noaa.gov/alaska.html), (ב) ERDC-CRREL מנהרת קרח העד, (ג) אוסף של ליבות קרח עד באמצעות מקדח SIPRE, (ד) נוכח במקדחת הזנת קיר קרח עד, ו- (ה) הכנת הליבה עבור ארכיונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גדול Verשיאון של נתון זה.
איור 2. סכמטי של decontaminating חומר קפוא. (א) חומר הקפוא (למשל, ליבת קרח או ליבת permafrost) מעובד בחדר קר. (ב) הוא מזוהם בכוונה עם תרבות חיידקים. (ג) הליבה הוא מגולח עם להב microtome סטרילי כדי להסיר את החלק מ"מ החיצוני 5. (ד) סדרת פתרונות מוחלים נוספים לטהר את החלק החיצוני של המדגם. DDS מציין פתרון טיהור דנ"א RDS מציין פתרון טיהור RNase. (ה) על ידי הצבת הליבה בתוך biohood סטרילית שנערך ב RT, מ"מ 2-5 החיצוני של החומר מפשיר. הנוזל מטפטף מן הקרח או permafrost נאסף בצלחות פטרי הליבה swabbed מצופה לבדוק כי הגרעין היה לחטא כראוי. (F ו- G) אם התפתחות חיידקים לא מזוהה, אז הליבה מופשר ב 4 ° C. במיכל סטרילי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
טיהור איור 3. של ליבות קרח עד בחדר קר בתנאים סטריליים. (א) הסירי את השכבה החיצונית של הגרעין הקפוא עם להב המתכת microtome על ידי גירוד. (ב) תקריב של שריטה. (C) לשטוף פתרון כדי לטהר את השכבה החיצונית של הגרעין. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. רצפים מיקרוביאלית ממדגמים טריז הקרח. בר תרשים המציג את השפע היחסי הממוצע של טווח מערכת החיידקים נוכחי בדגימות טריז קרח על ידי אחוז. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
שפע בטבלה 1. חיידקים קפוא. תוצאות qPCR מראות את השפע של חיידקים בדגימות permafrost ואת חסר החילוץ קשור. ערכים בטבלה מדווחים כממוצע ± שגיאת התקן. n הוא מספר דגימות. ND מציין לא זוהה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הקריוספירה מציע גישה אורגניזמים משומרים שנמשכו בתנאים סביבתיים בעבר. למרות המינים התאוששו עלולים שלא לייצג את הקהילה ההסטורית המלאה, אלה התאוששו מניתוח דגימות קרח קפוא קרחונים יכולים להניב מידע היסטורי רב ערך על פרקי זמן בוחרים 15-16. למשל, מידע ביולוגי משמעותי הוסת ממחקרי קרח חוקרות פעילות אנאירובית במעטת הקרח בגרינלנד 20 ומחקרי permafrost חוקרים תהליכי אופני הפחמן כתוצאת ההפשרה 33 ו ספק תובנות מגוון פטרייתי מ permafrost ב Beringia 16. איסוף טיהור מדגם פרופר חייב להתרחש לפני ביצוע במורד זרם המנתח לחקור קהילות ביולוגיות בתוך החומרים קפוא האלה. למרות פעולות אלו יש השלכות משמעותיות על לפרש את הנתונים, מחקרים רבים אינם מציעים פרטים ספציפיים על איך דגימות were נאסף ומעובד או תמונות מראות כיצד להתמודד עם החומרים קפואים. למשל, מחקרים קודמים מסוממים את החלק החיצוני של ליבות עם microspheres פלורסנט או חיידקים ידועים 15, אם כי הריכוזים המדויקים של החומרים הללו היו לא תארו. מחקרים אחרים תארו פרוטוקולי טיהור בפירוט, אבל לא החלו תפוקה גבוהה מנתח לבדיקת היעילות של המתודולוגיה 15, 32. לכן, הקרנה מפורטת של חיידקים שלמים DNA אקסוגני באמצעות צמיחה על צלחות פטרי qPCR שמשה כדי לקבוע אם אוסף המדגם, שימור, נהלים אנליטיים היו עקרים מספיק כדי לזהות קהילות חיידקים נוכח החומרים קפוא.
פרוטוקול זה שונה כדי לבודד חומר גנטי בהצלחת עניין מצד ליבות עתיקות. טיפול כגון לובש הילוך ספציפי decontaminating אספקה חייב להילקח במהלך איסוף, עיבוד, ותמציתיון מן הליבות מאז זיהום יכול להתרחש בכל שלב. יתר על כן, משלוח הליבות עם קרח יבש או סוכן קירור דומה קיימת הכרח כי אם הליבות להפשיר בזמן המעבר, אז יש נטייה גבוהה יותר כי מזהם מהאזור החיצוני של הליבה עשוי לנדוד אל החלק הפנימי של הליבה. כדי לצמצם עוד יותר את פוטנציאל הזיהום, לשקול איסוף ליבות גדולות עם במקדחה ממונעת ולא גרעין דחיפה. מצאנו כי ליבות הדחיפה היו קטנות מדי כדי לטהר כראוי בשלב הגירוד. לחלופין, נפח גדול יותר של מדגם יכול להיות מופק הליבות הגדולות, וזה חשוב במיוחד עבור דגימות עם שפע נמוך של חומר ביולוגי. בנוסף, הנפח הגדול יותר מאפשר יותר מקום לטעויות כאלה שאם מושבות marcescens Serratia מזוהות על צלחות, אז הליבה היא גדולה מספיק כדי להיות מעובד שוב.
אספקה שונה נבדקה כדי לקבוע את היעיל ביותרשיטה לטהר ליבות. למשל, רדיד אלומיניום סטרילי, ולא כלים מזכוכית או חומרים פלסטיים, היא שאפשרה את הליבה להיות מונח על משטח סטרילי במהירות ובקלות. כמו כן, לא מסורתי אספקה כגון מתל מתכת מגש ההוכחה להיות מועיל לאפשר חומרים חיצוניים מגורדים לצבור מהליבה, ומקטינים את הסיכון מחדש לזהם את הליבות. בשנת חזרות מוקדמות יותר של הפרוטוקול, הגירוד התרחש על משטח שטוח, אשר הגדיל את הסיכון לזיהום. לבסוף, שקיות סטרילי, ולא כלים מזכוכית, נמצאו להיות תורמת ערבוב ואחסון דגימות.
פרוטוקול זה היה ממוקד לחסל מיקרואורגניזמים וחומצות גרעין על החלק החיצוני של הליבות קפואות. בעוד isopropanol ואתנול הם חומרי חיטוי יעיל, הם אינם שוללים חומצות גרעין. לכן, פתרונות המסירים חומצות גרעין ואנזימים הקשורים מהחלק החיצוני של הליבות שמשו. solu אלהמשא משמש כדי להסיר חומצות גרעין nucleases המשויך מתוך ציוד מעבדה וציוד. כאשר בודקים את יעילותם על משטחי מעבדה, פתרון טיהור RNA סיר חומרים אקסוגניים יותר מאשר פתרון טיהור DNA 34. שימוש nucleases כדי לטהר את החלק החיצוני של הליבה לא תמיד השיטה המועדפת כי חומרים גנטיים של עניין עשויים גם יוסרו דגימות עם שפע נמוך של אורגניזם מסוים. בפרט, חומר גנטי מאוחסן שכבות אדמה קפואה וקרח לפרקי הזמן לעבור שפלה. בגלל מיקרואורגניזמים נמצאים שפע גבוה בדגימות אלסקה אלה, החשש כי הפתרונים יסירו שיעור גבוה של חומרים גנטיים אנדוגני היה פחות בהרבה. עם זאת, יש לנקוט זהירות כאשר משתמשים בפתרונות המכילים nucleases מנת להבטיח כי חומצות הגרעין שהיו קשה מושפלים או מאורגניזמים בשפע נמוך אינן מוסרות על ידיnucleases.
עדר ס מושבות marcescens על צלחות פטרי בתנאי הביטחון כי התאים השלמים הוצאו מן החלק החיצוני של ליבות קרח העד. יתר על כן, ניתוח של ליבות קרח שעברו באותו פרוטוקול לא הראה רצפים לזיהוי הקשורים S. marcescens. תוצאות רצף עולה כי רק Pseudomonas התגלו בדגימות אלה, למרות ששני sp Pseudomonas. ו Serratia sp. הם בתוך הכיתה Gammaproteobacteria. יחד, בהעדר ס מושבות marcescens על צלחות פטרי והיעדר amplicons דנ"א qPCR מראים כי ליבות שכבר קפאו מקור לחטא בהצלחה. לפיכך, מיקרואורגניזמים זוהה היו משובץ סבירים בחומר הקפוא, ולא זיהום מקידוחים או עיבוד הליבות. טכניקות קידוח אחרות כוללות קידוח הידראולי לחדור אדמה או קרח בעומקים יותר. למרות woul בשיטה זוd להועיל לחקור שפע חיידקים נמוך בסביבות oligotrophic אלה, זה לא לגלות אם בץ קידוח יוסר בהצלחה. יתר על כן, אם רצף תפוקה גבוה הוא לא נכלל בניתוח במורד הזרם, PCR תגובות ספציפיות לחיזוק ס marcescens אמור לשמש כדי להגביר את ה- DNA חילוץ.
התוצאות ממאגר הנתונים בדוגמא שלנו הראו כי הדנ"א הגנומי שמורה היה חולץ בהצלחה מהחומרים קפואים. יתר על כן, הוא החיידקים טפחו טריז שכבות האדמה הקפוא וקרח, כפי שמעיד qPCR וסדר, בהתאמה. קרח-העד הרציף אלסקה ממחקר זה הכיל מספרי חיידקים דומים כמו permafrost באזור הארקטי העליון הקנדי 35, אם כי דגימות אלסקה כלולות צו של חיידקים פחות גודל מ permafrost המרמות טיבט במחוז צ'ינגהאי, סין 36 וקרקעות השכבה / permafrost פעילים נונאווט, 37 קנדה. דומה iטריז ce שנאספו נונאווט, 37 קנדה, רצפים הקשורים Gammaproteobacteria, במיוחד Pseudomonas, אשר נפוצים קרקעות מבחינת חילוף החומרים מגוונים, שלטו טריז קרח אלסקה במחקר זה. למעשה, Katayama et al. 11 חיידקים מבודדים בתוך הטווח המערכת Actinobacteria, חיידקים, ו Gammaproteobacteria מאחד טריזי הקרח מן מנהרת קרח עד ERDC-CRREL. מחקרים אלה מחזקות זיהוי של Gammaproteobacteria במחקר זה. Planctomycetia, אשר נפוצים מדגם מימי, אותר גם טריז הקרח. אורגניזמים אלו נמצאו בקרקעות שכבה פעילות מעל permafrost בצפון מזרח סיביר 38, בנוסף permafrost ב טיבט ב Qinghai, סין 39.
מחקרים רבים חקרו את הנוכחות של קדומים, במיוחד כמתאנוגנים, ב קפוא, עם הרעיון כמו מפשיר קרח עד, כמתאנוגנים יהפכו סביר יותר פעילים, contributing אל בזרימה של מתאן לאטמוספרה 21, 33-34. באופן מפתיע, קדומים היו לא זוהו בדגימות permafrost הטריז או קרח אלסקה אף הן Euryarchaeota ו Crenarchaeota נמצאו permafrost מן 17 הארקטי הגבוהים הקנדיות כמתאנוגנים נמצאו בדגימות permafrost מן טונדרה ארקטית ברוסיה 21.
חומרים קפואים נמל מיקרואורגניזמים עתיק, מתן תיעוד של תהליכי biogeochemical שהתרחשו אלף שנים לפני. מגוון ביולוגי זהו עניין רב תחת משטר התחממות האקלים הנוכחי כי המיקרואורגניזמים הוגבלו פעם בסביבת cryosphere עשויים להשתחרר כאשר להפשיר את החומרים קפואים. על מנת לזהות את המגוון הביולוגי טפח בביטחון בחומרים קפואים האלה, הקרקעות קפואות דגימות קרח חייבות להיות מטופלים כראוי לחטא. כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להסיר תאים זרים דנ"א מדגימות קפוא ensuמחדש כי מיקרואורגניזמים זוהה היו מן החומר, ולא זיהום מקידוחים או עיבוד הליבות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Auger | Snow, Ice, and Permafrost Research Establishment (SIPRE), Fairbanks, AK | ||
| 70% Isopropanol | Walmart | 551116880 | |
| 95% Ethyl Alcohol (denatured) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | A407-4 | |
| DNA decontamination solution, DNA Away | Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA | 7010 | |
| RNase decontamination solution, RNase Away | Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA | 7002 | |
| Light Duty Suits | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 10606 | |
| Nitrile Gloves | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | FFS-700 | |
| Antiviral Masks | Curad, Walgreens | CUR3845 | |
| Sterile Sample Bags | Nasco, Fort Atkinson, WI | B01445 | |
| Steel Microtome Blade | B-Sharp Microknife, Wake Forest, NC | ||
| Metal Rack | Fabricated at CRREL, Hanover, NH | ||
| Tray | Handy Paint Products, Chanhassen, MN | 7500-CC | |
| Aluminum Foil | Western Plastics, Temecula, CA | ||
| 500 ml Bottle with 0.22 μm Filter | Corning, Corning, NY | 430513 | |
| Serratia marcescens | ATCC, Manassas, VA | 17991 | |
| Biosafety Hood | NuAire, Plymouth, MN | NU-425-400 | |
| Petri Dish | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | FB0875712 | |
| ATCC Agar 181- Tryptone | Acros Organics, NJ | 61184-5000 | |
| ATCC Agar 181- Glucose | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP381-500 | |
| ATCC Agar 181- Yeast Extract | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP1422-500 | |
| ATCC Agar 181- Dipotassium Phosphate | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3252-01 | |
| ATCC Agar 181- Agar | Difco, Sparks, MD | 214530 | |
| NanoDrop 2000 UV Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE | ||
| Lightcycler 480 System | Roche Molecular Systems, Inc., Indianapolis, IN | ||
| Halobacterium salinarum | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ||
| Pseudomonas fluorescens | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ||
| Microbial DNA Isolation Kit | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 12224-50 | |
| Ear Protection | Elvex | EP-201 | |
| Hard Hat | |||
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 34705 | |
| Glass Wool | Pyrex | 430330 | |
| Ruler | |||
| Weighing Tin | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 08-732-100 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich, St Louis, MO | S-9625 | |
| Potassium chloride | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3040-04 | |
| Potassium phosphate, monobasic | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3246-01 | |
| Potassium phosphate, dibasic | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3252-01 | |
| Sodium phosphate dibasic, anhydrous | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP332-500 | |
| 50 ml Centrifuge Tubes | Corning, Corning, NY | 4558 | |
| 2 ml Microcentrifuge Tubes | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 1200-250-T | |
| 2 ml Ceramic Bead Tubes (1.4 mm) | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 13113-50 | |
| Scoopula | Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE | 1437520 | |
| Balance | Ohaus, Parsippany, NJ | E12130 | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich, St Louis, MO | D5758 | |
| Hexadecyltrimethylammoniabromide (CTAB) | Acros Organics, NJ | 22716-5000 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Sigma Aldrich, St Louis, MO | P5413-1KG | |
| Phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1) (pH 8) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP1752-400 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | 5417R | |
| Chloroform-isoamyl alcohol (24:1) | Sigma Aldrich, St Louis, MO | C0549-1PT | |
| TE Buffer | Ambion (Thermo Fisher), Wilmington, DE | AM9860 | |
| Pipets | Rainin, Woburn, MA | Pipet Lite XLS, 2, 10, 200, and 1,000 µl pipets | |
| Pipet tips | Rainin, Woburn, MA | Rainin LTS presterilized, low retention, filtered tips, 10, 20, 200, 1,000 µl | |
| Vortexor | Scientific Industries, Bohemia, NY | G-560 | |
| Vortex Adaptor | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 13000-V1 | |
| Clear Bottle | Corning, Corning, NY | C1395500 | |
| Amber Bottle | Corning, Corning, NY | C5135250 | |
| Bottle Top Filters, 0.22 µm | Corning, Corning, NY | 430513 | |
| 60 ml Syringe | Becton, Dickenson and Company, Franklin Lakes, NJ | BD 309653 | |
| Millex Syringe filters, 0.22 μm | EMD Millipore, Billerica, MA | SLGV033RB | |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP2818-500 | diluted & filter sterilized |
| Isotemp 100 L Oven | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 151030511 | |
| Cell Spreader | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 08-100-10 | |
| Disposable Inoculating Loops | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 22-363-602 |
References
- Intergovernmental Panel on Climate Change. Climate Change 2007: The Physical Science Basis. Solomon, S., et al. , Cambridge University Press. Cambridge, United Kingdom. (2007).
- Marchenko, S., Romanovsky, V., Tipenko, G. Numerical Modeling of Spatial Permafrost Dynamics in Alaska. Proc. Ninth Int. Conferen. Permafr. University of Alaska Fairbanks, 29, 1125-1130 (2008).
- Intergovernmental Panel on Climate Change. Climate Change 2014: Synthesis Report. Contributions of Working Groups I, II, and III to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. Pachauri, R. K., Meyer, L. A. , Intergovernmental Panel on Climate Change. Geneva, Switzerland. (2007).
- Osterkamp, T. E., Romanovsky, V. E. Evidence for warming and thawing of discontinuous permafrost in Alaska. Permafr. Periglac. Process. 10 (1), 17-37 (1999).
- Wolken, J. M., et al. Evidence and implications of recent and projected climate change in Alaska's forest ecosystems. Ecosphere. 2 (11), 1-35 (2011).
- Hinzman, L. D., Kane, D. L., Gieck, R. E., Everett, K. R. Hydrologic and thermal properties of the active layer in the Alaskan Arctic. Cold Reg. Sci. Technol. 19 (2), 95-110 (1991).
- Hinzman, L. D., Goering, D. J., Kane, D. L. A distributed thermal model for calculating temperature profiles and depth of thaw in permafrost regions. J. Geophys. Res.: Atmos. 103 (D22), 28975-28991 (1998).
- Osterkamp, T. E., Jorgenson, J. C. Warming of Permafrost in the Arctic National Wildlife Refuge. Alaska. Permafr. Periglac. Process. 17, 65-69 (2006).
- Petrone, K. C., Jones, J. B., Hinzman, L. D., Boone, R. D. Seasonal export of carbon, nitrogen, and major solutes from Alaskan catchments with discontinuous permafrost. J. Geophys. Res. 111, G02020 (2006).
- Guo, L., Ping, C. -L., Macdonald, R. W. Mobilization pathways of organic carbon from permafrost to arctic rivers in a changing climate. Geophys. Res. Lett. 34 (13), L13603 (2007).
- Katayama, T., et al. Phylogenetic analysis of bacteria preserved in a permafrost ice wedge for 25,000 years. Appl. Environ. Microbiol. 73 (7), 2360-2363 (2007).
- Katayama, T., et al. Glaciibacter superstes gen. nov., sp. nov., a novel member of the family Microbacteriaceae isolated from a permafrost ice wedge. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 59, 482-486 (2009).
- Waldrop, M. P., White, R., Douglas, T. A. Isolation and identification of cold-adapted fungi in the Fox Permafrost Tunnel, Alaska. Proc. Ninth Int. Conferen. Permafr. , 1887-1891 (2008).
- Douglas, T. A., et al. Biogeochemical and geocryological characteristics of wedge and thermokarst-cave ice in the CRREL Permafrost Tunnel. Alaska Permafr. Periglac. Process. 21 (2), 120-128 (2011).
- Willerslev, E., et al. Diverse plant and animal genetic records from Holocene and Pleistocene sediments. Science. 300 (5620), 791-795 (2003).
- Bellemain, E., et al. Fungal palaeodiversity revealed using high-throughput metabarcoding of ancient DNA from Arctic permafrost. Environ. Microbiol. 15 (4), 1176-1189 (2013).
- Steven, B., Pollard, W. H., Greer, C. W., Whyte, L. G. Microbial diversity and activity through a permafrost/ground ice core profile from the Canadian high Arctic. Environ. Microbiol. 10 (12), 3388-3403 (2008).
- Lorenzen, E. D., et al. Species-specific responses of Late Quaternary megafauna to climate and humans. Nature. 479 (7373), 359-364 (2011).
- Wilhelm, R. C., Radtke, K., Mykytczuk, N. C. S., Greer, C. W., Whyte, L. G. Life at the wedge: The activity and diversity of Arctic ice wedge microbial communities. Astrobiol. 12 (4), 347-360 (2012).
- Sheriden, P. P., Miteva, V. I., Brenchley, J. E. Phylogenetic analysis of anaerobic psychrophilic enrichment cultures obtained from a Greenland glacier ice core. Appl. Environ. Microbiol. 69 (4), 2153-2160 (2003).
- Rivkina, E., et al. Biogeochemistry of methane and methanogenic archaea in permafrost. FEMS Microbiol. Ecol. 61 (1), 1-15 (2007).
- Juck, D. F., et al. Utilization of fluorescent microspheres and a green fluorescent protein-marked strain for assessment of microbiological contamination of permafrost and ground ice core samples from the Canadian High Arctic. Appl. Environ. Microbiol. 71 (2), 1035-1041 (2005).
- Griffiths, R. I., Whiteley, A. S., O'Donnell, A. G., Bailey, M. J. Rapid method for coextraction of DNA and RNA from natural environments for analysis of ribosomal DNA- and rRNA-based microbial community composition. Appl. Environ. Microbiol. 66 (12), 5488-5491 (2000).
- Töwe, S., et al. Improved protocol for the simultaneous extraction and column-based separation of DNA and RNA from different soils. J. Microbiol. Methods. 84 (3), 406-412 (2011).
- Nadkarni, M. A., Martin, F. E., Jacques, N. A., Hunter, N. Determination of bacterial load by real-time PCR using a broad range (universal) probe and primers set. Microbiol. 148, 257-266 (2002).
- Takai, K., Horikoshi, K. Rapid detection and quantification of members of the archaeal community by quantitative PCR using fluorogenic probes. Appl. Environ. Microbiol. 66 (11), 5066-5072 (2000).
- Fogel, G. B., Collins, C. R., Brunk, C. F. Prokaryotic genome size and SSU rDNA copy number: Estimation of microbial relative abundance from a mixed population. Microb. Ecol. 38, 93-113 (1999).
- Bodilis, J., Nsigue-Meilo, S., Besaury, L., Quillet, L. Variable copy number, intra-genomic heterogeneities and later transfers of the 16S rRNA gene in Pseudomonas. PLOS One. 7, e35647 (2012).
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
- Sellmann, P. V. Geology of the USA CRREL permafrost tunnel, Fairbanks, Alaska. US Army Cold Reg. Res. Eng. Lab. Technical Rep. 199. , New Hampshire. (1967).
- Sellmann, P. V. Additional information on the geology and properties of materials exposed in the USA CRREL permafrost tunnel. US Army CRREL Special Rep. , (1972).
- Christner, B. C., Mikucki, J. A., Foreman, C. M., Denson, J., Priscu, J. C. Glacial ice cores: A model system for developing extraterrestrial decontamination protocols. Icarus. 174 (2), 572-584 (2005).
- Mackelprang, R., et al. Metagenomic analysis of a permafrost microbial community reveals a rapid response to thaw. Nature. 480 (7377), 368-371 (2011).
- Champlot, S., et al. An efficient multistrategy DNA decontamination of PCR reagents for hyper sensitive PCR applications. PLoS One. 5 (9), e13042 (2010).
- Yergeau, E., Hogues, H., Whyte, L. G., Greer, C. W. The functional potential of high Arctic permafrost revealed by metagenomic sequencing, qPCR, and microarray analyses. The ISME J. 4 (9), 1206-1214 (2010).
- Welzl, G., Schloter, M. Bacterial community structure in soils of the Tibetan Plateau affected by discontinuous permafrost or seasonal freezing. Biol. Fertil. Soils. 50 (3), 555-559 (2014).
- Vishnivetskaya, T. A., et al. Commercial DNA extraction kits impact observed microbial community composition in permafrost samples. FEMS Microbiol. Ecol. 87 (1), 217-230 (2014).
- Wagner, D., Kobabe, S., Liebner, S. Bacterial community structure and carbon turnover in permafrost-affected soils of the Lena Delta, northeastern Siberia. Can. J. Microbiol. 55 (1), 73-83 (2009).
- Jiang, N., et al. Characteristic microbial communities in the continuous permafrost beside the bitumen in Qinghai-Tibetan Plateau. Environ. Earth Sci. 74, 1343-1352 (2015).
