Menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) hebben de intrinsieke vermogen om onderscheid te maken en zichzelf organiseren in verschillende weefsel patronen; hoewel dit vereist de presentatie van ruimtelijke milieu-hellingen. Wij presenteren stencil micropatterning als een eenvoudige en robuuste methode om biochemische en mechanische gradiënten genereren voor het besturen van HPSC differentiatie patronen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Stencil micropatterning van menselijke pluripotente stamcellen voor Probing ruimtelijke organisatie van Differentiatie Fates
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Menselijke pluripotente stamcellen (hPSC's), inclusief embryonale stamcellen en geïnduceerde pluripotente stamcellen, hebben de intrinsieke capaciteit om zich te differentiëren in alle drie de kiembladen. Dit maakt ze een aantrekkelijke celbron voor regeneratieve geneeskunde en experimentele modellering van normale en zieke organogenese. Echter, de differentiatie van hPSC's in vitro is heterogeen en ruimtelijk ongeordend. Technologieën voor celmicropatterning bieden mogelijkheden om de micro-omgeving van stamcellen ruimtelijk te controleren en de resulterende differentiatiebestemmingen te organiseren. Micropatterning van hPSC's moet rekening houden met de strenge vereisten voor overleving en onderhoud van hPSC's. Hier beschrijven we stencil micropatterning als een methode die zeer compatibel is met hPSC's. hPSC micropatterns worden gespecificeerd door de geometrieën van de cell stencil doorgangen, die fysiek bepalen waar hPSC's toegang kunnen krijgen en zich kunnen hechten aan het onderliggende met extracellulair matrix gecoate substraat. Vanwege deze werkingswijze is er meer flexibiliteit om substraten te gebruiken die hPSC's adequaat kunnen ondersteunen in vergelijking met andere celmicropatterning methoden. We benadrukken ook kritische stappen voor het succesvol genereren van hPSC micropatterns. Als voorbeeld laten we zien dat stencil micropatterning van hPSC's kan worden gebruikt om de ruimtelijke polarisatie van cel-cel en cel-matrix adhesies te moduleren, wat op zijn beurt de mesoendoderm differentiatiepatronen bepaalt. Deze eenvoudige en robuuste methode voor het micropatterning van hPSC's vergroot de mogelijkheden om experimentele modellen op te zetten voor onderzoek naar weefselorganisatie en patterning tijdens vroege embryonale ontwikkeling.
Inleiding
Menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs), waaronder embryonale stamcellen (hESCs) en geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs), wordt gebruik moeten regeneratieve geneeskunde en experimentele modellering van normale en zieke organogenese vanwege hun differentiatie potentieel in cellijnen van drie kiem lagen 1,2. De differentiatie lot van hPSCs zijn zeer gevoelig voor lokale omgevingsfactoren die autocriene of paracriene signalen 1 en mechanotransductie processen gemedieerd door fysische signalen 3-5 kunnen moduleren. Micropatterning cel omvat een reeks technieken die zijn ontwikkeld om ruimtelijk organiseren van de geometrie en ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
LET OP: Dit protocol beschrijft de fabricage van PDMS stencil met 1000 micrometer patronen door lasersnijden en micropatterning van de hESC lijn, H9 met behulp van de PDMS stencil.
1. Ontwerp en fabricatie van PDMS Stencil voor micropatterning
- Ontwerp de sjabloneren blad met doorgaande gaten van de gewenste geometrie en grootte (bijvoorbeeld 1000 micrometer cirkels) en de pakking stencil met behulp van computer-aided design software 10.
- Laser-snijd de sjabloneren blad en pakking op 120-150 pm en 2 mm dik polydimethylsiloxaan (PDMS) bladen respectievelijk met behulp van een CO 2 laser-cut....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In dit artikel beschrijven we de fabricage van een cel sjabloon met behulp van een laser cutter om 1000 urn functies te genereren. Het sjabloon bestond uit 2 delen: een dunne plaat sjabloneren (ongeveer 100-200 micrometer dik) die de micropattern doorgaande gaten en een PDMS pakking om de ECM bekledingsoplossing of celsuspensie bevatten. Hier werden 127 pm en 2 mm dik handel verkrijgbare PDMS platen respectievelijk gebruikt als sjabloneren plaat en pakking. Andere werkwijzen voor het ber.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Fabricage van micropatterning stencils
Stencil micropatterning biedt een ideale methode om HPSC micropatterns te genereren voor het onderzoeken van niche-gemedieerde differentiatie patronen. Het belangrijkste voordeel van stencil patronen micropatterning boven andere technieken, zoals microcontactprinten en photopatterning, is dat het niet oppervlaktemodificatie vereist en kan worden uitgevoerd op conventionele TCPS substraten. Daarom kan geoptimaliseerd kweekmedium.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
Dit werk wordt ondersteund door NUS Start subsidie (R-397-000-192-133) en ETPL Gap Fund (R-397-000-198-592). GS is een NUS Research geleerde. Auteurs willen bedanken Dr. Jiangwa Xing voor haar technische ondersteuning op de mobiele micropatterning.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 2 mm dikke PDMS-plaat | Specialty Silicone Products Inc., USA | SSPM823-.005 | Gebruikt om reservoir voor stencil te vormen |
| 120-150 μm dikke PDMS-plaat | Specialty Silicone Products Inc., USA | SSPM823-.040 | Gebruikt om stencil te vormen |
| 60 mm Petri-schaal | Nunc Nunclon Delta | 150326 | Substraat voor micropattering |
| Accutase | Accutase, Merck Millipore, Singapore | SCR005 | Enzym om H9 cellen in enkele cellen te breken |
| Activine | R&D Systems, Singapore | 338-AC-010 | Groeifactor voor H9 differentiatie |
| BMP4 | R&D Systems, Singapore | 338-BP-010 | Groeifactor voor H9 differentiatie |
| Plasma systeem | Femto Science, Korea | CUTE-MP | Voor plasma oxidatie van stencil |
| Dispase | StemCell™ Technologies, Singapore | 7923 | Enzym gebruikt om de cel-ECM-adhesie tijdens passagering te verzwakken |
| DMEM/F12 | GIBCO, USA | 11330032 | Basismedium voor H9 cellen |
| FGF2 | R&D Systems, Singapore | 233–FB–025 | Groeifactor voor H9 differentiatie |
| H9 cellijn | WiCell Research Institute, Inc., USA | WA09 | Menselijke embryonale stamcellen |
| hESC-gekwalificeerde basement membraan matrix | Matrigel, BD Biosciences, Singapore | 354277 | Extracellulaire matrix coating om de groei van H9 cellen te ondersteunen |
| Inverteer microscoop | Leica Microsystems, Singapore | DMi1 | Voor het vastleggen van helderveldbeelden |
| Laser snijder | Epilog Helix 24 Laser System | Gebruikt om doorlopende gaten in PDMS-plaat te genereren | |
| mTeSR™1 medium | StemCell™ Technologies, Singapore | 5850 | Onderhoudsmedium voor H9 cellen |
| PDMS | SYLGARD® 184, Dow Corning Co., USA | 3097358-1004 | Gebruikt voor het bevestigen van de PDMS stencil en reservoir |
| ROCKi Y27632 | Calbiochem, Merck Millipore, Singapore | 688000 | Houdt H9 cellen als enkele cellen |
| STEMdiff™ APEL™ medium | StemCell™ Technologies, Singapore | 5210 | Differentiatiemedium voor H9 cellen |
| Polyethyleen tereftalaat film | SureMark Singapore | SQ-6633 | Gebruikt om stencil te vormen |
| Celcultuur compatibele niet-ionische oppervlakteactieve stof | Pluronic acid F-127, Sigma, Singapore | P2443 | Passiveringsreagens om celadhesie op niet-micropatterende substraten af te stoten |
Referenties
- Graf, T., Stadtfeld, M. Heterogeneity of embryonic and adult stem cells. Cell Stem Cell. 3 (5), 480-483 (2008).
- Nishikawa, S., Goldstein, R. A., Nierras, C. R. The promise of human induced pluripotent stem cells for research and therapy. Nat Rev Mol Cell Biol. 9....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
