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方法文章

位点定向自旋标记与五聚体配体门控离子通道的电子顺磁共振光谱研究

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DOI：

10.3791/54127

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2016年7月4日

 ,  , 
1Department of Physiology and Biophysics, Case Western Reserve University, 2School of Medicine, Case Western Reserve University

本文内容

摘要

本文介绍了用于电子顺磁共振研究的五聚体配体门控通道的定点自旋标记和重组方法。该方案可适用于任何膜蛋白。此处描述的重组方法也可用于在特定脂质体系中进行宏观和单通道电流的膜片钳测量。

摘要

离子通道门控是由刺激驱动的蛋白质运动协调过程，可导致通道在关闭态、开放态和失敏态之间发生构象转变。这些转变的基础在于蛋白质固有的柔性，而这种柔性受到膜脂质组成的关键调控。为了更好地理解通道功能的结构基础，有必要在生理性的膜环境中研究蛋白质的动力学行为。电子顺磁共振（EPR）波谱技术是表征功能状态之间构象转变的重要工具。与核磁共振（NMR）和X射线晶体学相比，EPR所提供的信息本质上分辨率较低。然而，与其他技术不同的是，EPR对蛋白质的分子量没有上限要求，样品需求量显著更少，更重要的是，蛋白质不受晶体晶格力的限制。因此，EPR特别适用于研究大型蛋白质复合物以及在重建体系中的蛋白质。本文将以一种来自Gloeobacter violaceus（GLIC）的原核质子门控五聚配体门控离子通道（pLGIC）为例，介绍位点特异性自旋标记和膜重建的一般实验方案。本文将描述稳态连续波（CW）和脉冲式（双电子-电子共振，DEER）EPR技术的联合应用，以实现对通道动力学的全面定量表征。

引言

在过去十年中，由于获得了该家族多个成员的大量高分辨率结构，人们对五聚体配体门控离子通道（pLGIC）的结构理解取得了突飞猛进的发展。推动该领域当前进展的关键因素包括：原核生物pLGIC通道的发现1-3、真核膜蛋白表达方面的重大进展4-6，以及结构解析方法的巨大突破7。这些结构清晰地揭示了pLGIC三维结构整体上的保守性。然而，目前仍有两个主要方面相对滞后，即这些通道样品的功能表征以及通道功能的机制性描述。

门控构象变化十分复杂，沿通道长度方向可跨越60 Å的距离，且这些转变过程受到膜脂的广泛调控。特别是，阴离子脂质、胆固醇和磷脂已被证明可调节pLGIC的功能8-11。尽管这些脂质成分在通道功能中的确切作用仍不清楚，但要全面理解门控的分子机制，必须在通道的天然环境中对其进行研究。定点自旋标记（Site-Directed Spin Labeling, SDSL）和电子顺磁共振（Electron Paramagnetic Resonance, EPR）波谱技术是研究重建体系中蛋白质动态特性的首选方法。EPR波谱技术不受分子尺寸（如核磁共振NMR）或样品光学性质（如荧光光谱）的限制，因此能够在天然脂质条件下对全长蛋白进行检测。该技术具有极高的灵敏度，且样品需求量极低（在皮摩尔量级）。这两个优势使该技术特别适用于研究难以大量表达（超过毫克量级）的大型膜蛋白。

电子顺磁共振（EPR）波谱技术结合定点自旋标记方法由Wayne Hubbell及其同事开发，现已适用于多种蛋白质类型的研究。12-24 EPR数据已被用于研究蛋白质的二级结构、构象变化、膜插入深度以及蛋白质-蛋白质/蛋白质-配体相互作用。

该方法通过定点突变在目标位点引入半胱氨酸替换。为确保位点特异性标记，需将天然存在的半胱氨酸替换为其他氨基酸例如，丝氨酸）以构建无半胱氨酸的模板。迄今为止，最常用的自旋标签是巯基特异性的MTSL：（1-氧基-2,2,5,5-四甲基-Δ3-吡咯啉-3-甲基）甲烷硫代磺酸酯，该标签通过二硫键桥与蛋白质连接。由于其高度特异性、相对较小的尺寸（略大于色氨酸）以及连接区的柔韧性，该自旋标签即使在深埋的半胱氨酸位点也表现出优异的反应活性。此外，为了最大化反应效率，蛋白质的标记反应在去污剂溶解的形式下进行。通过尺寸排阻色谱去除过量未结合的自旋标签后，将蛋白质重组至具有明确脂质组成的脂质体或双层膜模拟系统中。通常情况下，半胱氨酸突变在蛋白质的大多数区域均可良好耐受，且自旋探针相对较小的体积对蛋白质的二级和三级结构扰动极小。为确保修饰后的蛋白质保留野生型功能，可通过膜片钳测量技术对标记并重组后的通道蛋白进行功能研究。

标记的功能蛋白随后进行光谱测量，这些测量主要提供三种信息：12,14,15,20,22,23,25-27 通过线型分析获得的自旋探针动力学信息；探针对顺磁性弛豫试剂的可及性；以及距离分布。27 电子顺磁共振（EPR）距离可通过两种不同方法测定。第一种基于连续波（CW）技术，利用自旋标记物之间偶极相互作用引起的谱线展宽（距离范围为 8 - 20 Å）来确定距离。28,29 第二种为脉冲式EPR方法，可将距离测量范围扩展至70 Å。30-34 在双电子-电子共振（DEER）技术中，通过分析自旋回波幅度的振荡来确定距离及距离分布。在此过程中，自旋回波受到偶极相互作用频率的调制。综合这些参数，可用于确定蛋白质拓扑结构、二级结构元件以及蛋白质构象变化。

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方案

1. 定点突变与半胱氨酸突变

  1. 克隆与定点突变
    注意：GLIC 野生型（wt）35 含有一个天然半胱氨酸（C27），该位点被突变为丝氨酸以构建无半胱氨酸背景。在无半胱氨酸背景上，通过携带目标位置半胱氨酸密码子的引物进行定点突变，引入半胱氨酸突变36。
    1. 将 5 μl 10x 反应缓冲液、1 μl 浓度为 100 ng/μl 的无半胱氨酸 GLIC 模板 DNA35、正向和反向引物（各 0.5 μl，浓度 40 μM）36、1 μl dNTPs（100 mM）以及 41 μl 去离子水混合。用移液器反复吹打数次以充分混匀，短暂离心（6,000 rpm），最后加入 1 μl DNA 聚合酶。
    2. 将热循环仪设置为以下程序：
      1. 95 ºC 变性 4 分钟。
      2. 95 ºC 变性 30 秒。
      3. 55 ºC 退火 1 分钟。
      4. 68 ºC 延伸 10 分钟（约每 kb 质粒长度延伸 1 分钟）。
      5. 重复步骤 1.1.2.2 至 1.1.2.4 共 18 个循环。
      6. 最终在 68 ºC 延伸 10 分钟。
      7. 4 ºC 保存
        注意：退火温度根据引物的 Tm 值计算确定。
    3. 向反应体系中加入 1 μl DpnI 酶，通过移液充分混匀，短暂离心（6,000 rpm）1 分钟。在 37 °C 下孵育 2 小时。
  2. 转化
    1. 将 E. coli 感受态细胞置于冰上解冻。取 30 μl 细胞分装至 14 ml 无菌转化管中，加入 1 μl 消化后的 DNA。轻敲管壁混匀。冰上孵育 20 分钟。
    2. 将转化管置于 42 ºC 水浴中 45 秒，随后立即放回冰上静置 2 分钟。加入 400 μl 无菌 SOC 培养基，在 37 ºC 摇床培养箱中振荡培养 1 小时。
    3. 取 100 μl 菌液涂布于含有卡那霉素（50 μM）和 1% 葡萄糖的 LB 平板上。于 37 ºC 过夜培养。
    4. 从平板上挑取单克隆菌落，接种至含 LB/卡那霉素培养基的 5 ml 液体培养基中，37 ºC 摇床过夜培养（约 16 小时）。
    5. 通过质粒小提试剂盒37从过夜培养物中提取质粒 DNA。使用分光光度计测定 260 nm 波长处的吸光度以定量 DNA 产量，浓度应约为 100 - 200 ng/μl。通过标准的重组 DNA 测序策略确认突变的存在38,39。

2. GLIC 的表达与纯化

  1. 转化
    1. 按照第1.2节中描述的步骤进行转化 30 μl C43 感受态细胞的 1 μl （约100 - 200 ng/μl) 含有编码GLIC基因及人鼻病毒（HRV）-3C蛋白酶切割位点的质粒（有关质粒和基因序列，请参见补充文本） 35 （从步骤 1.2.5 开始）。
    2. 培养皿 100 μl 含1%葡萄糖的LB-琼脂平板上的细胞 50 μg/ml 卡那霉素，并在37 ºC培养箱中孵育过夜（约16小时）。
    3. 肉眼观察菌落，确保菌落未过度生长且无卫星菌落出现。立即用封口膜密封培养皿，并于4 ºC保存。
  2. 过夜培养物的建立与培养基的制备
    1. 使用接种环挑取单个分离菌落，转移至含有20 ml添加无菌1%葡萄糖的Luria肉汤（LB）培养基的100 ml无菌烧瓶中 50 μg/ml 卡那霉素。在37 ºC、250 rpm条件下振荡培养过夜（约16小时）。
    2. 高压灭菌 900 ml 超丰富肉汤（TB）培养基 （参见培养基与缓冲液成分） 在2.8 L Fernbach玻璃烧瓶中进行细菌培养，于121 ºC高压蒸汽灭菌20分钟。
  3. 建立大规模培养物
    1. 加入100 ml无菌磷酸钾缓冲液 （参见培养基与缓冲液成分） 至已灭菌的 TB 培养基中。加入无菌葡萄糖（终浓度 0.2%）、卡那霉素（50 μg/ml），以及10 ml过夜培养物。在37 ºC、250 rpm条件下振荡培养。
    2. 在 600 nm 波长处检测光密度（OD600使用密度计或分光光度计每小时监测一次，直至 OD 达到 0.5（约 2 小时）。此时将摇床转速降至 150 rpm，并将温度降低至 18 ºC。继续监测 OD600 每30分钟一次，直至达到0.8（约1小时）。
    3. 加入50 ml甘油，并继续振荡培养直至OD600 达到1.0 - 1.2（约15 - 30分钟）。
      注意：在此条件下，培养物从 37 ºC 降至 18 ºC 约需 1 小时。必须在培养物冷却至 18 ºC 后再加入甘油。
    4. 诱导细胞 200 μM IPTG（异丙基-硫代-β-半乳糖苷）并调回摇床转速至250 rpm，于18 ºC继续孵育约16小时。
  4. 蛋白质纯化
    1. 确保 OD600 16小时结束时，OD600值约为16-18。将细胞收集至1.0 L离心瓶中，在4.0 ºC、8,500 x g条件下离心15 min。倾去上清液，称量装有细胞沉淀的离心瓶重量。通过从总重量中减去空瓶重量，计算细胞沉淀的重量。
      注意：预期的细胞沉淀重量为约 30 - 35 g/L。但需注意，最终 OD 值可能存在差异。600 不同突变株间的细胞沉淀物重量
    2. 将细菌沉淀重悬于每1.0 L培养物加入150 ml的预冷Buffer A（100 mM NaCl，20 mM Tris，pH 7.4）中。加入DNase I（100 μg/ml）以及蛋白酶抑制剂（苯基甲基磺酰氟（1 mM）、亮抑蛋白酶素（2.0 μg/ml），抑肽酶（2.0 μg/ml）和 pepstatin A（1 μg/ml)).
    3. 在4.0 °C冷室中，通过细胞破碎仪对细胞进行匀浆处理。重复该步骤三次，以确保大部分细菌被裂解。在14,000 × g条件下离心15分钟，用移液器吸取上清液并转移至洁净的离心管中。弃去沉淀物，其中含有未裂解的细胞和包涵体。
    4. 将上清液在 168,000 x g 条件下离心 1 小时。小心倾倒去除上清液，避免扰动膜沉淀物。
    5. 将1 L培养液的膜沉淀合并，用缓冲液A（添加10%甘油）重悬至终体积50 ml。向膜悬液中加入0.5 g正十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM），4.0 ºC下振荡孵育2小时。
    6. 膜溶解后，将裂解液在168,000 x g离心1小时以去除细胞碎片。同时准备淀粉树脂。用移液器将3 ml树脂转移至一个空的聚丙烯层析柱中。用10倍柱体积的水洗涤树脂3次，随后用含0.5 mM DDM的缓冲液A洗涤10倍柱体积。
    7. 离心后，用移液器小心吸取上清液，并转移至一支洁净的50 ml锥形管中。进行分批结合时，向锥形管中加入预先平衡的淀粉树脂。将混合物在4.0 ºC下旋转孵育2小时，使提取的蛋白质与淀粉树脂结合。
    8. 将全部浆液通过层析柱，并收集穿流液。随后将所收集的全部穿流液再次通过树脂，以最大化结合。
    9. 用缓冲液A（含0.5 mM DDM、0.5 mM 三(2-羧乙基)膦（TCEP）和1 mM 乙二胺四乙酸（EDTA））冲洗10个柱体积，以去除未结合的蛋白质。
    10. 用含有40 mM麦芽糖、0.5 mM DDM和0.05 mM TCEP的10 ml Buffer A洗脱GLIC蛋白。TCEP可防止半胱氨酸侧链氧化。收集全部洗脱液。
    11. 使用离心浓缩器（分子量截断值 = 50 kDa）将洗脱的蛋白浓缩至 4 - 6 mg/ml，并加入 HRV-3C 蛋白酶（200 μg 每10 mg蛋白加入，并在4.0 ºC下孵育过夜。
      注意：通过 SDS-PAGE 凝胶电泳检测样品以确认蛋白酶消化是否完成（参见步骤 2.5.5 及 图1).
  5. 位点定向自旋标记
    1. 制作大约 100 μl 200 mM 储液的 (1-氧基-2,2,5,5-四甲基-Δ3-吡咯啉-3-甲基) MTSL 40 在 DMSO 中，并将储备液于 -20 ºC 保存 25 μl 等分试样
    2. 将蛋白酶消化后的样品用于MTSL自旋标记。加入10倍摩尔过量的MTSL自旋标记物（GLIC单体与MTSL的摩尔比为1:10），冰上孵育1小时。再加入第二轮自旋标记物，摩尔过量比例为5倍，继续孵育1小时。
      注意：对于埋藏位点（自旋标记效率较低）， 如下所述)，加入30倍摩尔过量的自旋标记物，蛋白质在其中孵育6小时。
    3. 将样品通过预先用缓冲液A和0.5 mM DDM平衡的尺寸排阻快速蛋白液相色谱（FPLC）柱，以分离切割后的MBP、过量游离自旋标记物与GLIC五聚体。收集1 ml组分，共洗脱30 ml。合并含有GLIC五聚体的组分（图1）。按照制造商的说明运行FPLC。
    4. 使用分光光度计在280 nm波长下测定吸光度，以确定样品浓度。GLIC单体的摩尔消光系数和估计分子量分别为49,850 M⁻¹cm⁻¹和30,000。-1 cm-1 分别为 36,380 Da。使用离心浓缩器（分子量截留值 = 50 kDa）将蛋白质溶液浓缩至终浓度约为 8–10 mg/ml，并置于冰上。样品现可进行重组。
    5. 作为确保制备样品生化均一性的额外质量检测步骤，进行含还原剂（1.0% β-巯基乙醇）的SDS-PAGE凝胶电泳。
      注意：考马斯亮蓝染色凝胶应显示一条大小约为33 kDa的单一条带，对应于GLIC单体（图1).
    6. 对于疑似表现出偶极展宽的自旋标记突变体，在存在抗磁性标记的情况下对样品进行欠标记 41将洗脱的蛋白质与0.1倍量的MTSL孵育，在冰上孵育1.0小时。随后，加入20倍摩尔过量的抗磁性标签（1-乙酰氧基-2,2,5,5-四甲基-Δ3-吡咯啉-3-甲基）甲烷硫代磺酸盐。
      注意：此处使用的抗磁性试剂与顺磁性标记物具有相同的立体结构，并采用相同的标记化学方法。
    7. 将样品置于冰上孵育2小时。将样品通过尺寸排阻色谱柱，该色谱柱已如步骤2.5.3所述，用缓冲液A和0.5 mM DDM预平衡。
  6. 自旋标记效率
    1. 自旋标记效率定义为自旋标签浓度与半胱氨酸侧链（GLIC-单体）浓度的比值。为测定样品的自旋标记效率，将通过标准品校准曲线，将样品的积分强度与已知浓度的标准品进行比较。配制一系列浓度（10 - 250 μM) 通过溶于水。
    2. 测量每种溶液的EPR信号，并确定每种浓度下信号曲线下的面积（对EPR信号进行双重积分，如步骤6.1所述）。通过将测得的面积对TEMPO浓度作图，并以直线拟合，绘制校准曲线。
      注意：与峰-峰强度相比，一次导数EPR信号下的面积能更准确地描述谱图强度。对一次导数EPR信号进行积分可得到吸收谱，再次积分则可获得吸收谱下的面积（该面积与自旋浓度成正比）。应确保谱图的低场区和高场区均具有稳定的基线。
    3. 使用分光光度计（如步骤2.5.4所述）测定去垢剂中自旋标记蛋白的浓度。随后测量样品的EPR信号，并按照第6.1节中的步骤确定EPR信号双重积分的面积。利用校准曲线，确定与测得的EPR信号相对应的标记物浓度。通过计算自旋标记物浓度与蛋白浓度的摩尔比，得出自旋标记效率。

3. GLIC 在 Asolectin 膜中的重建

  1. 脂质体的制备
    1. 用 5 ml 氯仿冲洗一个洁净的 25 ml 圆底烧瓶，并在通风橱中用 N2 气流吹干烧瓶。将 10 mg 的asolectin（大豆极性提取物，氯仿中 25 mg/ml 储存液）转移至烧瓶中，并在持续的 N2 气流下干燥脂质。
      注意：用于重组的脂质选择基于第 4 节实验的结果。
    2. 待氯仿完全蒸发后，将烧瓶置于真空环境中 1 小时以确保脂质彻底干燥。向干燥的脂质中加入 1 ml 重悬缓冲液 A，剧烈涡旋使脂质沉淀充分悬浮。
    3. 为制备小单层囊泡，将脂质悬浮液在低温水浴超声仪中进行超声处理，直至囊泡溶液变得基本透明且无可见团块（约 10–15 分钟）。向此混合液中加入 DDM 至终浓度为 4 mM，并在室温下孵育 30 分钟。
  2. 重组
    1. 将步骤 2.5.4 中纯化的蛋白加入脂质混合物中。
      注意：蛋白与脂质的比例取决于实验类型。对于宏观电流测量，使用 1:10,000 的比例；对于 EPR 研究，则采用更高的蛋白/脂质比例（1:2,500），以最大化信号强度。已有研究表明，在这些浓度下未观察到侧向聚集42。
      注意：EPR 实验中 GLIC 的典型工作用量约为 1 mg，尽管根据所探测位点的不同，更低的用量也可能有效。
    2. 将样品在 4 ºC 下轻轻旋转孵育 1 小时，然后用缓冲液 A 将样品稀释至 15 ml。
      注意：此步骤使去垢剂浓度降至临界胶束浓度（CMC）以下。
    3. 通过加入聚苯乙烯珠（具有可吸附去垢剂的疏水孔）去除悬浮液中残留的去垢剂。加入 80 mg 干燥的珠子，并在 4 ºC 下于摇床上孵育脂质体悬浮液过夜.
      1. 为准备珠子的使用，称取约 100 mg 并转移至 50 ml 锥形管中。加入 10 ml 甲醇，剧烈震荡，以 8,000 × g 离心 2 分钟，倾去甲醇。重复此甲醇洗涤步骤三次。随后用 30 ml 去离子水以相同方式洗涤三次。
    4. 次日，使用柱式滤器将脂质体转移至 25 ml 超速离心管中以去除珠子，并进一步将样品稀释至 25 ml。在 168,000 × g 下离心 2 小时。弃去上清液，用 100 μl 缓冲液 B 重悬沉淀。

4. 通过FRET确定重组的最适脂质组成

  1. 采用基于荧光共振能量转移（FRET）的检测方法，确定能够维持蛋白质单分散状态的膜组成。
  2. 按照第2节所述步骤纯化带有天然半胱氨酸（C27）的wt GLIC。根据第2.5节的操作步骤，以10:1（标记物/单体）的摩尔比，使用荧光素马来酰亚胺或四甲基罗丹明马来酰亚胺对蛋白质进行标记。
  3. 按照第3.2节的重建步骤，为每种待测脂质组成制备三种不同的样品：第一种，以1:1,500（五聚体:脂质）的摩尔比将荧光素标记的GLIC重建；第二种，以1:1,500（五聚体:脂质）的摩尔比将罗丹明标记的GLIC重建；第三种，将去污剂溶解的荧光素标记和罗丹明标记的GLIC按1:1摩尔比混合，并以1:750（五聚体:脂质）的比例进行重建。
    注意：我们使用了三种脂质体系：asolectin、POPC:POPG（3:1摩尔比）以及E. coli极性提取物。FRET实验中的蛋白-脂质重建比例高于EPR测量所用比例（FRET为1:750，而EPR研究中为1:1,500）。
  4. 将脂质体悬浮液稀释（以减少光散射信号；约5 μl加入995 μl缓冲液A中），然后用移液器将样品加入石英比色皿，并置于荧光分光光度计中。
  5. 将激发波长设定为490 nm（对应于供体荧光素的吸收最大值）。根据仪器说明书，记录500 nm至660 nm范围内的发射光谱。
    注意：对于荧光素标记的GLIC样品，将在518 nm处观察到一个峰（对应于荧光素发射），而在572 nm处无峰（对应于罗丹明发射）；对于罗丹明标记的GLIC样品，在518 nm处无峰，但在572 nm处会出现一个峰，这是由于在490 nm激发下罗丹明的直接激发所致；对于同时含有荧光素和罗丹明标记的样品，若荧光素峰强度降低，同时罗丹明峰强度相应升高，则表明存在FRET信号，这可能是蛋白质在膜上发生侧向聚集的指示。
  6. 在不同时间间隔（0–24小时）监测572 nm处罗丹明发射的强度变化，前6小时每小时记录一次，之后记录过夜（O/N）孵育后的结果（图2）。在每个时间点，分别测量572 nm处的荧光强度（对应罗丹明：Ia）和518 nm处的荧光强度（对应荧光素：Id）。从Ia中扣除直接激活罗丹明的贡献（即步骤4.3中的样品2）得到校正后的Ia（Iac）。计算FRET比值为Iac/(Iac + Id)。比较不同时间点及不同脂质组成下的FRET值。
    注意：作为对照，对去污剂溶解的样品执行步骤4.5和4.6，并将其发射光谱与重建脂质体的光谱进行比较。使用去污剂中等摩尔比的标记蛋白混合物（如步骤4.3所述），用补充了0.5 mM DDM的缓冲液A稀释。预期去污剂样品的FRET信号极弱。

5. 膜片钳记录法进行功能测量

  1. 以与EPR研究（第3.1节）完全相同的方式制备用于膜片钳测量的蛋白脂质体。
    注意：然而，应根据所进行的测量类型（单通道记录与宏观电流记录）调整蛋白:脂质比例。将蛋白脂质体在液氮中快速冷冻，并于-80 ºC保存直至使用。通常，为获得宏观电流，GLIC的蛋白:脂质摩尔比为1:10,000；单通道记录则采用1:50,000的摩尔比。
  2. 将脂质体置于冰上解冻。用去离子水和乙醇冲洗干净的玻璃载片，并彻底干燥。取10 μl蛋白脂质体溶液滴加于载片中央，在4 oC真空干燥器中过夜干燥。
  3. 通过加入20 μl缓冲液B（150 mM NaCl，10 mM HEPES，pH 7.0）重新水化干燥的蛋白脂质体，并将载片放置于培养皿中，置于湿润滤纸上。盖上培养皿，使再水化过程持续约2小时。
    注意：此过程可形成适合进行膜片钳记录的巨大多层脂质体。
  4. 使用拉管仪按照制造商推荐设置，从薄壁硼硅酸盐玻璃毛细管（尖端直径约1 - 2 μm）中拉制膜片钳电极。使用火焰抛光装置加热抛光，使其在填充缓冲液B时电阻达到1.5 - 2 MΩ。
  5. 用移液器将缓冲液B加入记录浴槽中，并连接Ag/AgCl接地电极。使用2 μl移液器吸头轻轻将脂质体从边缘刮下，并转移1 μl悬液至记录浴槽中。静置数分钟，使脂质体沉降至底部。
  6. 使用非金属注射器针头将缓冲液B注入膜片钳电极中，并将其安装至放大器头阶段。选择一个孤立的单个囊泡进行封接。施加轻微正压以防止电极堵塞，并将电极尖端插入记录浴槽中。
  7. 施加测试脉冲以测量电极电阻，并补偿电极电压偏移。接近囊泡，当接触后，施加轻微负压，轻柔地将囊泡拉向膜片钳电极，以形成吉欧姆级密封（gigaohm seal）。
  8. 在整个过程中持续监测电极电阻。一旦形成吉欧姆级密封，小心地将电极从脂质体上撤回，以形成内面向外（inside-out）膜片。关闭测试脉冲。
  9. 将保持电位设为-100 mV，并施加pH脉冲。低pH溶液使用10 mM柠檬酸钠缓冲液C（150 mM NaCl，10 mM柠檬酸，pH 3.0）配制。（图3）
    注意：宏观电流记录的采样频率为10 kHz，单通道记录为40 kHz。

6. EPR 测量

  1. 连续波电子顺磁共振波谱法
    1. 将3.2步骤中的脂质体悬液转移至 200 μl 用离心机离心样品，收集沉淀。弃去上清液，样品即可用于EPR测量。
      注意：进行电子顺磁共振（EPR）测量时，应尽可能去除脂质体样品中的缓冲液。因为水相样品会吸收微波的电场部分，导致发热并降低检测灵敏度。
    2. 为进行缓冲液置换，转移 20 μl 用移液器将脂质体沉淀转移至微量离心管中。加入 180 μl 加入缓冲液D（100 mM NaCl，10 mM 柠檬酸，pH 3.0），在42 ºC水浴中孵育5分钟。离心样品，用移液器移除上清液，并重复该步骤三次，以确保缓冲液完全置换。
      注：也可通过将样品进行多次冻融循环来实现缓冲液置换。
    3. 透气性塑料毛细管适用于光谱线型和溶剂可及性的测量。将毛细管轻敲在蛋白脂质体沉淀上，以吸入样品，并用骨蜡密封末端。
      注：典型样品体积约为 ~5 μl 且理想的自旋浓度为 150 μM如果仅需测量谱线形状，可使用外径为0.4 mm的石英毛细管。必要时，可使用移液器将样品装入毛细管内。
    4. 操作光谱仪
      1. 在配备介电谐振器的X波段波谱仪上，按照制造商说明书的指导，在室温（292 - 297 K）下进行连续波电子顺磁共振（CW-EPR）测量。
      2. 打开水冷机、电源和微波桥控制台。在开始记录前，让系统热平衡约30分钟。启动采集软件。
      3. 将样品管/毛细管插入谐振器中，确保装有样品的部分位于谐振器腔体的中心位置。根据光谱仪手册中的说明调节谐振器。
      4. 在微波入射功率为1.0 mW、调制频率为100 kHz、扫描宽度为100 G的条件下，通过磁场扫描记录一次导数吸收光谱。通过逐步开展功率饱和实验，测定实验所需的最佳功率；在该实验中，测量连续波电子顺磁共振（CW EPR）信号的一次导数峰-峰值高度随入射微波功率平方根的变化关系。
        注意：在较低微波功率下，只要自旋态的平衡布居未受影响，信号强度将与功率的平方根成正比增加。然而，若继续提高功率，自旋-晶格弛豫将无法维持两种自旋态之间的平衡布居差，导致信号幅度开始趋于平缓或发生“饱和”。超过该点后，由于自旋态布居反转，进一步增加观测功率反而可能导致信号幅度实际下降。此外，对于谱线展宽且具有显著拖尾、无法观察到明确平坦基线的谱图，应将扫描宽度扩展至150–200 G，以防止积分面积损失。
      5. 从使用1.0 G的调制幅度开始。
        注意：该值取决于样本，需进行调整以降低信号中的低频噪声。若使用过大的值，可能导致信号失真或展宽。
      6. 将时间常数和转换时间设为 20.48 msec，扫描时间为 20.97 sec，分辨率为 1024 点。
        注意：时间常数还取决于样品，需进行调整以滤除高频噪声。
      7. 首次扫描后，将中心场置于EPR信号的中心位置，并选择扫宽，使图谱包含信号及两侧足够的基线。
        注意：此外，为提高信噪比，可根据电子顺磁共振（EPR）信号的强度增加扫描次数。应包含扫场宽度和数据点数。
      8. 测量自旋标记对碰撞性弛豫剂 O 的可及性2 或使用功率饱和实验方案的乙二胺二乙酸（NiEDDA）27 步骤 6.1.4.4 中所述
        注意：按照先前所述方法制备NiEDDA 26.
      9. 首先用 N 灌注腔内的样本2 5 分钟（以冲洗出 O2）。以30 G的扫描宽度，测量5至35 dB之间每3 dB递增的各微波功率下的谱图。
      10. 然后用灌注液灌注腔内的样本 空气处理10分钟，并按照步骤6.1.4.9的方法，在不同微波功率下（5–35 dB，以3 dB为步长）测量谱图。
      11. 孵育 20 μl 脂质体沉淀的 180 μl 在42 ºC水浴中孵育50 mM NiEDDA（溶于缓冲液B或缓冲液D）5分钟。离心样品，用移液器吸除上清液。将样品加载至毛细管中，并放入谐振腔内。重复步骤6.1.4.9。
        注意：该实验的原理在于，通过海森堡自旋交换与顺磁性弛豫剂相互作用可防止信号饱和和种群反转。水溶性的NiEDDA和脂溶性的分子O₂2 分别用作报告蛋白质中水环境（包括主体水和蛋白质内部水腔）以及膜暴露位点的位置。
  2. 数据分析：
    注意：EPR 数据的分析包括以下步骤：14,22,23,25-27
    1. 计算自旋探针的迁移率（ΔHo-1），定义为第一导数吸收谱中心线宽的倒数。ΔHo-1 反映了探针的运动自由度或动力学特性。
    2. 计算可及性参数（П），该参数用于估算探针对其他顺磁性碰撞弛豫剂的可及性，具体步骤如下所述。
      注意：自旋探针与顺磁性弛豫试剂的相互作用会增强自旋-晶格弛豫速率（T1由海森堡自旋交换引起的硝酰基团的猝灭。27
      1. 根据在不同微波功率下测量电子顺磁共振（EPR）谱一阶导数中央谱线的垂直峰-峰值幅度的功率饱和实验（6.1.4.8），估算可及性参数（П）。25 以微波功率的平方根为自变量，绘制信号幅度的函数图像，并用以下方程进行拟合 27.
        吸收方程公式；光谱分析中的数学表达式。
        注意：在 A 是信号的幅度，用于衡量共振线饱和均匀性的指标（通常在0.5到1.5之间）， I 是一个缩放因子， P 是入射功率，而 表示一阶导数幅度为其未饱和值一半时所对应的数值。
  3. 计算 ΔP1/2 P 的差异1/2 存在时的值（O2 或 NiEDDA）以及缺失（用 N 灌注）2)顺磁性弛豫试剂。使用以下公式计算可及性参数（П）：
    静态平衡公式：Π = [(ΔP protein / ΔH protein) / (P reference / ΔH reference)]；方程
    注意：当 P1/2参考文献 和 ΔHo参考文献 分别为参比标准物（如 DPPH（2,2-二苯基-1-苦基肼））的半最大功率饱和值和中心线宽27.

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结果

自旋标记GLIC突变体的生化表征

按照上述方案操作，通常每升培养液可获得 10 - 12 mg 的 GLIC-MBP 融合蛋白。尽管该产量在不同突变体间可能存在差异，特别是对于蛋白内部埋藏位点的突变，产量可能会显著降低。在此类情况下，可能需要扩大培养体积。为操作方便，HRV3C 蛋白酶对融合蛋白的切割反应通常过夜（O/N）进行。通过 SDS-PAGE 凝胶电泳分析样品，我们发现该切割反应在 30 - 60 分钟内即可完成（图 1A）。经凝胶过滤层析纯化后，GLIC 主要以五聚体形式洗脱，保留体积为 11.3 ml；MBP 组分在 15 ml 处洗脱，聚集体在柱的空体积处洗脱（约 7.0 ml）。自旋标记物则在洗脱末期出现（约 24 ml）（图 1B）

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讨论

电子顺磁共振（EPR）波谱技术已被证明是在近天然环境中定量膜蛋白构象变化的一种无与伦比的结构研究方法。该方法使我们得以窥见蛋白质动态的分子细节，而这些细节在X射线晶体学和冷冻电子显微镜获得的高分辨率结构中往往被掩盖。然而，必须考虑该方法的技术局限性，这些局限性可能影响其在其他体系中的普遍适用性，同时也需注意实验过程中可能出现的潜在障碍。下文将讨论其中一些方面，并提供推荐的故障排除策略。

在涉及大量突变扰动的技术中，常见的问题之一是蛋白质产量低以及寡聚稳定性差。当研究对象为离子通道等复杂的多亚基膜蛋白时，这一问题尤为突出。因此，在开展大规模定点突变之前，优化蛋白质的这两个生化特性至关重要。我们发现，在 BL21 细菌的 C41 和 C43 菌株中，毒性 GLIC 突变体的表达耐受性更佳。3,36 此外，将诱导后的温度降低至 15 - 18 ºC，IPTG 浓度减少至 100 μM，并在诱导过程中添加 5% 甘油，似乎有助于降低蛋白质聚集，这可能是通过减缓蛋白质表达速率和减少错误折叠程度实现的。在某些位点（特别是在通透途径中）引入半胱氨酸突变已被证明会增加通道的组...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们非常感谢Chakrapani实验室现任和前任成员对本文手稿的仔细审阅和宝贵意见。 本研究得到了美国国立卫生研究院基金（1R01GM108921）、美国心脏协会（NCRP科学家发展基金12SDG12070069）以及SC的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
定点突变与半胱氨酸突变
10x PfuUltra HF 反应缓冲液Agilent Technologies600380-52
dNTPsNew England BioLabs Inc‎N0447L每种 dNTP 10 mM
pfu Ultra DNA 聚合酶Agilent Technologies600380-512.5 U/μL
DPNINew England BioLabs Inc‎R0176S20,000 U/mL
XL10 GOLDAgilent Technologies200314
SOC 培养基New England BioLabs Inc‎B9020S
卡那霉素Fisher ScientificBP905
LB 培养基Invitrogen127957084
质粒小提试剂盒QIAGEN27106
C43 感受态细胞Lucigen60446
表达与纯化
葡萄糖Fisher ScientificD16
胰蛋白胨Fisher BioreagentsBP1421-500
酵母提取物AmrescoJ850
甘油Fisher BioreagentsBP229
K2HPO4Amresco0705
K2HPO4Amresco0781
IPTG（异丙基硫代-β-半乳糖苷）Gold BiotechnologyI2481C25
Trizma BaseSigma Life ScienceT1503
NaClSigma-AldrichS7653
DNase ISigma Life ScienceDN25
PMSFAmrescoM145
亮抑蛋白酶肽AmrescoJ580
胃蛋白酶抑制剂AmrescoJ583
DDM（正十二烷基-β-D-麦芽糖苷）AnatraceD310S
直链淀粉树脂New England BioLabs Inc‎E8021L
TCEPAmrescoK831
EDTAFisher ScientificBP118
麦芽糖Acros Organics329915000
Superdex 200 GLGE Healthcare17-5175-01
空的聚丙烯层析柱BioRad731-1550
定点自旋标记
MTSL（1-氧基-2,2,5,5-四甲基-3-吡咯啉-3-甲基）甲烷硫代磺酸盐Toronto Research Chemicals IncO873900
(1-乙酰氧基-2,2,5,5-四甲基-Δ3-吡咯啉-3-甲基) 甲烷硫代磺酸盐Toronto Research Chemicals IncA167900
DMSOJ.T. Baker9224-01
重组
大豆磷脂酰胆碱脂质Avanti Polar Lipids Inc541602C
生物珠（聚苯乙烯珠）Bio Rad152-3920
甲醇Fisher chemicalsA413
FRET
荧光素马来酰亚胺ThermoFisher ScientificF-150
四甲基罗丹明马来酰亚胺ThermoFisher ScientificT-6027
POPCAvanti Polar Lipids Inc850457C
POPGAvanti Polar Lipids Inc840457C
E.coli 极性脂质提取物Avanti Polar Lipids Inc100600C
HEPESSigma Life ScienceH3375
EPR 测量
TPX 塑料毛细管BrukerER221
EDDA（乙二胺-N,N'-二乙酸）Aldrich158186
Ni(OH)2Aldrich283622

参考文献

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